本發(fā)明涉及有效分離提純糖基化磷脂酰乙醇胺的方法。

背景技術(shù)：

糖基化磷脂酰乙醇胺(amadoriphosphatidylethanolamine，amadori-pe)是食品或生物體中的磷脂酰乙醇胺和還原糖等化合物的醛酮基發(fā)生羰胺反應(yīng)而產(chǎn)生的一類潛在化學(xué)危害物。目前已見報道的研究表明，糖基化磷脂酰乙醇胺與糖尿病及其并發(fā)癥、衰老性功能障礙以及癌癥等疾病的發(fā)生存在相關(guān)性。糖基化磷脂酰乙醇胺的前體物質(zhì)——磷脂廣泛存在于日常膳食中。磷脂類食品在加工、儲藏過程中都可能引發(fā)糖基化磷脂酰乙醇胺的安全性問題。

制備獲得高純度的糖基化磷脂酰乙醇胺標準樣品是檢測糖基化脂類的關(guān)鍵技術(shù)前提。糖基化磷脂酰乙醇胺的制備主要是將糖基化磷脂酰乙醇胺和非糖基化磷脂酰乙醇胺進行分離，目前已見報道的關(guān)于糖基化磷脂酰乙醇胺的分離方法主要有液相色譜分離法和薄層色譜分離法。jeong-hooak等人(jeong-hooakkntm.syntheticallypreparedamadori-glycatedphosphatidylethanolaminecantriggerlipidperoxidationviafreeradicalreactions[j].febsj.2000,481:26-30.)將含有糖基化磷脂酰乙醇胺的樣品通過bondelut苯硼酸(pba)筒固相萃取柱，所得脂質(zhì)提取物再溶解于1ml甲醇-30％氫氧化銨(95:5，v:v)中，然后裝載在相同溶劑的pba平衡柱上。用另外3ml甲醇-30％氫氧化銨(95:5，v:v)進行洗脫，棄去洗脫液。再用5ml甲醇洗脫回收糖基化磷脂酰乙醇胺，并在相同條件下通過高效液相色譜柱進行純化。目前，該方法在糖基化磷脂酰乙醇胺的相關(guān)研究中被大量引用。但該方法前處理操作麻煩，且并未公開用高效液相色譜法檢測糖基化磷脂酰乙醇胺的檢測條件。utzmann等人(utzmanncm,lederermo.identificationandquantificationofaminophospholipid-linkedmaillardcompoundsinmodelsystemsandeggyolkproducts[j].journalofagriculturalandfoodchemistry.2000,48(4):1000-1008.)通過三氟甲磺酸酯、磷脂酰乙醇胺和1,8-二氮雜雙環(huán)制備異亞丙基-糖基化磷脂酰乙醇胺，再加入三氟酸-水轉(zhuǎn)化成糖基化磷脂酰乙醇胺產(chǎn)物。在高真空中除去溶劑，將殘余物溶于氯仿中，通過柱色譜用氯仿-甲醇-水(體積比95:35:5)進行洗脫純化，洗脫液通過薄層色譜柱進行檢測，0.1％(w/v)的2,7-二氯熒光素甲醇溶液作為噴霧試劑。再將試劑蒸發(fā)，殘余物溶解于甲醇中，通過膜過濾器，汽提出甲醇，高真空干燥得到糖基化磷脂酰乙醇胺。sookwong等人(sookwongp,nakagawak,fujitai,etal.amadori-glycatedphosphatidylethanolamine,apotentialmarkerforhyperglycemia,instreptozotocin-induceddiabeticrats[j].lipids.2011,46(10):943-952.)通過folch法分離提取糖基化反應(yīng)液中的脂溶性產(chǎn)物，再將萃取液蒸發(fā)至干，將殘余物溶解于10ml氯仿-甲醇(2:1，v:v)中，然后通過制備型反相柱用甲醇-5mm乙酸銨水溶液(99:1，v:v)進行分離洗脫，制得糖基化磷脂酰乙醇胺。

由于糖基化磷脂酰乙醇胺幾乎沒有紫外吸收特征，只利用液相色譜法很難檢測到糖基化磷脂酰乙醇胺的信號，分離提純效率低。使用薄層色譜法則需要加入熒光性衍生試劑進行表征，然后再除去熒光性試劑，操作麻煩，且可能造成糖基化磷脂酰乙醇胺的損失。本發(fā)明方法通過固相萃取提取樣品中的脂溶性產(chǎn)物，再通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測儀獲得糖基化磷脂酰乙醇胺的檢測信號，確定柱保留時間。通過收集固定柱保留時間通過的分離液，氮氣吹干后得到高純度的糖基化磷脂酰乙醇胺樣品。該方法操作快速，準確度高，制得糖基化磷脂酰乙醇胺的純度高于95％。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種有效分離提純糖基化磷脂酰乙醇胺的方法，本發(fā)明還提供了采用該方法分離提純后得到的糖基化磷脂酰乙醇胺。該方法操作快速，準確度高，得率高，樣品純度高。

為實現(xiàn)上述目的，所采取的技術(shù)方案：一種有效分離提純糖基化磷脂酰乙醇胺的方法，所述方法包括：

(1)將含有糖基化磷脂酰乙醇胺的樣品通過固相萃取柱進行分離，固相萃取柱分離所用的洗脫液為氯仿和甲醇的混合液，收集通過固相萃取柱的洗脫液；

(2)將步驟(1)收集的洗脫液干燥后用甲醇溶液復(fù)溶，然后將復(fù)溶后的溶解液采用液相色譜進行分離，液相色譜分離所用的洗脫液為水和甲醇的混合液，根據(jù)糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留時間收集通過液相色譜柱的洗脫液。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中氯仿和甲醇的混合液中氯仿與甲醇的體積比為2:8～4:6。

優(yōu)選地，所述步驟(1)中固相萃取柱為c18固相萃取柱。

優(yōu)選地，所述驟(1)中固相萃取柱分離所用的洗脫液的體積為樣品體積的0.5～10倍。

優(yōu)選地，所述驟(1)中固相萃取柱分離所用的洗脫液的體積為樣品體積的2～5倍。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中水和甲醇的混合液中水與甲醇的體積比為0:100～10:90。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中甲醇溶液是體積濃度為100％的甲醇溶液。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留時間是通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測定的。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留時間為5.0～6.0分鐘。

優(yōu)選地，所述步驟(2)中干燥是采用氮氣吹干的。

本發(fā)明提供了一種采用上述所述的方法分離提純后得到的糖基化磷脂酰乙醇胺。

本發(fā)明方法利用固相萃取柱進行粗提純，提純液用氮氣吹干后復(fù)溶，富集了樣品中的糖基化磷脂酰乙醇胺，再通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀獲得檢測信號確定糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留時間，根據(jù)糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留時間收集洗脫液，進行精提純。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)本發(fā)明通過固相萃取柱洗脫分離，去除樣品中大部分的極性成分，洗脫液經(jīng)過氮氣吹干后復(fù)溶，樣品中的糖基化磷脂酰乙醇胺得到富集，有利于提高糖基化磷脂酰乙醇胺的提取率；

(2)本發(fā)明通過液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀獲得糖基化磷脂酰乙醇胺的檢測信號，根據(jù)檢測信號確定糖基化磷脂酰乙醇胺的柱保留時間，避免糖基化磷脂酰乙醇胺弱紫外吸收性質(zhì)的影響，方法操作快速準確；

(3)本發(fā)明所得的糖基化磷脂酰乙醇胺產(chǎn)物純度高，可用作食品、生物和醫(yī)學(xué)的檢測標準品。

附圖說明

圖1為不同體積比的氯仿與甲醇提取液對糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺提取量的影響，圖中：1-1:50％甲醇；1-2:60％甲醇；1-3:80％甲醇；1-4：100％甲醇；

圖2為不同流動相比例時糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的hplc-ms/ms色譜圖，圖中：2-1:85％甲醇；2-2:90％甲醇；2-3:98％甲醇；2-4:100％甲醇；

圖3為本發(fā)明實施例3中純化后1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的液相色譜圖；

圖4為本發(fā)明實施例3中糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的一級質(zhì)譜圖；

圖5為本發(fā)明實施例3中糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的二級質(zhì)譜圖；

圖6為本發(fā)明實施例3中純化前1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的液相色譜圖。

具體實施方式

為更好的說明本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點，下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。

實施例1：不同體積比的氯仿與甲醇提取液對糖基化磷脂酰乙醇胺提取量的影響

以糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺為例，比較氯仿與甲醇體積比0:1～1:0范圍內(nèi)糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的提取量。結(jié)果如圖1所示，比較糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的色譜圖和選擇離子檢測模式下的峰面積可知，當氯仿：甲醇體積比大于1時，提取樣品液中含有更多非極性成分的干擾，較難分離得到糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺(如圖1中1-1,1-2所示)。當氯仿：甲醇體積比小于0.25時，發(fā)現(xiàn)選擇離子監(jiān)測模式下糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的積分峰面積很小，說明當氯仿：甲醇體積比小于0.25時，對樣品液中糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的提取率較低(如圖1中1-3,1-4所示)。因此，綜合考慮，氯仿與甲醇提取液的體積比為2:8～4:6。

實施例2：流動相對糖基化磷脂酰乙醇胺的峰形和保留時間影響顯著

磷脂酰乙醇胺的磷酸頭部基團發(fā)生糖化反應(yīng)后極性增強，本實驗以1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺為例，采用反相色譜分離的方法對樣品中的1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺和糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺進行分離和純化。不同流動相比例時糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的hplc-ms/ms色譜圖如圖2所示。實驗表明，在本實驗hplc-ms/ms檢測方法中，90％以下甲醇作為流動相時，糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺在色譜圖上幾乎沒有明顯的色譜峰。90％以上甲醇作為流動相可以分離非糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺和糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺。當100％甲醇作為流動相時，糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺在色譜圖上的響應(yīng)峰面積最大，但是色譜圖上有拖尾現(xiàn)象。98％甲醇作為流動相時，糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺在色譜圖上的峰形較好，但相應(yīng)峰面積偏小。綜合考慮，糖基化磷脂酰乙醇胺的流動相比例為水與甲醇的體積比為0:100～10:90。

實施例3：糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的分離提純

取5ml反應(yīng)完成的糖基化磷脂酰乙醇胺反應(yīng)溶液倒入已活化的c18固相萃取柱，緩慢加入10ml(2倍反應(yīng)液體積)體積比為2:8的氯仿-甲醇洗脫液進行洗脫分離；收集通過固相萃取柱的洗脫液，氮氣吹干后用3ml100％濃度的甲醇溶液復(fù)溶；

(2)取復(fù)溶液的上層澄清液進入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，色譜柱為venusilasbc18(5μm，4.6×150mm)，洗脫液為體積比0.1:99.9的水-甲醇溶液，流速0.5ml/min，色譜柱溫度25℃，獲得檢測信號，確定柱保留時間為5.0-6.0min，液相色譜圖如圖3和4所示，質(zhì)譜圖如5所示。不接質(zhì)譜檢測器，相同條件下，收集5.5-6.0min通過液相色譜柱的溶液，氮氣吹干得到純度97.0％的糖基化1,2-二棕櫚酰-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺樣品。

將反應(yīng)完成的糖基化磷脂酰乙醇胺反應(yīng)溶液直接通過液相色譜進行檢測，檢測條件與本實施例步驟(2)的色譜條件相同，結(jié)果如圖6所示。

將圖3與圖6對比發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過本發(fā)明方法的步驟(1)提純后樣品中糖基化磷脂酰乙醇胺的純度大幅度提高。

實施例4：糖基化1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的分離提純

取5ml反應(yīng)完成的糖基化1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺反應(yīng)溶液倒入已活化的c18固相萃取柱，緩慢加入15ml(3倍反應(yīng)液體積)體積比為3:7的氯仿-甲醇洗脫液進行洗脫分離；收集通過固相萃取柱的洗脫液，氮氣吹干后用3ml100％濃度的甲醇溶液復(fù)溶；

(2)取復(fù)溶液的上層澄清液進入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，色譜柱為venusilasbc18(5μm，4.6×150mm)，洗脫液為體積比10:90的水-甲醇溶液，流速0.5ml/min，色譜柱溫度30℃，獲得檢測信號，確定柱保留時間為5.0-6.0min。不接質(zhì)譜檢測器，相同條件下，收集5.3-5.8min通過液相色譜柱的溶液，氮氣吹干得到純度98.5％的糖基化1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺樣品。

實施例5：糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺的分離提純

取3ml反應(yīng)完成的糖基化1,2-二棕櫚酰基-sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺反應(yīng)溶液倒入已活化的c18固相萃取柱，緩慢加入15ml(5倍反應(yīng)液體積)體積比為4:6的氯仿-甲醇洗脫液進行洗脫分離；收集通過固相萃取柱的洗脫液，氮氣吹干后用3ml100％濃度的甲醇溶液復(fù)溶；

(2)取復(fù)溶液的上層澄清液進入液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀進行檢測，色譜柱為venusilasbc18(5μm，4.6×150mm)，洗脫液為體積比5:95的水-甲醇溶液，流速0.5ml/min，色譜柱溫度35℃，獲得檢測信號，確定柱保留時間為5.0-6.0min。不接質(zhì)譜檢測器，相同條件下，收集5.3-5.6min通過液相色譜柱的溶液，氮氣吹干得到純度97.5％的糖基化1,2-二棕櫚?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺樣品。

最后所應(yīng)當說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對本發(fā)明保護范圍的限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明作了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實質(zhì)和范圍。