專(zhuān)利名稱(chēng)：賴(lài)氨酸化合物和其在肽和蛋白質(zhì)的位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肽和蛋白質(zhì)的位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾。特別是，本發(fā)明提供了可以用作所述肽和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元(building block)的新的硫代賴(lài)氨酸和硒代賴(lài)氨酸化合物。因此所包括的賴(lài)氨酸殘基隨后可以用作與功能物質(zhì)綴合的靶位點(diǎn)，然后通常將所述功能物質(zhì)轉(zhuǎn)移到硫代或硒代賴(lài)氨酸殘基的ε或α胺中。本發(fā)明還涉及對(duì)選定的肽或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾的這些方法，以及在這些方法的各自步驟中所獲得的中間物和終產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)的共價(jià)位點(diǎn)特異性修飾是生物系統(tǒng)的關(guān)鍵過(guò)程。在包括蛋白質(zhì)定位和運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)以及靶向蛋白質(zhì)破壞在內(nèi)的細(xì)胞過(guò)程中，酶促修飾(如磷酸化、 糖基化、硫酸化、乙?；?、甲基化、泛素化、異戊烯化、SUMO化(sumoylation)、類(lèi)泛素化 (neddylation))發(fā)揮決定性作用。在蛋白質(zhì)表面再現(xiàn)天然修飾對(duì)于研究它們的功能具有無(wú)法估量的價(jià)值。已經(jīng)證明，位點(diǎn)特異性共價(jià)添加至蛋白質(zhì)和肽的“非天然”部分，如熒光團(tuán)、親和標(biāo)記、自旋標(biāo)記探針、放射性標(biāo)記和其他(生物正交)官能團(tuán)，可用于體內(nèi)和體外的多種應(yīng)用和過(guò)程。隨著在生物相容合成有機(jī)化學(xué)中的進(jìn)展，已經(jīng)展開(kāi)充滿機(jī)會(huì)的全新的領(lǐng)域，從而為連接組分的類(lèi)型以及連接反應(yīng)的選擇提供高度多樣性?；瘜W(xué)連接涉及第一化學(xué)組分與第二化學(xué)組分的化學(xué)選擇性共價(jià)連接?？梢允褂么嬖谟诘鞍踪|(zhì)或肽以及第二連接組分上的獨(dú)特的相互反應(yīng)性官能團(tuán)來(lái)使連接反應(yīng)具有化學(xué)選擇性。然而，由于存在于典型蛋白質(zhì)中的官能度的種類(lèi)和數(shù)量，研發(fā)選擇性修飾蛋白質(zhì)或肽的有效方法仍然是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。通常期望或需要位點(diǎn)特異性地修飾蛋白質(zhì)，以使綴合的官能度與蛋白質(zhì)或肽的固有屬性進(jìn)行最佳組合。因此，為了以受控的選擇性方式使用此類(lèi)修飾蛋白質(zhì)，經(jīng)常需要獨(dú)特的、生物正交的化學(xué)柄(handle)或連接位點(diǎn)，用于將期望的分子與其連接或綴合。大多數(shù)產(chǎn)生生物綴合物的方法利用蛋白質(zhì)表面上的胺(賴(lài)氨酸側(cè)鏈和N末端)或硫醇(半胱氨酸側(cè)鏈)的親核性。對(duì)于蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性修飾，已經(jīng)提出了許多方法，包括設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的所有賴(lài)氨酸殘基被置換的突變體或設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)除一個(gè)外的所有半胱氨酸殘基被置換的突變體，以便將修飾位點(diǎn)限制為單個(gè)位置。激活的酸，如N-羥基琥珀酰亞胺酯，可以用于靶向胺；然而，蛋白質(zhì)通常含有多個(gè)胺，甚至與賴(lài)氨酸側(cè)鏈相比，蛋白質(zhì)的氨基末端的PKa降低，這種標(biāo)記通常是非特異性的。為了克服這一問(wèn)題，研究人員已經(jīng)研發(fā)除去所有表面賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)靶。研究人員對(duì)腫瘤壞死因子-a (TNF-α)進(jìn)行噬菌體展示選擇來(lái)研發(fā)無(wú)任何賴(lài)氨酸的蛋白質(zhì)，從而使得N末端剩余的單個(gè)胺位點(diǎn)特異性聚乙二醇化(PEGylation)。與隨機(jī)標(biāo)記的野生型TNF-α相比，研發(fā)的僅在N末端具有修飾的TNF-α的穩(wěn)定性和生物活性獲得改善。通常，在幾乎所有位點(diǎn)置換給定類(lèi)型的氨基酸的大規(guī)模氨基酸取代與蛋白質(zhì)活性減少的缺陷有關(guān)。半胱氨酸標(biāo)記通常比胺標(biāo)記更具特異性，因?yàn)榱虼蓟哂H核性，且可以通過(guò)定點(diǎn)誘變引入單個(gè)半胱氨酸而不影響蛋白質(zhì)的功能。用小分子連接的馬來(lái)酰亞胺、α-鹵代酮或優(yōu)先與硫醇反應(yīng)的其他親電子基團(tuán)標(biāo)記通過(guò)誘變引入的半胱氨酸。然而，單獨(dú)的基于半胱氨酸的方法不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行多重修飾(如引入用于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)分析的兩個(gè)熒光團(tuán))，除非當(dāng)兩個(gè)半胱氨酸的反應(yīng)性非常不同，且并不是所有的蛋白質(zhì)靶標(biāo)都允許引入半胱氨酸而不削弱功能。靶向存在于天然氨基酸額外的官能度的其他方法被認(rèn)為有益地豐富了化學(xué)家進(jìn)行蛋白質(zhì)修飾的工具箱。Francis 和合作者(J. Am. Chem. Soc. 2004，126，10256)已經(jīng)確定了特異性靴向色氨酸和酪氨酸殘基的反應(yīng)。利用銠卡賓體(rhodium carbenoid)可以實(shí)現(xiàn)色氨酸中吲哚官能度的修飾(在N-I或C-2處)。當(dāng)應(yīng)用于肌球蛋白或枯草桿菌蛋白酶(subtilising) Carlsberg (分別具有2個(gè)和1個(gè)色氨酸)時(shí)，修飾無(wú)一例外地以約50-60%的產(chǎn)率發(fā)生在色氨酸殘基處。盡管該系統(tǒng)需要助溶劑來(lái)使有機(jī)試劑溶解，但是預(yù)期該助溶劑(乙二醇) 不使蛋白質(zhì)靶變性。更顯著的化學(xué)限制是需要使大多數(shù)蛋白質(zhì)變性以及使肌球蛋白的血紅素基丟失的非常低(1.5-3.5)的pH。盡管重建肌球蛋白的方法可能恢復(fù)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但是這些極端的條件會(huì)與許多靶標(biāo)不相容。然而，結(jié)果確實(shí)表明，過(guò)渡金屬?gòu)?fù)合物可以用于蛋白質(zhì)中芳族殘基的特異性生物綴合。Francis 和合作者(J. Am. Chem. Soc. 2004，126，15942)還描述了利用 ρΗ6· 5 的醛和苯胺選擇性靶向酪氨酸的Mannich類(lèi)型反應(yīng)(Mannich_type reaction)。通過(guò)將熒光團(tuán)連接于苯胺，實(shí)現(xiàn)了羅丹明與胰凝乳蛋白酶原A的綴合而不改變蛋白質(zhì)的活性。不同酪氨酸的相對(duì)表面可及性允許對(duì)特定酪氨酸殘基的選擇性；對(duì)于胰凝乳蛋白酶原A而言，優(yōu)先靶向三個(gè)表面酪氨酸中的一個(gè)。一些策略利用非天然存在的官能團(tuán)。這類(lèi)氨基酸可以通過(guò)包括全合成、通過(guò)連接合成片段和生物表達(dá)片段的半合成、轉(zhuǎn)移反應(yīng)等的方法引入。這些非天然存在的功能性生物正交基團(tuán)的存在，使得可能單獨(dú)靶向而無(wú)與天然存在的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的非有意的交叉連接或其他反應(yīng)。一個(gè)實(shí)例包括在蛋白質(zhì)中可控地引入疊氮化物作為生物正交連接柄。已經(jīng)證明可用于這方面的反應(yīng)是Siarpless改良的炔和疊氮化物的Huisgen環(huán)化。在催化量的Cu(I) 的存在下，該環(huán)化化學(xué)選擇性地發(fā)生，產(chǎn)生1，4_ 二取代三唑環(huán)。對(duì)于炔和疊氮化物而言，未觀察到與常見(jiàn)生物學(xué)官能團(tuán)的交叉反應(yīng)性，并且這兩種基團(tuán)在生物學(xué)條件下都是穩(wěn)定的。 該反應(yīng)已用于范圍從細(xì)胞表面病毒顆粒和蛋白質(zhì)的修飾到小分子活性探針標(biāo)記的碳水化合物結(jié)合蛋白和細(xì)胞蛋白質(zhì)鑒定的應(yīng)用。根據(jù)上述顯而易見(jiàn)的是，盡管對(duì)選擇性修飾的蛋白質(zhì)有特別的興趣，但是當(dāng)前可用的每種技術(shù)都受累于具體的弊端。除了所述技術(shù)之外，通常非常缺乏可用且靈活的方法。 因此，仍然需要提供選擇性(生物正交)連接柄的其他化學(xué)策略，以便補(bǔ)充或擴(kuò)展來(lái)自生物學(xué)的方法。本發(fā)明的目的就是提供這樣的策略。發(fā)明概述本發(fā)明提供了新的通?？蓱?yīng)用的對(duì)肽和蛋白質(zhì)進(jìn)行位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾的方法，其特別快速、靈活和經(jīng)濟(jì)。根據(jù)本發(fā)明，使用某些新的賴(lài)氨酸化合物作為蛋白質(zhì)或肽合成中的結(jié)構(gòu)單元，從而為位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾提供特異性連接柄。具體地，對(duì)于肽或蛋白質(zhì)的位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾，本發(fā)明需要使用特定的硫代賴(lài)氨酸和硒代賴(lài)氨酸化合物，特別是化合物5-硫代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為δ -硫代賴(lài)氨酸)和4-硫代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為Y -硫代賴(lài)氨酸)以及5-硒代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為δ -硒代賴(lài)氨酸)和4-硒代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為Y-硒代賴(lài)氨酸)。本發(fā)明的賴(lài)氨酸化合物非常容易地由商購(gòu)可獲得的結(jié)構(gòu)單元以高產(chǎn)率合成，如本文所述，這涉及數(shù)量相對(duì)較少的合成步驟。本發(fā)明賴(lài)氨酸化合物的設(shè)計(jì)具有兩個(gè)重要的特征。首先，硫醇或硒醇基在各碳的定位允許發(fā)生非常有效的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移反應(yīng)。其次，硫醇或硒醇基可以隨后利用報(bào)道的方法除去，由此恢復(fù)天然賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)，或所述硫醇或硒醇基可以用作額外的綴合柄。所述方法快速，且產(chǎn)生定義明確的物質(zhì)。硫醇或硒醇?xì)埢谫?lài)氨酸的ε-胺，或者如果適用，α-胺附近的存在允許非常有利的S向N或Se向N的酯交換反應(yīng)，由此將通過(guò)硫代或硒代酯化引入肽或蛋白質(zhì)的選定的功能物質(zhì)轉(zhuǎn)移到所述ε _胺或α-胺。如實(shí)施例中更詳細(xì)解釋的，本發(fā)明人已經(jīng)證明了本發(fā)明賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)單元在選定的肽靶標(biāo)的泛素化中的應(yīng)用。通過(guò)使用El介導(dǎo)的全長(zhǎng)泛素硫酯的合成和新研發(fā)的氨基酸 5-硫代賴(lài)氨酸，本發(fā)明人基于H2B、PCNA、PTEN和p53證明了選定的靶肽中賴(lài)氨酸殘基的位點(diǎn)特異性泛素化。該方法也容易地適應(yīng)其他功能物質(zhì)或配體。在連接后，溫和脫硫條件的使用不影響存在于肽或蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)單元或選定的功能物質(zhì)的功能完整性?？傊景l(fā)明涉及某些賴(lài)氨酸化合物、合成它們的方法以及其作為結(jié)構(gòu)單元在蛋白質(zhì)或肽合成中的用途，通常作為用于對(duì)多肽或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾的生物正交靶。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的賴(lài)氨酸化合物合成和修飾選定的蛋白質(zhì)或肽序列的方法。此外，本發(fā)明涉及在此類(lèi)方法中獲得的中間物和終產(chǎn)物。所附權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的這些和其他方面，會(huì)在下文的描述和實(shí)施例中有更詳細(xì)的描述和舉例說(shuō)明。發(fā)明詳述本發(fā)明的第一方面涉及式(Ia)或(Ib)所示的賴(lài)氨酸化合物或所述賴(lài)氨酸化合物的酯、鹽、溶劑化物或水合物
權(quán)利要求
1.式(Ia)或(Ib)所示的賴(lài)氨酸化合物或所述賴(lài)氨酸化合物的酯、鹽、溶劑化物或水合物
2.權(quán)利要求1的賴(lài)氨酸化合物或其酯、鹽、溶劑化物或水合物，其中X表示硫。
3.式(IIa)或(IIb)所示的非天然存在的肽
4.權(quán)利要求3的非天然存在的肽，其中所述配體是選自以下的功能物質(zhì)染料、探針、 標(biāo)記、標(biāo)簽、溶解性修飾劑、酶靶標(biāo)、受體配體、免疫調(diào)節(jié)劑、輔因子和交聯(lián)劑。
5.權(quán)利要求3或4的非天然存在的肽，其中選擇R2和R4使得它們包括天然存在的多肽或蛋白質(zhì)或其功能變體或片段的全部氨基酸序列的互補(bǔ)部分。
6.權(quán)利要求3或4中任一項(xiàng)的非天然存在的肽，其中選擇R2和R4使得它們表示C— N 和N — C多肽部分，所述C — N和N — C多肽部分位于天然存在的多肽或蛋白質(zhì)或其功能變體或片段的氨基酸序列中選定的單個(gè)氨基酸殘基的側(cè)翼，所述選定的單個(gè)氨基酸殘基優(yōu)選為賴(lài)氨酸殘基。
7.權(quán)利要求3或4所定義的式(IIb)的非天然存在的肽，其中-R4表示多肽鏈且-R2表示-P2或氫。
8.權(quán)利要求3-6中任一項(xiàng)所述的非天然存在的肽，其用作治療劑或診斷劑。
9.對(duì)選定的多肽或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾的方法，包括i)合成或產(chǎn)生所述選定的多肽或蛋白質(zhì)序列，其中將至少一個(gè)式(Ia)或(Ib)的賴(lài)氨酸化合物通過(guò)添加或取代摻入所述選定的序列，其中-P3表示氫或權(quán)利要求1所定義的保護(hù)基；ii)在所述賴(lài)氨酸化合物殘基除去-P3所示基團(tuán)，并綴合式-R5或_C(= 0)-R5'所示基團(tuán)；其中-R5和_C( = 0)-R5’具有與有關(guān)式(IIa-IIc)所定義的相同的含義，所述賴(lài)氨酸化合物的殘基位于硫或硒原子處。
10.權(quán)利要求9的方法，其中將-c(= 0)-R5’部分綴合于所述賴(lài)氨酸化合物的殘基， 從而取代基團(tuán)-P3以產(chǎn)生相應(yīng)的硫代-或硒代酯，且所述方法包括隨后步驟iii)所述式-C( = 0)-R5’所示的基團(tuán)分子內(nèi)轉(zhuǎn)移至-ε胺基。
11.權(quán)利要求9或10的方法，其中所述選定的多肽或蛋白質(zhì)序列的產(chǎn)生包括使用正交 tRNA/氨?；?tRNA合成酶對(duì)摻入所述賴(lài)氨酸化合物，其中響應(yīng)于包含在編碼所述選定序列的基因中的無(wú)義密碼子或4堿基密碼子而摻入所述賴(lài)氨酸化合物。
12.權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)的方法，其中所述選定的多肽或蛋白質(zhì)序列是天然存在的多肽或蛋白質(zhì)或其功能變體或片段。
13.權(quán)利要求9-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述選擇性修飾包括泛素化或構(gòu)成泛素化。
14.合成權(quán)利要求1所定義的賴(lài)氨酸化合物的方法，所述方法包括以下步驟(ia)用有機(jī)硼烷化合物處理4-羥基賴(lài)氨酸或5-羥基賴(lài)氨酸化合物以獲得氨基酸被保護(hù)的化合物，隨后使所述氨基酸被保護(hù)的化合物與胺保護(hù)基反應(yīng)，產(chǎn)生被保護(hù)的4-羥基賴(lài)氨酸或5-羥基賴(lài)氨酸；或(ib)用有機(jī)硼烷化合物處理4-氯賴(lài)氨酸、5-氯賴(lài)氨酸、4-溴賴(lài)氨酸或5-溴賴(lài)氨酸以獲得氨基酸被保護(hù)的化合物，隨后使所述氨基酸被保護(hù)的化合物與胺保護(hù)基反應(yīng)，產(chǎn)生被保護(hù)的4-氯賴(lài)氨酸、5-氯賴(lài)氨酸、4-溴賴(lài)氨酸或5-溴賴(lài)氨酸；(iia)甲磺酰化步驟(ia)所獲得的化合物，并隨后使其與合適的硫代羧酸或硒代羧酸或其鹽反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)的硫代或硒代酯；或(iib)使步驟(ib)所獲得的化合物與合適的硫代羧酸或硒代羧酸或其鹽反應(yīng)以產(chǎn)生相應(yīng)的硫代或硒代酯；(iii)用堿金屬氫氧化物的水溶液水解步驟(iia)或(iib)所獲得的硫代或硒代酯， 產(chǎn)生硫醇或硒醇化合物，隨后使所述硫醇或硒醇化合物與能將權(quán)利要求1所定義的基團(tuán)-P3 轉(zhuǎn)移到所述硫醇或硒醇基團(tuán)的物質(zhì)反應(yīng)；以及(iv)除去所述氨基酸保護(hù)有機(jī)硼烷基團(tuán)，并任選地隨后使所述化合物與胺保護(hù)劑反應(yīng)，以產(chǎn)生上文所定義的式(Ia)或(Ib)的化合物。
15.權(quán)利要求1-2中任一項(xiàng)所述的賴(lài)氨酸化合物作為結(jié)構(gòu)單元在選定的肽或蛋白質(zhì)的合成中為對(duì)所述選定的多肽或蛋白質(zhì)序列進(jìn)行位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾提供連接柄的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的硫代賴(lài)氨酸和硒代賴(lài)氨酸化合物，其可以用作肽和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)單元，為所述肽和蛋白質(zhì)的位點(diǎn)選擇性和化學(xué)選擇性修飾提供連接柄。具體地，本發(fā)明提供了化合物5-硫代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為δ-硫代賴(lài)氨酸)、4-硫代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為γ-硫代賴(lài)氨酸)、5-硒代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為δ-硒代賴(lài)氨酸)和4-硒代賴(lài)氨酸(也稱(chēng)為γ-硒代賴(lài)氨酸)(的用途)。硫醇或硒醇基團(tuán)在各碳原子上的定位允許在與選定的配體綴合之后發(fā)生非常有效的分子內(nèi)轉(zhuǎn)移反應(yīng)，隨后可以利用報(bào)道的方法除去硫醇或硒醇，由此恢復(fù)天然賴(lài)氨酸結(jié)構(gòu)，或所述硫醇或硒醇可以用作額外的綴合柄。所述方法快速且產(chǎn)生定義明確的物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K31/198GK102459160SQ201080031860
公開(kāi)日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年5月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者F·埃爾瓦利德, H·奧瓦 申請(qǐng)人:荷蘭癌癥研究所基金會(huì)