一種海洋肽類化合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種海洋肽類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 放線菌是一類最重要的藥源微生物。100年來，放線菌資源的研究和開發(fā)利用取得 了極其輝煌的成就。從放線菌發(fā)現(xiàn)的生物活性物質(zhì)大約有12000種，占整個(gè)天然生物活性 物質(zhì)的50%左右，其中從鏈霉菌一個(gè)屬就發(fā)現(xiàn)近萬種。目前臨床和農(nóng)業(yè)上使用的150多種 抗生素中，有100至120種是由放線菌產(chǎn)生的。（文獻(xiàn)l:Jdinos B6rdy. Bioactive microbial metabolites, a personal review. J Antibiot. 2005, 58 (1):1-26.)
[0003] 海洋生態(tài)環(huán)境的特殊性造就了巨大的生物多樣性和獨(dú)特的化學(xué)多樣性，由此而形 成的次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜獨(dú)特的結(jié)構(gòu)及其特異高效的活性，使得海洋生物資源已成為創(chuàng)新藥 物發(fā)現(xiàn)的重要源泉，海洋已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)新種甚至新屬微生物的重要場(chǎng)所，并且是新穎生物 活性物質(zhì)的新來源。美國(guó)哥倫比亞大學(xué)斯克里普斯海洋研究所海洋生物技術(shù)與生物藥物研 究中心的Fenicial等2005年報(bào)道了第一株專性海洋放線菌，為一個(gè)新屬Salinispora屬。 同時(shí)，對(duì)100多株Salinispora屬的放線菌進(jìn)行了生物活性評(píng)估，發(fā)現(xiàn)80%具有抑制人體 腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)的作用，35%對(duì)人類病原體耐藥菌具有抑制作用。并成功的從S.tropica CNB-392的發(fā)酵液中分離到了一個(gè)新穎結(jié)構(gòu)的潛在的抗腫瘤藥物salinisporamideA。 salinisporamideA與蛋白酶抑制劑omuralide結(jié)構(gòu)相似，但是抑制20S蛋白酶的活性是 后者的35倍（IC5(]= 1.3nM)，目前已經(jīng)作為抗多發(fā)性骨髓瘤藥物進(jìn)入I期臨床階段（文 獻(xiàn) 2 :Fenical,W. &Jensen,P.R.Developinganewresourcefordrugdiscovery:marine actinomycetebacteria.Nat.Chem.Biol. 2006 (2) : 666-673.)。因此，海洋放線菌是新穎的 活性先導(dǎo)化合物的新的重要來源。
[0004] 二酮哌嗪類化合物（DKPs)的基本結(jié)構(gòu)是由兩個(gè)氨基酸縮合而成的環(huán)二肽， 因其骨架具有穩(wěn)定的六元環(huán)結(jié)構(gòu)，且有兩個(gè)氫鍵給體和兩個(gè)氫鍵受體，使得DKPs具有 廣泛而顯著的生物活性和藥理活性，如：抗腫瘤、抗病毒、抗真菌、抗菌及抗心律失常、 抗高血壓等，在藥物化學(xué)中成為一個(gè)重要的藥效團(tuán)。（文獻(xiàn)3 :C.Cornacchia,etal.， 2, 5-Diketopiperazinesasneuroprotectiveagents,Mini-ReviewsinMedicinal Chemistry，2012, 12 (1) : 1-11)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種海洋放線菌來源的肽類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0007] -種海洋環(huán)肽類化合物，有如下化學(xué)結(jié)構(gòu)，如式1 :
[0008]
[0009] 其制備方法如下：
[0010] 1)將海洋鏈霉菌Str印tomycessp. 223劃線接種于M2+固體培養(yǎng)基上，28~35°C 培養(yǎng)3~4d，直至長(zhǎng)出白色的孢子；
[0011] 2)取步驟1)中所述白色孢子絲到400液體培養(yǎng)基，28~35°C溫度下進(jìn)行搖床培 養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為90~220r/min，培養(yǎng)4~8d收獲發(fā)酵產(chǎn)物；
[0012] 3)將步驟2)中發(fā)酵產(chǎn)物過濾，發(fā)酵液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附，甲醇洗脫，收集洗脫 液，濃縮后直接用乙酸乙酯萃取3次，收集的菌絲體用乙酸乙酯萃取3次，合并以上乙酸乙 酯浸提液，濃縮蒸干，即得膏狀粗提物；
[0013] 4)取步驟3)中的粗提物進(jìn)行硅膠柱層析，用有機(jī)溶劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫 液，洗脫液經(jīng)薄層層析檢測(cè)；
[0014] 5)收集步驟4)中以洗脫液體積比98:2梯度的洗脫組分，將收集的洗脫組分進(jìn)行 凝膠柱層析、硅膠柱層析和制備型薄層層析分離純化，收集Rf值為〇. 2~0. 3的組分，即得 肽類化合物1。
[0015] 步驟1)中的M2+固體培養(yǎng)基組成為每升含麥芽浸粉10g，酵母浸粉4g，葡萄糖4g， 海水500mL，去離子水500mL，瓊脂15g，pH值7. 8。步驟2)中所述400液體培養(yǎng)基組成為 每升含葡萄糖l〇g，蛋白胨3g，牛肉浸膏3g，酵母浸提物5g，可溶性淀粉20g，CaC033g，海水 500mL，去離子水500mL，pH值7. 8。步驟3)中所述大孔吸附樹脂為AmberbliteXAD16聚 苯乙烯型大孔吸附樹脂。步驟4)中的有機(jī)溶劑為二氯甲烷-甲醇。步驟5)所述凝膠柱層 析洗脫液為甲醇；硅膠柱層析洗脫液為水和甲醇體積百分比為100/0~0/100。步驟5)所 述凝膠柱層析時(shí)收集經(jīng)TLC檢測(cè)為深褐色斑點(diǎn)的組分；硅膠柱層析時(shí)收集水和甲醇體積百 分比為60/40的洗脫液；制備型薄層層析展開劑為體積比98/2的二氯甲烷-甲醇。
[0016] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 1.本發(fā)明充分利用尚未深入開發(fā)的豐富的海洋放線菌資源，本發(fā)明化合物是一個(gè) 海洋來源的新穎肽類化合物。
[0018] 2.本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，在1. 66mM時(shí)，對(duì)人肝癌細(xì)胞株SMCC7721和人結(jié) 腸癌細(xì)胞Colon38的抑制率分別為97. 5%和98. 75%，為臨床提供了新型藥物或先導(dǎo)化合 物。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。
[0020] 實(shí)施例一
[0021] 如1所示的環(huán)二肽類化合物的制備方法：
[0022] 從煙臺(tái)萊州灣采集海泥樣品，在實(shí)驗(yàn)室利用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，通過梯度稀釋培養(yǎng) 法純化到一株鏈霉菌Streptomyces sp.223。所述高氏一號(hào)培養(yǎng)基組成為每升含可溶性淀 粉 2.0g，MgS04·7Η200· 05g，Κ2ΗΡ040· 05g，ΚΝ030· lg，F(xiàn)eS04·7Η200· 001g，瓊脂粉15g，海水 500mL，去離子水500mL，調(diào)整pH值為7·8。
[0023]將菌株Streptomyces sp. 223劃線接種于Μ2+固體培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)3d，直 到長(zhǎng)出白色孢子；取8-10mm2大小的菌苔2塊接入已滅菌的裝有200mL M22培養(yǎng)基的1000mL 三角瓶中，共計(jì)20L，28°C，以180r/min轉(zhuǎn)速，搖床培養(yǎng)6d，收集發(fā)酵產(chǎn)物。
[0024] 發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)過濾