專(zhuān)利名稱(chēng)：通過(guò)超量表達(dá)comA基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)超量表達(dá)C—基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌OfeCiBm ·5油ii/is)是目前公認(rèn)的安全微生物之一，其抗菌代謝產(chǎn)物豐富多樣，尤其是脂肽類(lèi)抗菌物質(zhì)，不僅抗菌譜廣而且還具有生物表面活性劑的功能，因此不僅可以在農(nóng)業(yè)上用于進(jìn)行生物防治，而且在工業(yè)和環(huán)境保護(hù)上也有著廣泛的應(yīng)用?？莶菅挎邨U菌(feci/^Assubtil is) ATCC 9943 是一種可以分泌 surfactin， fengycin等抗菌月太物質(zhì)的枯草芽孢桿菌(Val6rie Leclere, Romain Marti, Max Bechet. The lipopeptides mycosubtilin and surfactin enhance spreading of Bacillus subtilis strains by their surface-active properties. Arch Microbiol. (2006) 186: 475-483)。其中，surfactin作為一種生物表面活性劑，與化學(xué)表面活性劑相比，其具有擁有生物降解能力，低毒，結(jié)構(gòu)豐富的優(yōu)點(diǎn)，隨著對(duì)工業(yè)原料的環(huán)境適應(yīng)性要求的提高， 其應(yīng)用于環(huán)境保護(hù)，石油開(kāi)采方面潛力將會(huì)越來(lái)越大。但實(shí)際中，其并未在工業(yè)以及環(huán)境保護(hù)中廣泛應(yīng)用，究其原因，是因?yàn)樗a(chǎn)成本巨大，所以提高其產(chǎn)量便成為降低其生產(chǎn)成本的核心問(wèn)題。目前，世界范圍內(nèi)，提高其產(chǎn)量的方法主要是篩選優(yōu)良菌株，以及優(yōu)化發(fā)酵條件， 而很少采用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌種進(jìn)行改良的方法來(lái)提高其產(chǎn)抗菌物質(zhì)的產(chǎn)量。但隨著對(duì)抗菌肽合成分泌研究的日益深入，已經(jīng)逐漸開(kāi)始采用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)改造其合成分泌中信號(hào)通路等方法來(lái)對(duì)原始菌種進(jìn)行基因改良，從而提高其自身合成分泌抗菌肽能力。co—基因(Gene ID: 126362990)，其表達(dá)產(chǎn)物枯草桿菌感受態(tài)因子ComA是枯草桿菌中十分重要的調(diào)控蛋白之一，在枯草芽孢桿菌各種生理代謝過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，相關(guān)研究表明，ComA蛋白可以與surfactin合成酶基因啟動(dòng)子結(jié)合從而刺激其表達(dá)。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC 9943為出發(fā)菌株，以枯草桿菌整合載體pDK為骨架構(gòu)建一個(gè)基因整合載體pDK-ComA，利用同源重組原理，通過(guò)雙交換過(guò)程將comA基因整合到枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組中使其超量表達(dá)的方法構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)抗菌肽菌株 FMB 27。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題
本發(fā)明的目的是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建comA超量表達(dá)載體，經(jīng)過(guò)電轉(zhuǎn)化通過(guò)同源重組將Pspac-comA基因整合入枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組a 對(duì)位點(diǎn)，從而構(gòu)建一種高產(chǎn)抗菌肽的枯草芽孢桿菌菌株FMB 27。技術(shù)方案
1、通過(guò)超量表達(dá)C—基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于 (1) comA基因超量表達(dá)載體PDK-ComA的構(gòu)建
3根據(jù)紅霉素抗性基因設(shè)計(jì)引物EM-F和EM-R，以pMUTIM質(zhì)粒DNA為模板PCR擴(kuò)增紅霉素抗性基因，獲得850 bp基因片段；根據(jù)枯草芽孢桿菌基因設(shè)計(jì)引物ComA-F和 ComA-R，以枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增co—基因，獲得645 bp基因片段；擴(kuò)增得到的兩個(gè)基因分別克隆至PMD19-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(federidia coli) DH5a,經(jīng)驗(yàn)證、測(cè)序正確后，分別命名為pZI-T、pComA-T,于_20°C條件下保存?zhèn)溆茫?br> 權(quán)利要求
1.通過(guò)超量表達(dá)C—基因提高枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，其特征在于 U) comA基因整合載體pDK-ComA的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物EM-F和EM-R，以pMUTIM質(zhì)粒DNA為模板PCR擴(kuò)增紅霉素抗性基因漲，獲得 850 bp基因片段；設(shè)計(jì)引物ComA-F和ComA-R，以枯草芽孢桿菌ATCC 9943基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增comA基因，獲得645 bp基因片段；擴(kuò)增得到的兩個(gè)基因分別克隆至pMD19_T 載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌(fecAericAia co7i)DH5a,經(jīng)驗(yàn)證、測(cè)序正確后，分別命名為pEM_T、 pComA-T,于_20°C條件下保存?zhèn)溆?；名稱(chēng)序列酶切位點(diǎn)ComA-F5 ‘ CCGGAATTCATGACCAGTCAGTCAATAMAAATG3‘EcoRIComA-R5 ‘ GCGGGATCCTTACTCTTCTTCCGTTCCCGG3‘BamHIEM-F5 ‘ CGATACGTATGATAGGTGGTATGTTTTCGC3‘SnaBIEM-R5 ‘ AAMGTACTCATGTGTACATTCCTCTCTT3 ‘SacIPDK用snaBI/Sall雙酶切后獲得的大片段，與經(jīng)過(guò)相同雙酶切處理的pMUTIM載體后獲得的包括Pspac啟動(dòng)子和多克隆位點(diǎn)MCS的片段，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pDK-Pspac 載體，酶切驗(yàn)證正確后于-20°C條件下保存?zhèn)溆?；pDK-Pspac用SrmBI/sacl雙酶切后獲得的大片段，與經(jīng)過(guò)相同雙酶切處理的pEM_T載體后獲得的漲基因片段，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建pDK-Pspac-EM載體，酶切驗(yàn)證正確后于-20°C條件下保存?zhèn)溆?；pComA-T用BamHI/EcoRI酶切后獲得comA片段，與經(jīng)過(guò)相同酶切處理的pDK-Pspac-EM 載體，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建comA基因超量表達(dá)載體pDK-ComA，酶切驗(yàn)證正確后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，用于下一步轉(zhuǎn)化； (2) FMB 27突變菌株的構(gòu)建以枯草芽孢桿菌ATCC 9943制備感受態(tài)細(xì)胞，采用電轉(zhuǎn)化方法，將獲得的基因超量表達(dá)載體pDK-ComA轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌ATCC 9943，在基因組_yE位點(diǎn)發(fā)生雙交換，紅霉素平板上篩選得到紅霉素抗性菌株，命名為FMB 27 ；該菌株的amyE基因被/^pac-Cb— 基因所取代，成為超量表達(dá)基因的突變菌株，即為所得到的菌株。
2.權(quán)利要求1所述方法獲得的超量表達(dá)基因菌株FMB27。
3.權(quán)利要求2所述超量表達(dá)基因菌株FMB27在生產(chǎn)枯草芽孢桿菌抗菌肽中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述超量表達(dá)基因菌株FMB27生產(chǎn)的枯草芽孢桿菌抗菌肽產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過(guò)超量表達(dá)comA基因提高枯草桿菌抗菌肽產(chǎn)量的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本方法首先以枯草芽孢桿菌ATCC9943為出發(fā)菌株，以整合載體pDK為骨架構(gòu)建一個(gè)基因超量表達(dá)載體pDK-ComA，利用同源重組原理，通過(guò)雙交換過(guò)程將comA基因整合到枯草芽孢桿菌ATCC9943基因組的方法構(gòu)建了一個(gè)高產(chǎn)抗菌肽菌株FMB27。經(jīng)過(guò)高效液相色譜分析，確定改良菌株產(chǎn)surfactin和fengycin的能力大大提高。
文檔編號(hào)C12N15/75GK102220366SQ20111010539
公開(kāi)日2011年10月19日 申請(qǐng)日期2011年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月27日
發(fā)明者別小妹, 呂鳳霞, 張充, 曹?chē)?guó)強(qiáng), 鐘蕾, 陸兆新 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)