專利名稱：一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白及其制備和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)是一種遲緩愛(ài)德 華氏菌溶血素基因調(diào)控蛋白及其制備和應(yīng)用。
技術(shù)背景遲緩愛(ài)德華氏菌為一種重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病原菌，能夠感染多種養(yǎng) 殖淡、海水魚(yú)類，如鯉魚(yú)、羅非魚(yú)、牙鲆、鰻鱺、鰭魚(yú)、真鯛等。目前已 發(fā)現(xiàn)的遲緩愛(ài)德華氏菌致病因子主要有三類和六類分泌系統(tǒng)、溶血素以及粘附素等。其中Eth溶血素系統(tǒng)由EthA和EthB組成；EthA為溶血素因子， 能直接與宿主細(xì)胞作用而造成溶血現(xiàn)象；EthB為EthA的運(yùn)輸及激活因子， 因而EthA的分泌及功能活性依賴于EthB。由于Eth溶血素為一重要毒力 因子，與細(xì)菌致病力密切相關(guān)，因而其表達(dá)受到嚴(yán)格調(diào)控，破壞這種調(diào)控 可導(dǎo)致細(xì)菌致病力的降低。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白及其制備和應(yīng)用。 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列。 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備方法方法1)質(zhì)粒pBTWFl的構(gòu)建以遲緩愛(ài)德 華氏菌TX1為模板，用引物ERFA和ERRA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載 體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有安 卡青霉素、Xgal和異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBTWFl;所述引物為ERFA5' -GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA -3,，和ERRA 5， - GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，；2 )質(zhì)粒pBTWF2的構(gòu)建將上述步驟1 )質(zhì)粒pBTWFl用BamHI/EcoRV 酶切，回收0. 7kb片段；將質(zhì)粒pBR322用BamHI/NruI酶切，回收3. 7kb片 段，將兩段回收的酶切片段用T4 DNA連接酶于16-？ "C連接8-16小時(shí)， 連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18-24小時(shí)，條選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBTWF2，其為具有序列表 SEQ IDNo. 1中的堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。所述PCR條件為94"C 60s預(yù) 變性模板DNA，然后94。C40s， 58。C 60s， 72。C 60s， 5個(gè)循環(huán)后改為94"C 40s, 61"C 60s， 72')C 60s， 25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)10min。轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的應(yīng)用通過(guò)反義RNA干擾具有所述序列表SEQ ID No. 1 中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白使其具有降低細(xì)菌毒力的作用。所述通過(guò)反義RNA干擾具有所述序列表SEQ ID No. 1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的方法為l)質(zhì)粒pBTRl構(gòu)建以質(zhì)粒pTrcHis為模板，釆用 引物TRF和TRR1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBS - T連接，連接混合 液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在含有安卡青霉素、Xgal和異丙基-p-D-硫代半乳糖苷 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選出轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pBSERl; 將質(zhì)粒pBSERl與質(zhì)粒pBR322用EcoRI/BamHI雙酶切，分別回收130bp和 4kb片段；將上述回收片段用T4DNA連接酶連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化 大腸桿菌后在含安卡青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提 取質(zhì)粒，即為pBTRl;所述引物TRF1為5， _ GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG -3， ； TRR1為5' - GGATCCATGATATCATTATACGAGCCGGATG -3，；2)質(zhì)粒pBTR2構(gòu)建以遲緩愛(ài)德華氏菌TX1為模板，釆用引物ERR3和 ERF1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBS - T連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿 菌后在含有安卡青霉素、Xgal和異丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選出轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSER2;將質(zhì)粒 pBSER2與步驟1 )所的質(zhì)粒pBTRl用EcoRV/BamHI酶切，分別回收0. 7kb和 3. 9kb片段；將上述回收片段用T4DNA連接酶連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn) 化大腸桿菌后在含安卡青霉素、Xgal、異丙基-p-D-硫代半乳糖苷的LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pBTR2;其中引物ERR3為 5 ， _ GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC _3 ， ； ERF1 為 5 ' _ GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC -3';3 )質(zhì)粒pJAl的構(gòu)建以質(zhì)粒pBR322為模板，釆用引物APF1和APR4 進(jìn)行PCR,擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI酶切，回收l(shuí)kb片段，將其與質(zhì)粒pDN18的7. 8kb EcoRI酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸 桿菌DH5cx后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子提耳又質(zhì)粒，即為pJAl;其中弓l物APF1為5， 一 TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG-3' 禾口 APR4為5' - TAAGAATTCAAATGAGTAAACTTGGTCTG -3';4)質(zhì)粒pERI26的構(gòu)建將步驟3)質(zhì)粒pJAl用EcoRV酶切，回收8.8kb 片段；同時(shí)將步驟2)質(zhì)粒pBTR2用Seal酶切，回收1.3kb片段，將兩段 回收片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 oc后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒， 即為具有序列表SEQ ID No. 1中相反堿基序列的質(zhì)粒pERI26。所述步驟l)中PCR條件為94DC60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 48('C 60s, 72°C 60s， 5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s， 57°C 60s, 72°C 60s, 25 個(gè)循環(huán)后再在72。C延伸反應(yīng)10min。所述步驟2 )中PCR條件為94"C 60s 預(yù)變性模板DNA，然后94。C 40s, 51。C 60s, 72。C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94"C 40s, 64。C 60s, 72。C 60s， 25個(gè)循環(huán)后再在72。C延伸反應(yīng)1 Omin。所述步 驟3)中PCR條件為94"C 40s， 50°C 60s， 72"C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94"C 40s, 55°C 60s, 72"C 60s， 25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin。 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1. 本發(fā)明提供的新的、強(qiáng)力型溶血素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白EthR為一種GntR家族的調(diào)控蛋白，這是首次發(fā)現(xiàn)該類蛋白參與溶血素基因的調(diào)控。2. 反義RNA干擾原核生物基因表達(dá)的方法新穎有效。本發(fā)明利用反義 RNA成功干擾原核生物基因表達(dá)，其只干擾目的操縱子中基因的表達(dá)，不影 響周邊操縱子中基因的表達(dá)，因而具特異性。3. 具潛在的病害防治應(yīng)用性。本發(fā)明通過(guò)WM表達(dá)的RNA干擾而顯著 降低細(xì)菌毒力，因而在遲緩愛(ài)德華氏菌的病害控制中有應(yīng)用潛能，并且該 方法可擴(kuò)展應(yīng)用到其它病原微生物的防控。
具體實(shí)施方式
下面實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。實(shí)施例旨在對(duì)本發(fā)明進(jìn)行舉例描 述，而非以任何形式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行限制。在本發(fā)明實(shí)施例中所涉及到的常規(guī)性實(shí)驗(yàn)方法均采用如下方法1. 質(zhì)粒提取、DNA(PCR)產(chǎn)物純化、DNA片段從凝膠中回收、細(xì)菌基因組 DNA提取皆使用"天根生化科技(北京)有限公司"的相應(yīng)試劑盒。2. 質(zhì)粒、DNA連接液轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌皆用Hanahan方法(Sambrook and Russell: Molecular Cloning: A Laboratory Mai皿ial. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001 );3. 所有限制性內(nèi)切酶和連接酶皆購(gòu)自于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"， 北京。4. 所有PCR反應(yīng)的組分皆購(gòu)于"天根生化科技(北京)有限公司"；PCR 反應(yīng)體系中的組分如下在50ul反應(yīng)體系中包含lul模版，2ul lOuM引 物，5ul lOxTaq Buffer, 4ul 2, 5mM dNTP Mix, lul 2U Taq，和37ul水。其中10xTaq Buffer的組成為200mM Tris-HCl， 200mMKCl， 15mMMgCl2。 其中dNTPMix的組成為2. 5mMdATP， 2. 5mMdGTP， 2. 5mM dTTP， 2. 5mM dCTP.i發(fā)t^的遲緩愛(ài)德華氏菌溶血素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白EthR具有序列表 SEQ ID No. 1中的etM堿基序列。 序列表1(a)序列特征:*長(zhǎng)度693 bp *類型堿基序列*鏈型單鏈 參拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(b) 分子類型雙鏈DNA(c) 假設(shè)否(d) 反義否(e) 最初來(lái)源遲緩愛(ài)德華氏菌TX1(f) 特異性名稱EthR 轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備1) 質(zhì)粒pBTWFl的構(gòu)建以遲緩愛(ài)德華氏菌TX1為模板，釆用引物ERFA (5， - GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA -3，,劃線堿基為BamHI位點(diǎn))和ERRA (5， - GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，，劃線堿基為EcoRV位點(diǎn))，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR條件為:94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 58。C 60s, 72。C 60s， 5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s， 61°C 60s， 72°C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再在72"C 延伸反應(yīng)10min。將擴(kuò)增產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與載體 pBS-T于室溫連接2小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有100 ug/nil Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小 時(shí)，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBTWFl。所述遲緩愛(ài)德華氏 菌TX1為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏編號(hào)為 CGMCC No. 2 330的菌株。2) 質(zhì)粒pBTWF2的構(gòu)建將上述步驟1 )質(zhì)粒pBTWFl用BamHI/EcoRV酶 切，回收0.7kb片段；將質(zhì)粒pBR322 (購(gòu)于"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北 京)用BamHI/NruI酶切，回收3. 7kb片段。將兩段回收的酶切片段用T4 DNA 連接酶于16"C連接8小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有100ug/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子菌落，提取質(zhì)粒，即 為質(zhì)粒pBTWF2，其為具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋 白。通過(guò)反義RNA干擾具有所述序列表SEQ ID No. 1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 蛋白使其具有降低細(xì)菌毒力的作用。所述轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的表達(dá)干擾方法l)質(zhì)粒pBTRl的構(gòu)建以質(zhì)粒pTrcHis(購(gòu)自于美國(guó)Invitrogen公司) 為模板，用下歹'J弓I物PCR: TRF1 (5， - GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG -3'， 戈'J線堿基為EcoRI位點(diǎn))，TRR1 (5' - GGATCCATGAWCATTATACGAGCCGGATG-3', 劃線堿基為BamHI/EcoRV位點(diǎn))，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板 DNA，然后94"C 40s， 48°C 60s， 72nC 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94。C 40s， 57°C 60s, 72°C 60s， 25個(gè)循環(huán)后再在72°C延伸反應(yīng)lOmin。 PCR產(chǎn)物用天根DNA 產(chǎn)物純化試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T(購(gòu)自于"天根生化科技有限 公司"，北京)于室溫連接2小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有100 ug/ml安卡青霉素(Ap)、 40ug/ml Xgal (5-溴-4-氯-3-吲哚-P-D-乳糖苷)和24 ug/ml異丙基-p-D-硫代半乳糖苷(IPTG)的LB固體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，即為質(zhì)粒pBSERl。將質(zhì)粒pBSERl 與質(zhì)粒pBR322 (購(gòu)自"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京)用EcoRI/BamHI 雙酶切后分別回收130bp和4kb片段；將兩酶切片段用T4DNA連接酶于室 溫連接2小時(shí)，連接液用轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Ap (50ug/mi)的 LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí),挑取1個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將其命名為 pBTRl。所述LB組成成分按重量百分比計(jì)1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉， 1.0%氯化鈉，97. 5%蒸餾水。2)質(zhì)粒pBTR2的構(gòu)建以遲緩愛(ài)德華氏菌TX1為模板，用下列引物PCR 反義etM基因:ERR3 (5, — GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，，劃線堿 基為EcoRV位點(diǎn))，ERF1 (5， - GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC -3，， 劃線堿基為BaraHI和Seal位點(diǎn))，PCR條件為94°C 60s預(yù)變性模板DNA，然 后94°C 40s， 51。C 60s， 72°C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94。C 40s， 64。C 60s, 72°C 60s， 25個(gè)循環(huán)后再在72"C延伸反應(yīng)lOmin。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化 試劑盒純化后與PCR克隆載體pBS-T于室溫連接2小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5cc后在含有100 ug/ml Ap、 40ug/ml Xgal和24 ug/ml IPTG 的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，即為質(zhì)粒pBSER2。 將質(zhì)粒pBSER2和步驟1 )的質(zhì)粒pBTRl用EcoRV/B認(rèn)HI酶切，分別回收0. 7kb 和3. 9kb片段；將兩段片段用T4DM連接酶于室溫連接2小時(shí)，連接液轉(zhuǎn) 化入大腸桿菌DH5 a后在含有50ug/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)， 挑取l個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將其命名為pBTR2。所述遲緩愛(ài)德華氏菌TX1 為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏編號(hào)為CGMCC No. 2330的菌株。3) 質(zhì)粒pJAl的構(gòu)建以質(zhì)粒pBR322 (購(gòu)自"紐英倫生物技術(shù)有限公司"，北京)為模板，用下列引物PCR: APF1 (5， - TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG -3，，劃線堿基為EcoRI位點(diǎn)),APR4 (5， — TAAGAATTCAAATGAGTAAACTTGGTCTG -3'，劃線堿基;EcoRI位點(diǎn))，PCR條件為94。C 60s預(yù)變性模板DM，然后94°C40s， 50。C 60s， 72。C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94。C 40s， 55。C 60s， 72。C 60s,25個(gè)循環(huán)后再在72"C延伸反應(yīng)1Gmin。 PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后用EcoRI酶切，回收l(shuí)kb片段；將質(zhì)粒pDN18(參見(jiàn)Marx, C. J. & Lidstrom. M. E. (2001). Development of improved versatile broad-host range vectors for use in methylotrophsand other Gram-negative bacteria. M/crab/b/osfy 147, 2065-2075 )用EcoRI酶切，回收7. 8kb片段；將兩段酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有50ug/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑取l個(gè)轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，將其命名為pJAl。4) 質(zhì)粒pERI26的構(gòu)建將步驟3 )質(zhì)粒pJAl用EcoRV酶切，回收8. 8kb 片段；同時(shí)將步驟2)質(zhì)粒pBTR2用Seal酶切，回收l(shuí). 3kb片段。將兩段8回收片段用T4DNA連接酶于室溫連接2小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 oc后在含有50iig/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑取1個(gè)轉(zhuǎn)化子， 提取質(zhì)粒，即為pERI26，具有序列表SEQ ID No. 1中的堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào) 控蛋白的反義序列。檢測(cè)降低細(xì)菌毒力1 )菌株TXERI26的構(gòu)建將上述質(zhì)粒pERI26轉(zhuǎn)化入大腸桿菌S17入兀 (購(gòu)于西班牙"Biomedal"公司)后在含有50ug/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)18小時(shí)，挑取1個(gè)轉(zhuǎn)化子，命名為S17入兀/pERI26。將TX1和 S17X7i/pERI26在LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后將二者以體積比為1: 3 比例混合，且二者總體積lnil;將混合液以5000g, 4°C下離心10min收集 菌體；將菌體懸浮于lml LB液體培養(yǎng)基中，取0. lml培養(yǎng)液置于固體LB 培養(yǎng)基上于30"C保溫6小時(shí)，而后將細(xì)菌懸浮于lml液體LB，取0. lml在含 有50ug/ml Ap和15 ug/ml四環(huán)素(Tc )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)， 挑取l個(gè)轉(zhuǎn)化子，命名為TXERI26。菌株TXJA1的構(gòu)建將表達(dá)干擾方法步驟3)所得質(zhì)粒pJAl轉(zhuǎn)化入大 腸桿菌S17入兀(購(gòu)于西班牙"Biomedal"公司)后在含有50ug/ml Ap的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18小時(shí)，挑取1個(gè)轉(zhuǎn)化子，命名為S17Aji/pJAl。將TX1 和S17X7i/pJAl在LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)，然后將二者以體積比為l: 3 比例混合，且二者總體積lml;將混合液以5000g， 4°C下離心lOmin收集 菌體；將菌體懸浮于lml LB液體培養(yǎng)基中，取0. lmi培養(yǎng)液置于固體LB 培養(yǎng)基上于30"C保溫6小時(shí)，而后將細(xì)菌懸浮于lml液體LB，取0. lml在含 有50ug/ml Ap和15 ug/ml四環(huán)素(Tc )的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時(shí)， 挑取1個(gè)轉(zhuǎn)化子，命名為TXJAl。2 )表達(dá)檢測(cè)將TXERI26和TXJAl于LB培養(yǎng)基中28°C搖動(dòng)培養(yǎng)至OD, 0.8，用SV Total RNA提取試劑盒(購(gòu)于美國(guó)"Promega"公司)提取總 RNA。用熒光定量PCR試劑盒(購(gòu)于Takara)和ABI 7300實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀(A卯lied Biosystems)進(jìn)行PCR反應(yīng)，檢測(cè)有序列表SEQ ID No. 1中的 堿基序列在TXERI26和TXJAl中的表達(dá)水平。結(jié)果表明有序列表SEQ ID No. 1 中的堿基序列在TXERI26中的表達(dá)量比在TXJAl中降低了 3倍，說(shuō)明具有 所述序列表SEQ ID No. 1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的表達(dá)被成功干擾。同時(shí)檢測(cè)TXERI26和TXJAl的毒力 將TXERI26和TXJAl于LB培養(yǎng)基中28"C搖動(dòng)培養(yǎng)至OD副0. 5，離心(5000g, 4°C, lOmin)收集菌體；將菌體懸浮于PBS中至終濃度為2x107 cf u/ml ，分 別命名為TXERI26懸浮液和TXJAl懸浮液。將48條牙鲆(平均16g)隨機(jī)分 為A和B兩組，每組24條。A組每條魚(yú)腹腔注射0. lml上述TXJAl懸浮液， B組每條魚(yú)腹腔注射0. lml上述TXERI26懸浮液，在14天內(nèi)觀察每組魚(yú)的 死亡數(shù)。結(jié)果表明A組的總死亡率為95.8%, B組的總死亡率為29.2%， 比A組降低了 66.6%,說(shuō)明具有所述序列表SEQ ID No. 1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白表達(dá)干擾顯著(P< 0.001)降低了細(xì)菌的毒力。其中PBS組成 成分為0.8g NaCl， 0. 02g KC1， 0. 358g Na2HP04. 12H20， 0. 024g NaH2P04。 實(shí)施例3與實(shí)施例1轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備不同之處在于1) 質(zhì)粒pBTWFl的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pBS-T于室溫連接4小時(shí)， 連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5cc后在含有Ap、 Xgal和IPTG的LB固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)24小時(shí)，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBTWFl。2) 質(zhì)粒pBTWF2的構(gòu)建將兩段回收的酶切片段用T4 DNA連接酶于16°C 連接16小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)24小時(shí)。實(shí)施例4與實(shí)施例1轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備不同之處在于1) 質(zhì)粒pBTWFl的構(gòu)建PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pBS-T于室溫連接3小時(shí)， 連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5oc后在含有Ap、 Xgal和IPTG的LB固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)20小時(shí)，篩選出白色轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBTWFl。2) 質(zhì)粒pBTWF2的構(gòu)建將兩段回收的酶切片段用T4 DNA連接酶于16°C 連接14小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5 a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基 上培養(yǎng)20小時(shí)。實(shí)施例5與實(shí)施例2轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白表達(dá)干擾的不同之處在與1) 質(zhì)粒pBTRl的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與 PCR克隆載體pBS-T于室溫連接3小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)；將用EcoRI/BamHI 雙酶切的兩酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小時(shí)，連接液用轉(zhuǎn)化入 大腸桿菌DH5 a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)。2) 質(zhì)粒pBTR2的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與 PCR克隆載體pBS-T于室溫連接3小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)；將用EcoRV/BamHI 酶切的兩段片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌DH5 oc后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)。3) 質(zhì)粒pJAl的構(gòu)建將兩段酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小 時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有50ug/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)2Q小時(shí)。4) 質(zhì)粒pERI26的構(gòu)建將兩段回收片段用T4DNA連接酶于室溫連接3 小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 20小時(shí)。實(shí)施例6與實(shí)施例2轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白表達(dá)干擾的不同之處在與1) 質(zhì)粒pBTRl的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與 PCR克隆載體pBS-T于室溫連接3小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)；將用EcoRI/BamHI 雙酶切的兩酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小時(shí)，連接液用轉(zhuǎn)化入 大腸桿菌DH5 a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)。2) 質(zhì)粒pBTR2的構(gòu)建PCR產(chǎn)物用天根DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后與 PCR克隆載體pBS-T于室溫連接3小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后 在含有Ap、Xgal和IPTG的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)；將用EcoRV/BaraHI 酶切的兩段片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿 菌DH5 a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)20小時(shí)。3) 質(zhì)粒pJAl的構(gòu)建將兩段酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接3小 時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5a后在含有50ug/ml Ap的LB固體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)20小時(shí)。4) 質(zhì)粒pERI26的構(gòu)建將兩段回收片段用T4DNA連接酶于室溫連接3 小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 20小時(shí)。序列表SEQUENCE LISTING 〈110〉中閨科學(xué)院海洋研究所〈]20> —種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋山及ji制備和應(yīng)用<130〉<160> 1<170〉 Patentln version 3.1〈210〉 1〈211〉 693<212〉 隨<213> 遲緩爰德華氏菌TXl 《220〉<221〉 CthR〈222〉 "). . (693) <22:b<頓)>3tgC"tca3C3ac33g(:cgccC3gCgCf!3CCtctcctatcttCttgCtg3g60ngcggstcxtt3tC3gtCCggC3gC3ttC,tgCCggggg33120('t (:ga;i"ggtgg(;gt"cag(:cg"ic(，gctgtacgtgaggcggt,33333t.g180('l,gg('ctigctwcgcgtCCgCgC3ttggt3CgCgCgtC3tgCCg3gC240agcag('tgg3atUtctcg3tca,gctgctgacctggtggCtg3CCCg3g8ga3ttt.t300gaa"化g卞(，a服g3t('.actt(.'ctgptgctgCgC33tgCg('tggagc.cacagg('ctgcctg360('1 g;-icggrg('('ggd(-'gat333gCCgtt3H:33tfjyc(-'tgatgcatgaa42031.gcg-cgagctC38t3gCC3"ttgatcgcgaacgctgg3tt-CgggtCg3tgtacaattc480t(—'tglC83gg'CC3gCgC t33CCCgttCCtg3cctcgttctcC33CUgt t c540f:iHct(.'gg卞ctaccaaagcta(:ttccgttcggtaaccggU]atgaagtcgtC33gCtgg3g600Cg3tCgU、.g3tgCC3l.CCtCgCCggCg3CgCCC3gggggCctatgtggcc660tgctggg卞8t3g3Cgg3gCCt 3369權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，其特征在于具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。
2. —種按權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備方法方法，其特征在 于l)質(zhì)粒pBTWFl的構(gòu)建以遲緩愛(ài)德華氏菌TX1為模板，用引物ERFA和 ERRA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pBS-T于室溫連接2-4小時(shí)，連接 混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a后在含有安卡青霉素、Xgal和異丙基-P-D-硫 代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即 為質(zhì)粒pBTWFl;所述引物為ERFA5， - GGATCCGATTAGGATCGACTAGCCA -3，， 和ERRA 5， - GATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC -3，；2 )質(zhì)粒pBTWF2的構(gòu)建將上述步驟1 )質(zhì)粒pBTWFl用BamHI/EcoRV 酶切，回收0. 7kb片段；將質(zhì)粒pBR322用BamHI/NruI酶切，回收3.7kb片 段，將兩段回收的酶切片段用T4 DNA連接酶于16- "C連接8-16小時(shí)， 連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5oc后在含有安卡青霉素的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng) 18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBTWF2，其為具有序列表 SEQ ID No. 1中的堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白。
3. 按權(quán)利要求2所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備方法方法，其特征在于 所述PCR條件為94"C60s預(yù)變性模板DNA，然后94。C 40s, 58"C 60s， 72°C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94"C 40s, 61UC 60s, 72。C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再在72"C 延伸反應(yīng)lOmin。
4. 一種按權(quán)利要求l所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的應(yīng)用，其特征在于通過(guò)反 義RNA干擾具有所述序列表SEQ ID No. 1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白使其 具有降低細(xì)菌毒力的作用。
5. 按權(quán)利要求4所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的應(yīng)用，其特征在于所述通過(guò)反 義RNA干擾具有所述序列表SEQ ID No. 1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的方 法為l)質(zhì)粒pBTRl構(gòu)建以質(zhì)粒pTrcHis為模板，采用引物TRF和TRRl 進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBS-T連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后 在含有安卡青霉素、Xgal和異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng)基上 培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選出轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pBSERl;將質(zhì)粒pBSERl與 質(zhì)粒pBR322用EcoRI/BamHI雙酶切，分別回收130bp和4kb片段；將上述 回收片段用T4DNA連接酶連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在含 安卡青霉素的LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pBTRl; 所述引物TRF1為5， - GAATTCATTAATCACTGCATAATTCGTG-3' ; TRR1 為5， - GGATCCATGATATCATTATACGAGCCGGATG -3，；2)質(zhì)粒pBTR2構(gòu)建以遲緩愛(ài)德華氏菌TX1為模板，釆用引物ERR3和 ERF1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與質(zhì)粒pBS-T連接，連接混合液轉(zhuǎn)化大腸桿菌后在含有安卡青霉素、Xgal和異丙基-P -D-硫代半乳糖苷的LB固體培養(yǎng) 基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選出轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為質(zhì)粒pBSER2;將質(zhì)粒 pBSER2與步驟1 )所的質(zhì)粒pBTRl用EcoRV/BamHI酶切,分別回收0. 7kb和 3. 9kb片段；將上述回收片段用T4DNA連接酶連接2-4小時(shí)，連接混合液轉(zhuǎn) 化大腸桿菌后在含安卡青霉素、Xgal、異丙基-(3-D-硫代半乳糖苷的LB培 養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24小時(shí)，篩選轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pBTR2;其中引物ERR3為 5 ， - GCAGATATCCGTCGAGTGTTAGGCTC - 3 ， ； ERF1 為 5 ， _ GGATCCAGTACTGATTAGGATCGACTAGCC -3，；3)質(zhì)粒pJAl的構(gòu)建以質(zhì)粒pBR322為模板，釆用引物APF1和APR4 進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物用EcoRI酶切，回收l(shuí)kb片段，將其與質(zhì)粒pDN18的7. 8kb EcoRI酶切片段用T4DNA連接酶于室溫連接2 - 4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸 桿菌DH5a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒，即為pJAl;其中引物APF1為5， 一 TATGAATTCTTGAAGACGAAAGGG _3， 和APR4為5， _ TAAGAA丁TCAAATGAGTAAACTTGGTCTG -3，；4)質(zhì)粒pERI26的構(gòu)建將步驟3)質(zhì)粒pJAl用EcoRV酶切，回收8. 8kb 片段；同時(shí)將步驟2)質(zhì)粒pBTR2用Seal酶切，回收l(shuí). 3kb片段，將兩段 回收片段用T4DNA連接酶于室溫連接2-4小時(shí)，連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌M5 a后在含有Ap的LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)18-24小時(shí)，挑取轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒， 即為具有序列表SEQ ID No. 1中相反堿基序列的質(zhì)粒pERI26。
6. 按權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備方法，其特征在于所述步 驟l)中PCR條件為94"C 60s預(yù)變性模板DNA,然后94"C 40s, 48°C 60s, 72('C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94DC 40s, 57"C 60s, 72"C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再 在72nC延伸反應(yīng)lOmin。
7. 按權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備方法，其特征在于所述 歩驟2)中PCR條件為94°C60s預(yù)變性模板DNA，然后94°C 40s， 51。C 60s, 72"C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為94°C 40s, 64°C 60s, 72flC 60s， 25個(gè)循環(huán)后再 在72°C延伸反應(yīng)lOmin。
8. 按權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的制備方法，其特征在于所述 步驟3)中PCR條件為94°C 40s, 50°C 60s， 72"C 60s, 5個(gè)循環(huán)后改為 94"C 40s, 55。C 60s, 72°C 60s, 25個(gè)循環(huán)后再在72"C延伸反應(yīng)lOmin。
全文摘要
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)以及基因工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種遲緩愛(ài)德華氏菌溶血素基因調(diào)控蛋白及其制備和應(yīng)用。具體為具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列。其以遲緩愛(ài)德華氏菌TX1為模板，用引物ERFA和ERRA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與載體pBS-T于室溫連接轉(zhuǎn)化所得質(zhì)粒pBTWF1酶切，回收0.7kb片段；將質(zhì)粒pBR 322酶切，回收3.7kb片段，將兩段回收的酶切片段用T4 DNA連接酶于后轉(zhuǎn)化得具有序列表SEQ ID No.1中的堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白的表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)反義RNA干擾具有所述序列表SEQ IDNo.1中堿基序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白使其具有降低細(xì)菌毒力的作用。本發(fā)明提供的新的、強(qiáng)力型溶血素基因調(diào)控因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白EthR為一種GntR家族的調(diào)控蛋白，這是首次發(fā)現(xiàn)該類蛋白參與溶血素基因的調(diào)控。
文檔編號(hào)C12N1/21GK101323639SQ20081013816
公開(kāi)日2008年12月17日 申請(qǐng)日期2008年7月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月4日
發(fā)明者黎 孫, 敏 張, 芳 王 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院海洋研究所