ΒΑ”，即6-芐氨基腺嘌呤，可抑制植物葉內(nèi)葉綠素、核酸、蛋白質(zhì)的分解，保綠防老，將氨基酸、生長(zhǎng)素、無(wú)機(jī)鹽等向處理部位調(diào)運(yùn)。
[0030]依據(jù)本試驗(yàn)研究建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系，在最適的轉(zhuǎn)化條件下，采用攜帶質(zhì)粒PCMBIA1301質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌ΕΗΑ105侵染小麥成熟胚愈傷組織，經(jīng)過(guò)含有潮霉素的抗性培養(yǎng)基篩選后，獲得了抗性再生植株。提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，以轉(zhuǎn)化的小麥植株基因組DNA為模板，用⑶S基因?yàn)闄z測(cè)引物，對(duì)抗性再生植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，提取轉(zhuǎn)化植株的基因組DNA和質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中M為2000 Marker，CKl為陽(yáng)性對(duì)照，CK2為轉(zhuǎn)基因植株的陰性對(duì)照，而I和2則是抗性再生植株。結(jié)果如圖1，抗性再生植株P(guān)CR顯示，外源基因在抗性轉(zhuǎn)基因植株中能夠表達(dá)，表明試驗(yàn)建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)冬小麥遺傳轉(zhuǎn)化體系具有可行性。
[0031]本發(fā)明以冬小麥東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的冬小麥東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化體系；并利用建立的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系轉(zhuǎn)化東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚愈傷組織，獲得了抗性再生小麥植株，PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，轉(zhuǎn)化效率為2.86%，為冬小麥東農(nóng)冬麥I號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【附圖說(shuō)明】
[0032]圖1為提取本發(fā)明實(shí)施例3的基因組DNA和本發(fā)明實(shí)施例3的質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0033]下面，通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0034]實(shí)施例1
本發(fā)明提出的一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟:
51、挑選當(dāng)年籽粒飽滿的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟種子，消毒，滅菌，清洗后，置于溫度為24°C的黑暗培養(yǎng)箱中的無(wú)菌水中過(guò)夜；然后在無(wú)菌狀態(tài)下，將浸泡過(guò)夜后的種子置于無(wú)菌濾紙上以吸干過(guò)夜后的種子表面水分，在超凈工作臺(tái)中采用胚切傷略帶胚乳法進(jìn)行取胚，將胚的盾片朝上接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、550mg/L 酪蛋白、80mg/L 谷氨酰胺、0.15mg/L ΝΑΑ、0.2g/L 肌醇、1.2g/L 脯氨酸、0.4mg/L ΑΒΑ、1.lmg/L 2，4_D、28g/L蔗糖和9g/L瓊脂；再將胚性愈傷組織置于pH值為5.5的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)12d得到預(yù)培養(yǎng)愈傷組織，其中預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、450mg/L 酪蛋白、120mg/L 谷氨酰胺、0.05mg/L ΝΑΑ、0.4g/L 肌醇、0.8g/L 脯氨酸、0.6mg/LΑΒΑ、1.9mg/L 2，4_D、28g/L 鹿糖和 9g/L 瓊脂；
52、取農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)；接著挑取培養(yǎng)得到的農(nóng)桿菌單菌落接種在pH值為6.5的液體YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，其中液體YEB培養(yǎng)基包括:6g/L蛋白胨、0.8g/L酵母提取物、6g/L牛肉膏、0.3g/L MgSO4-7H20,55mg/L利福平、45mg/L卡那霉素、55mg/L鏈霉素、6g/L蔗糖、12g/L瓊脂，離心得到菌液，菌液濃度為OD6im=L O ;將菌液加入pH值為5的侵染培養(yǎng)基中重懸得到混合物料，其中侵染培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、220 ymol/L AS、1.9g/L MES、32g/L 蔗糖;
53、將預(yù)培養(yǎng)愈傷組織浸入混合物料中侵染lh，吸取多余菌液，無(wú)菌干燥，然后置于含有兩層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng)5d ;再置于pH值為5的恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)2周，其中恢復(fù)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、550mg/L酪蛋白、80mg/L谷氨酰胺、0.15mg/L NAA、0.2g/L 肌醇、1.2g/L 脯氨酸、0.4mg/L ABA,2.lmg/L 2，4_D、240mg/L 頭孢霉素、270mg/L 羧芐青霉素、28g/L蔗糖和9g/L瓊脂；接著置于pH值為5.5的分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選4周得到再生植株，其中每隔2周更換I次分化篩選培養(yǎng)基，其中分化篩選培養(yǎng)基包括:MS 培養(yǎng)基、0.15mg/L NAA,0.12g/L 肌醇、1.lg/L 脯氨酸、3mg/L 6_BA、270mg/L 頭孢霉素、240mg/L羧芐青霉素、32mg/L潮霉素、28g/L蔗糖和9g/L瓊脂；
54、將再生植株置于pH值為5.5的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)18d后，其中生根培養(yǎng)基包括:1/2 MS培養(yǎng)基、0.5mg/L NAA、230mg/L頭孢霉素、260mg/L羧芐青霉素、28g/L蔗糖和9g/L瓊脂，打開(kāi)瓶口煉苗2d，然后將植株移栽到花盆中培養(yǎng)。
[0035]實(shí)施例2
本發(fā)明提出的一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟:
S1、挑選當(dāng)年籽粒飽滿的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟種子，消毒，滅菌，清洗后，置于溫度為26°C的黑暗培養(yǎng)箱中的無(wú)菌水中過(guò)夜；然后在無(wú)菌狀態(tài)下，將浸泡過(guò)夜后的種子置于無(wú)菌濾紙上以吸干過(guò)夜后的種子表面水分，在超凈工作臺(tái)中采用胚切傷略帶胚乳法進(jìn)行取胚，將胚的盾片朝上接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、450mg/L酪蛋白、120mg/L谷氨酰胺、0.05mg/L ΝΑΑ、0.4g/L肌醇、0.8g/L脯氨酸、0.6mg/L ΑΒΑ,0.9mg/L 2，4_D、32g/L蔗糖和7g/L瓊脂；再將胚性愈傷組織置于pH值為6的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)6d得到預(yù)培養(yǎng)愈傷組織，其中預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、550mg/L酪蛋白、80mg/L谷氨酰胺、0.15mg/L ΝΑΑ、0.2g/L肌醇、1.2g/L脯氨酸、0.4mg/L ΑΒΑ、2.lmg/L 2，4-D、32g/L 蔗糖和 7g/L 瓊脂;
52、取農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)；接著挑取培養(yǎng)得到的農(nóng)桿菌單菌落接種在pH值為7.5的液體YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，其中液體YEB培養(yǎng)基包括:4g/L蛋白胨、1.2g/L酵母提取物、4g/L牛肉膏、0.7g/L MgSO4*7H20、45mg/L利福平、55mg/L卡那霉素、45mg/L鏈霉素、4g/L蔗糖、18g/L瓊脂，離心得到菌液，菌液濃度為0D_=0.5 ;將菌液加入pH值為5.5的侵染培養(yǎng)基中重懸得到混合物料，其中侵染培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、180 μ mo I/L AS、2.0g/L MES、28g/L 蔗糖;
53、將預(yù)培養(yǎng)愈傷組織浸入混合物料中侵染5h，吸取多余菌液，無(wú)菌干燥，然后置于含有兩層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中進(jìn)行共培養(yǎng)3d ;再置于pH值為5.5的恢復(fù)培養(yǎng)基上進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)2周，其中恢復(fù)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、450mg/L酪蛋白、120mg/L谷氨酰胺、0.05mg/LΝΑΑ、0.4g/L 肌醇、0.8g/L 脯氨酸、0.6mg/L ΑΒΑ、1.9mg/L 2, 4_D、260mg/L 頭孢霉素、230mg/L羧芐青霉素、32g/L蔗糖和7g/L瓊脂；接著置于pH值為6的分化篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行抗性篩選4周得到再生植株，其中每隔2周更換I次分化篩選培養(yǎng)基，其中分化篩選培養(yǎng)基包括:MS 培養(yǎng)基、0.05mg/L NAA,0.13g/L 肌醇、0.9g/L 脯氨酸、5mg/L 6_BA、230mg/L 頭孢霉素、260mg/L羧芐青霉素、28mg/L潮霉素、32g/L蔗糖和7g/L瓊脂；
54、將再生植株置于pH值為6的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行壯苗生根培養(yǎng)22d后，其中生根培養(yǎng)基包括:1/2 MS培養(yǎng)基、0.3mg/L NAA、270mg/L頭孢霉素、240mg/L羧芐青霉素、32g/L蔗糖和7g/L瓊脂，打開(kāi)瓶口煉苗4d，然后將植株移栽到花盆中培養(yǎng)。
[0036]實(shí)施例3
本發(fā)明提出的一種建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟胚遺傳轉(zhuǎn)化的方法，包括如下步驟:
51、挑選當(dāng)年籽粒飽滿的東農(nóng)冬麥I號(hào)成熟種子，消毒，滅菌，清洗后，置于溫度為25°C的黑暗培養(yǎng)箱中的無(wú)菌水中過(guò)夜；然后在無(wú)菌狀態(tài)下，將浸泡過(guò)夜后的種子置于無(wú)菌濾紙上以吸干過(guò)夜后的種子表面水分，在超凈工作臺(tái)中采用胚切傷略帶胚乳法進(jìn)行取胚，將胚的盾片朝上接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到胚性愈傷組織，其中誘導(dǎo)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、500mg/L 酪蛋白、100mg/L 谷氨酰胺、0.lmg/L ΝΑΑ、0.3g/L 肌醇、lg/L 脯氨酸、0.5mg/LABA、lmg/L 2，4_D、30g/L蔗糖和8g/L瓊脂；再將胚性愈傷組織置于pH值為5.8的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)18d得到預(yù)培養(yǎng)愈傷組織，其中預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基包括:MS培養(yǎng)基、500mg/L 酪蛋白、100mg/L 谷氨酰胺、0.lmg/L ΝΑΑ、0.3g/L 肌醇、lg/L 脯氨酸、0.5mg/L ABA、2mg/L2，4-D、30g/L 蔗糖和 8g/L 瓊脂;
52、取農(nóng)桿菌在YEP培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)；接著挑取培養(yǎng)得到的農(nóng)桿菌單菌落接種在pH值為7的液體YEB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，其中液體YEB培養(yǎng)基包括:5g/L蛋白胨、lg/L酵母