專利名稱：多重基因組獲得和丟失分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本文描述的技術(shù)大體涉及核酸檢測用方法和組合物。更具體而言，所描述的是基 因組DNA多重分析用方法和組合物。
背景技術(shù)：
基因組獲得和丟失檢測用分析可以對構(gòu)成疾病、行為和認(rèn)知病癥以及其他遺傳病 變的病因的遺傳性異常進(jìn)行檢測和診斷。需要一種針對染色體獲得和丟失的編碼小球多重 分析，所述分析可提供以BACDNA作為探針材料的益處，而沒有小球交聯(lián)或其他分析性能問題。

發(fā)明內(nèi)容
一種分析DNA樣本的方法包括提供第一編碼顆粒系列，該編碼顆粒系列自身包含 連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒。所述擴(kuò)增子包含合在一起基本上代表完整的第一種模板DNA序 列的隨機(jī)核酸序列。所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣本DNA以及可檢 測地標(biāo)記的參照DNA雜交。檢測指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣 本DNA特異性雜交的第一信號。檢測指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記 的參照DNA特異性雜交的第二信號。比較所述第一信號和第二信號，以檢測所述第一信號 和所述第二信號之間的差異，所述第一信號和第二信號之間的差異指示所述樣本DNA和所 述參照DNA之間的差異。任選地，所連擴(kuò)增子的長度范圍為約500-1200個核苷酸，包括端值。可檢測地標(biāo)記的樣本DNA可以是獲自受試個體的DNA，如基因組DNA。在本文所述 方法的具體實(shí)施方案中，受試者為人。本文所述方法的各實(shí)施方案還包括提供第二編碼顆粒系列，該編碼顆粒系列含有 連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒。所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子包含合在一起基本上代表完整 的第二種模板DNA序列的DNA序列。所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣 本DNA以及可檢測地標(biāo)記的參照DNA雜交。檢測指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可 檢測地標(biāo)記的樣本DNA特異性雜交的第一信號。檢測指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子 與可檢測地標(biāo)記的參照DNA特異性雜交的第二信號。比較所述第一信號和第二信號，以檢 測所述第一信號和所述第二信號之間的差異，所述第一信號和第二信號之間的差異指示所 述樣本DNA與所述參照DNA之間的差異。在具體的實(shí)施方案中，所述第一和第二編碼顆粒系列以混合物的形式提供。使用
5各編碼顆粒系列的混合物的方法的實(shí)施方案還包括將各顆粒系列的編碼情況與所檢測到 的信號聯(lián)系起來，從而將與具體的模板DNA相關(guān)的信號與樣本DNA和參照DNA之間的差異 聯(lián)系起來。與各編碼顆粒系列相連接的擴(kuò)增子均包含合在一起基本上代表完整的模板DNA 序列的隨機(jī)核酸序列。在具體的實(shí)施方案中，所述完整的模板DNA序列比各個連接的擴(kuò)增 子都要大。在一個具體的實(shí)例中，所述完整的模板DNA序列的長度范圍為約20-300kb，包括 端值，并且各個連接的擴(kuò)增子包含與模板DNA序列的一部分相同的核酸序列，其長度范圍 為約500-1200個核苷酸(包括端值)。描述了一種制備用于分析DNA的編碼小球系列的方法，所述方法包括a)使用DNA 模板和第一種反應(yīng)寡核苷酸引物進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)。在該反應(yīng)中，多個所述第一種反應(yīng)引 物中的每一個都包含一段可變的非特異性簡并DNA序列和一段毗鄰的恒定DNA序列。所述 第一反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物含有第一擴(kuò)增子，其中各個第一擴(kuò)增子均包含一段與所述DNA模板的 一個隨機(jī)部分相同的DNA序列以及一段與所述第一種反應(yīng)引物的所述恒定DNA序列相同的 DNA序列。在方法中還包括b)使用所述第一擴(kuò)增子的至少一部分作為模板DNA，并使用第 二種反應(yīng)寡核苷酸引物進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)。所述第二種反應(yīng)寡核苷酸引物包含所述第一 種反應(yīng)引物的所述恒定DNA序列，且所述第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生含有第二擴(kuò)增子的第二反應(yīng)產(chǎn) 物。各個第二擴(kuò)增子均含有一段與所述DNA模板的一個隨機(jī)部分相同的DNA序列以及一段 與所述第一種反應(yīng)引物的恒定DNA序列相同的DNA序列。還包括c)將所述第二擴(kuò)增子與 第一種多個編碼顆粒相連，從而產(chǎn)生用于分析DNA的編碼顆粒系列。任選地，所述第二種反應(yīng)寡核苷酸引物還含有用于與編碼顆粒反應(yīng)的官能團(tuán)。例 如，可以含有5'端胺。在其他實(shí)施方案中，重復(fù)a)-c)但其中使用第二種DNA模板并將由此獲得的第二 種擴(kuò)增子與第二種多個編碼顆粒相連，所述第二種多個編碼顆粒與所述第一種多個編碼顆 粒具有可檢測差異。通過該方法形成用于分析DNA的第二編碼顆粒系列。在又另外的實(shí)施 方案中，重復(fù)a)-c)但其中使用第三種、第四種、第五種或后續(xù)的基因組DNA模板，并將由此 產(chǎn)生的第三種、第四種、第五種或后續(xù)的擴(kuò)增子與第三種、第四種、第五種或后續(xù)的多個編 碼顆粒相連，從而得到用于分析DNA的第三種、第四種、第五種或后續(xù)的編碼顆粒，所述第 三種、第四種、第五種或后續(xù)的多個編碼顆粒中的每一種均以可檢測方式不同于其他各種 多個編碼顆粒。無意于限制使用不同的DNA模板可以形成的編碼顆粒系列的數(shù)目?？尚纬?任何數(shù)目的編碼顆粒系列。而且，可以混合任何合適數(shù)目的編碼顆粒系列來產(chǎn)生多重DNA 分析試劑。本文描述了一種用于分析DNA的試劑，所述試劑包括連接有由模板DNA序列擴(kuò)增 得到的擴(kuò)增子的多個編碼顆粒。各個連接的擴(kuò)增子均包含一段與所述模板DNA序列的一 個隨機(jī)部分相同的DNA序列，其中所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板DNA，并且其 中各個擴(kuò)增子的與模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的所述DNA序列比所述完整的模板 DNA序列要短。例如，在具體的實(shí)施方案中，所述完整的模板DNA序列的長度范圍可以是約 20-300kb,包括端值，并且各個連接的擴(kuò)增子均含有與所述模板DNA序列的一個隨機(jī)部分 相同的一段DNA序列，其長度范圍為約500-1200個核苷酸，包括端值。本文所描述的用于分析DNA的多重試劑包括兩種或者更多種多個編碼顆粒的混
6合物，這樣編碼使得每種多個顆粒的顆粒均可檢測地區(qū)別于其他各種多個顆粒的顆粒。所 述編碼顆粒連接有由模板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子，并且，將各種多個編碼顆粒的每一 種相比，所述每種多個編碼顆粒均連接有由不同的模板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子。而且， 各個連接的擴(kuò)增子均包含一段與所述模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的DNA序列。提供了一種用于分析DNA的試劑盒，其含有編碼顆粒系列和/或兩個或者更多個 編碼顆粒系列的混合物。


圖1是示出一個實(shí)施方案的流程圖，該實(shí)施方案包括使用兩個擴(kuò)增反應(yīng)由模板 DNA制備擴(kuò)增子，并將擴(kuò)增子作為探針固定于一系列編碼小球上，其中該系列中的小球均具 有相同的ID代碼；圖IA是示出一個實(shí)施方案的流程圖，該實(shí)施方案包括由單個BAC克隆制備BAC擴(kuò) 增子，并將該擴(kuò)增子作為探針固定到一系列編碼小球上，從而形成一個小球系列，其中該系 列中的小球全都具有相同的ID代碼；圖2是示出一個實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括混合m個不同的編碼小球 系列，各系列均具有其各自被固定的BAC-擴(kuò)增子探針DNA，它們合在一起形成多重編碼小 球系列；圖3是示出一個實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括使用多重編碼小球系列在 η個樣本上進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析；圖3Α為示出一個實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括使用多重編碼小球系列 在η個樣本上進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析；圖4為SBS標(biāo)準(zhǔn)的96孔微孔板的模式圖，其示出平行地對46份樣本運(yùn)行分析的 兩份對照和兩份樣本的示例性位置；圖5為使用男性的13號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實(shí)例；圖6為使用男性的18號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實(shí)例；圖7為使用女性的21號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實(shí)例；圖8為使用具有X染色體5拷貝擴(kuò)增的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個實(shí) 例；和圖9為一張圖表，其示出用于在示例性分析中形成固定到編碼小球上的擴(kuò)增子的 BAC克隆、其染色體和cyto條帶(cytoband)位置、陰性對照寡核苷酸的序列和固定有各擴(kuò) 增子探針的小球系列的小球ID (Luminex小球區(qū))。
具體實(shí)施例方式本申請?zhí)峁┝伺c針對染色體獲得和丟失的編碼顆粒多重分析相關(guān)的方法和組合 物。本文使用的科技術(shù)語旨在具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常所理解的含義。這
7些術(shù)語在多部權(quán)威的參考書中被定義和使用，所述參考書例如包括J. Sambrook md D. W. RusselljMolecular Cloning :ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press ；3rd Ed.，2001 ；F. Μ. Ausubel, Ed.，Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002 ；B.Alberts et al.，Molecular Biologyof the Cell，4th Ed.，Garland，2002 ；D. L. Nelson and Μ. M. Cox, Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Ed.，W. H. Freeman &Company，2004 ； 禾口 Herdewi jn，P. (Ed.)， Oligonulceotide Synthesis :Methods and Applications， Methods in Molecular Biology, HumanaPress，2004。本文所使用的術(shù)語“核酸”是指任何形式的具有多于1個核苷酸(包括單鏈、雙鏈 的寡核苷酸或多核苷酸)的RNA或DNA分子。試劑組合物提供了一種用于分析基因組DNA的試劑，其包括連接有作為探針的擴(kuò)增子的多個 編碼顆粒。連接在所述多個編碼顆粒上的擴(kuò)增子每一個均含有與模板基因組核酸的一部分 相同或者完全互補(bǔ)的一段核酸序列，并且所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板基因 組核酸。圖1示出制備用于分析基因組DNA的試劑的方法的一個實(shí)施方案。如圖1所示，提 供一個模板核酸(1)。使用簡并寡核苷酸引物(DOP)在第一擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增所述模板(2)， 從而產(chǎn)生第一擴(kuò)增產(chǎn)物。所述模板核酸可以是能夠使用核酸擴(kuò)增方法被復(fù)制的任何核酸。用于所述第一擴(kuò)增反應(yīng)的模板DNA任選地為基因組DNA，其大小范圍通常為約 20-300kb，但是該模板也可以更小或者更大。術(shù)語“基因組的”指細(xì)胞或者生物體的基因組 的DNA，其不僅包括由細(xì)胞或者生物體的基因組的DNA復(fù)制得到的DNA，如克隆得到的DNA， 還包括從細(xì)胞或生物體直接分離得到的DNA，如顯微切割的染色體DNA。模板DNA可以包括 全部的或者部分的細(xì)胞或者生物體基因組。模板DNA可以包括表現(xiàn)為一個或者多個染色 體、染色體的一部分、基因座、基因或基因的一部分的DNA。模板DNA可以為任何形式，如載 體中的插入物，例如包括細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、人的人工染色體、黏粒、質(zhì)粒、 噬菌粒、噬菌體DNA或F黏粒。模板DNA可以是經(jīng)顯微切割的染色體DNA的形式。因此，盡 管本文描述的具體實(shí)例是以BAC作為模板DNA來源，但是也可以使用其他類型的克隆，如 PAC、YAC、黏粒、F 黏粒、cDNA 等。模板基因組DNA的獲得是通過本領(lǐng)域已知的方法實(shí)現(xiàn)，例如描述于以下文獻(xiàn) 中的方法J. Sambrook and D. W. Russell, MolecularCloning :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress ；3rd Ed. ,2001,或者 F. Μ. Ausubel, Ed. , Short Protocols inMolecular Biology, Current Protocols ；5th Ed· ，2002。DNA
買獲得和/或使用用于分離基因組DNA的商用試劑盒獲得。使用體外擴(kuò)增方法可以實(shí)現(xiàn)對模板DNA的擴(kuò)增。術(shù)語“擴(kuò)增方法”指這樣一種方 法或技術(shù)，即所述方法或技術(shù)用于復(fù)制模板核酸，由此產(chǎn)生包括全部的或者部分的模板核 酸的多個拷貝的核酸，所產(chǎn)生的核酸也稱為擴(kuò)增子。擴(kuò)增子任選地含有存在于引物中但不存在于原始DNA模板中的核酸序列。這些引 物來源的核酸增加了功能性，例如用于其他擴(kuò)增反應(yīng)的引物結(jié)合位點(diǎn)，和/或與底物進(jìn)行
8化學(xué)鍵合的官能團(tuán)。舉例而言，擴(kuò)增方法包括PCR、連接反應(yīng)介導(dǎo)的PCR(LM-PCR)、phi_29PCR和其他 核酸擴(kuò)增方法，例如，如 C. W. Dieffenbachet al. , PCR Primer :A Laboratory Manual, Cold Spring HarborLaboratory Press,2003 ；禾口V. Demidov et al. ,DNA Amplification Current Technologies and Applications, Taylor & Francis, 2004 中所述?？梢允褂镁唧w的DNA模板來源和核酸擴(kuò)增方法的多種結(jié)合。術(shù)語“寡核苷酸引物”指能夠在合適的反應(yīng)條件下?lián)?dāng)引物延伸產(chǎn)物合成的起始 位點(diǎn)的核酸。寡核苷酸引物的長度通常為約10-30個連續(xù)的核苷酸。寡核苷酸引物與模板 核酸的一個區(qū)域完全互補(bǔ)或者基本互補(bǔ)，因而使得在雜交條件下，寡核苷酸引物與模板核 酸的互補(bǔ)區(qū)域退火。合成引物延伸產(chǎn)物的合適反應(yīng)條件包括存在合適的反應(yīng)組分(包括但 不限于聚合酶和核苷三磷酸)。對于適合用于擴(kuò)增反應(yīng)中的寡核苷酸引物的設(shè)計為本領(lǐng)域 所熟知，例如如 A. Yuryev et al.，PCR Primer Design, Humana Press, 2007 中所述。術(shù)語“簡并寡核苷酸引物”指含有具有隨機(jī)或者半隨機(jī)核苷酸序列的核酸的引物。 對于適合用于具體的核酸擴(kuò)增反應(yīng)的簡并寡核苷酸引物的設(shè)計為本領(lǐng)域所熟知，例如如 A. Yuryev et al.，PCR PrimerDesign,Humana Press，2007 中所述?？梢允褂镁哂写蠹s 5—8 個核苷酸的隨機(jī)或半隨機(jī)核苷酸序列。在其他實(shí)施方案中，隨機(jī)或半隨機(jī)核苷酸六聚體包 含在用于第一擴(kuò)增反應(yīng)的簡并寡核苷酸引物中。在具體的實(shí)施方案中所使用的簡并寡核苷酸引物每一個均包含一個5'恒定 DNA區(qū)段、一個中間隨機(jī)DNA區(qū)段和一個3'錨定區(qū)段，例如如Fiegler et al.，Genes Chromosomes Cancer,36 (4) :361_74,2003 ；禾口 Telenius, et al. , Genomics 13 :718_25, 1992中所述。5'恒定DNA區(qū)段任選地具有在所有DOP中均相同的核苷酸序列。3'錨 定區(qū)段任選地具有這樣的核苷酸序列，即所述核苷酸序列經(jīng)測定在模板核酸中具有所需 出現(xiàn)頻率。對具體的核酸序列出現(xiàn)頻率的分析為本領(lǐng)域所熟知，例如如Milosavljic， A. and Jurka, J.,1993, Comput. Applic. Biosci. , 9 407-411 ；Pesole, G. et al. ,1992, Nucleic acids, Res. ,20 :2871_2875 ；禾口 Hutchinson, G. B. ,1996, Comput. Appl. Biosci., 12 391-398 中所述。在具體的實(shí)施方案中，DOP含有約17-25個連續(xù)的核苷酸，其中約7-12個連續(xù)的核 苷酸包含于5'恒定DNA區(qū)段之中，約5-8個連續(xù)的核苷酸包含于隨機(jī)DNA區(qū)段中，約5_8 個連續(xù)的核苷酸包含于3’錨定區(qū)段中。第一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生含有多個擴(kuò)增子的第一反應(yīng)產(chǎn)物。第一反應(yīng)產(chǎn)物中的各個擴(kuò)增 子均含有與DNA模板的隨機(jī)部分相同或者完全互補(bǔ)的一段DNA序列以及與第一種反應(yīng)引物 的5 ‘恒定DNA序列相同的一段DNA序列。本文中使用的術(shù)語“互補(bǔ)的”指核苷酸之間的沃森-克里克堿基配對，具體地指 核苷酸通過氫鍵彼此鍵合，胸腺嘧啶或尿嘧啶殘基通過兩個氫鍵與腺嘌呤殘基相連，而胞 嘧啶和鳥嘌呤殘基通過三個氫鍵相連。通常，核酸所包含的核苷酸序列被描述為與指定的 第二核苷酸序列具有某一“百分比的互補(bǔ)度”。例如，一段核苷酸序列可以與指定的第二 核苷酸序列具有80%、90%或100%的互補(bǔ)度，這表明一段10個核苷酸的序列中有8個、9 個或者10個核苷酸與所述指定的第二核苷酸序列互補(bǔ)。例如，核苷酸序列3' -TCGA-5' 與核苷酸序列5' -AGCT-3 ‘ 100%互補(bǔ)。另外，核苷酸序列3' -TCGA-與核苷酸序列
95' -TTAGCTGG-3'的一個區(qū)域100%互補(bǔ)或完全互補(bǔ)。參照圖1，使用第一反應(yīng)產(chǎn)物擴(kuò)增子作為模板DNA進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)(3)。第二擴(kuò) 增反應(yīng)⑶，包括“通用”寡核苷酸引物，之所以這樣稱謂是因為該通用引物與在第一擴(kuò)增反 應(yīng)中使用的DOP的5'恒定DNA區(qū)段相同或者完全互補(bǔ)。通用寡核苷酸引物包含在第一擴(kuò) 增反應(yīng)中使用的DOP的5'恒定DNA區(qū)段，所述DNA區(qū)段位于該通用引物的3'末端。通用 寡核苷酸引物任選地在其5’末端含有其他連續(xù)的核苷酸。在一個具體的可選方案中，在通用寡核苷酸引物的5’端含有一個官能團(tuán)，用于將 由第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子連接至編碼固體或半固體基底如編碼顆粒。例如，在通用寡 核苷酸引物的5’端含有一個胺基團(tuán)。在另一個可選方案中，可以對由第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的 擴(kuò)增子進(jìn)行修飾，從而使其含有用于鍵合至固體或者半固體基底的官能團(tuán)。修飾核酸從而 使其含有能夠鍵合至固體或者半固體基底的官能團(tuán)為本領(lǐng)域所熟知。在具體的實(shí)施方案中，與顆粒相連的每一個擴(kuò)增子均含有與模板DNA序列的一個 隨機(jī)部分相同的一個DNA區(qū)段。每一個擴(kuò)增子均還含有一個恒定DNA區(qū)段，所述恒定DNA 區(qū)段同所述與模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的DNA區(qū)段毗鄰的。擴(kuò)增子的恒定DNA區(qū) 段任選地含有一個用于連接擴(kuò)增子與編碼顆粒的末端官能團(tuán)。在一個具體的實(shí)施方案中， 擴(kuò)增子的恒定DNA區(qū)段含有一個用于連接擴(kuò)增子和編碼顆粒的5'末端胺基團(tuán)。如圖1所示，將作為第二反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增子固定于第一種多個編碼顆粒上(4)。第 二擴(kuò)增反應(yīng)的擴(kuò)增子與所述編碼顆粒的結(jié)合可通過多種可有效地將核酸與固體或者半固 定基底相連的方法中的任何一種來實(shí)現(xiàn)，所述方法例如包括吸附和化學(xué)鍵合。擴(kuò)增子可以 與編碼顆粒的材料直接鍵合，或者與編碼顆粒間接鍵合，例如通過鍵合至分布于顆粒上的 包衣或接頭。可以合成擴(kuò)增子，并且/或者在合成后對其進(jìn)行修飾，從而使其含有一個用于 將擴(kuò)增子鍵合到顆粒上的官能團(tuán)。例如，擴(kuò)增子可以含有羰基、胺、氨基、羧酸基團(tuán)、鹵素、 酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和/或甲苯磺?；倌軋F(tuán)。與擴(kuò)增子相連的顆?？梢詾閿U(kuò)增子可以與之連接的任何固體或者半固體顆粒，該 顆粒適合多重分析，并且在雜交和檢測條件下是穩(wěn)定且不溶的。顆?？梢詾槿魏涡螤?如 圓柱形、球形等)、尺寸、組成或具有任何理化特征?？梢詫︻w粒尺寸或組成進(jìn)行選擇，從而 使得顆?？梢栽诶缇哂刑囟讖降倪^濾器上或者通過一些其他的物理性質(zhì)(如磁性)與 流體相分離。所使用的微粒如微球的直徑可以小于一毫米，例如，直徑的尺寸范圍為約0. 1 至約1，000微米(包括端值)，如直徑為約3-25微米(包括端值)，或者直徑為約5-10 微米(包括端值)。所使用的納米顆粒如納米小球的直徑可為約1納米(nm)至約 100, OOOnm(包括端值)，例如，尺寸范圍為約10-1，OOOnm(包括端值)，或者例如，尺寸范圍 為200-500nm(包括端值)。在某些實(shí)施方案中，所使用的顆粒為小球，特別是微球和納米小 球。舉例來說，顆粒為有機(jī)或無機(jī)顆粒，如玻璃或金屬顆粒，并且可以為合成的或者天 然的聚合物的顆粒，所述聚合物如聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚硅酮(silicon)、尼龍、纖維素、瓊 脂糖、葡聚糖和聚丙烯酰胺。在具體的實(shí)施方案中，顆粒為乳膠小球。在具體的實(shí)施方案中，所使用的顆粒含有用于連接擴(kuò)增子的官能團(tuán)。例如，顆?？?以含有羰基、胺、氨基、羧酸基團(tuán)、鹵素、酯、醇、脲、醛、氯甲基、氧化硫、一氧化氮、環(huán)氧基和
10/或甲苯磺酰基官能團(tuán)。顆粒的官能團(tuán)、對其的修飾及其與化學(xué)部分(如核酸)的連接為 本領(lǐng)域所熟知，例如如 Fitch, R. Μ. , Polymer Colloids :AComprehensive Introduction, Academic Press, 1997中所述。美國專利No. 6，048, 695描述了一種用于將核酸探針如擴(kuò)增 子連接到基底如顆粒上的示例性方法。在另一個具體的實(shí)例中，1-乙基-3_[3-二甲基氨丙 基]碳二亞胺鹽酸鹽(EDC或EDAC化學(xué)品)可以用來連接擴(kuò)增子和編碼顆粒。編碼顆粒為基于某個特征可以與其他顆粒區(qū)分開的顆粒，所述特征例如包括光學(xué) 性質(zhì)如顏色、反射指數(shù)和/或壓印圖案或光學(xué)可檢測的圖案。例如，可以使用光學(xué)標(biāo)簽、化 學(xué)標(biāo)簽、物理標(biāo)簽或者電子標(biāo)簽來編碼顆粒。編碼顆?？梢院幸粋€或者多個熒光團(tuán)或與 之相連，所述熒光團(tuán)可以通過例如激發(fā)和/或發(fā)射波長、發(fā)射強(qiáng)度、激發(fā)態(tài)壽命或這些的組 合、或者其他光學(xué)特征進(jìn)行區(qū)分?？梢允褂霉鈱W(xué)條形碼來對顆粒進(jìn)行編碼。在具體的實(shí)施方案中，一個顆粒系列的各顆粒均用相同的代碼進(jìn)行編碼，從而使 得一個顆粒系列的各顆粒都可以與另一個顆粒系列的各顆粒區(qū)分開。在其他實(shí)施方案中， 可以對單個顆粒系列使用兩種或者多種代碼。例如，各顆粒都可以含有獨(dú)特的代碼。在某 些實(shí)施方案中，顆粒編碼包括一個代碼，但不包括顆粒與對基因組DNA特異的核酸探針之 間的聯(lián)系，或者兼而有之。在具體的實(shí)施方案中，代碼鑲嵌在例如顆粒內(nèi)部，或者以在雜交和分析期間穩(wěn)定 存在的方式與顆粒相連?？赏ㄟ^任何可檢測的方式提供代碼，如通過全息編碼，通過熒光性 質(zhì)、顏色、形狀、尺寸、光發(fā)射、量子點(diǎn)發(fā)射等，以鑒定顆粒，并由此鑒定固定于其上的捕獲探 針。在一些實(shí)施方案中，代碼不是由核酸提供的。一個示例性平臺利用浸漬于聚合物顆粒內(nèi)的熒光染料的混合物，作為鑒定固定有 特定俘獲探針的顆粒系列的每個成員的工具。另一個示例性平臺使用全息條碼來鑒定圓 柱形玻璃顆粒。例如，Chandler等人(美國專利No. 5，981，180)描述了一種基于顆粒的 系統(tǒng)，其中不同的顆粒類型由不同比例的兩種或多種浸漬于聚合物顆粒內(nèi)的熒光染料的混 合物編碼。Soini (美國專利No. 5，028，545)描述了一種基于顆粒的多重分析系統(tǒng)，該系 統(tǒng)采用時間分辨熒光進(jìn)行顆粒鑒定。Fulwyler(美國專利No. 4，499，052)描述了一種使 用通過顏色和/或尺寸區(qū)分的顆粒的示例性方法。美國專利申請公開文本20040179267、 20040132205、20040130786、20040130761、20040126875、20040125424 和 20040075907 描述 了由全息條碼編碼的示例性顆粒。美國專利No. 6，916，661描述了與納米顆粒有關(guān)的聚合 物微粒，所述納米顆粒具有為顆粒提供代碼的染料。盡管本文詳細(xì)描述的一個實(shí)施方案利用的是Luminex編碼小球平臺，但是也可以 使用其他類型的編碼顆粒分析平臺，如VeraCode小球和BeadXpress系統(tǒng)(Illumina Inc.， San Diego CA)、xMAP 3D (Luminex)等?？梢允褂么判訪uminex小球，該小球使得可以使用 板狀磁鐵和移液管而不使用過濾板和多頭抽真空裝置進(jìn)行洗滌步驟。這其中的每一個平臺 通常都以羰基小球的形式提供，但是也可以對其進(jìn)行構(gòu)建，從而使其含有不同的偶聯(lián)化學(xué) 組成，如氨基-硅烷。通常，作為第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的擴(kuò)增子是雙鏈的，并且該雙鏈的擴(kuò)增子與顆粒 相連。因此，所述雙鏈擴(kuò)增子的兩條鏈都呈現(xiàn)于每一個顆粒之上。在將擴(kuò)增子固定于顆粒 之后使其變性成為單鏈，以進(jìn)行制備，從而用于分析方法的具體實(shí)施方案中。任選地，在固 定之前使雙鏈擴(kuò)增子變性，然后將單鏈的擴(kuò)增子與顆粒相連。
如所述，第一和第二擴(kuò)增反應(yīng)兩者中的每一個擴(kuò)增子均含有與模板DNA序列的一 個隨機(jī)部分相同的一段核酸序列，結(jié)果使由第一擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子合在一起基本上代 表完整的模板DNA序列，由第二擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)生的擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板 DNA序列。用于分析基因組DNA的第一顆粒系列和第一試劑為連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所 述擴(kuò)增子是第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，其合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完 整基因組DNA序列。在具體的實(shí)施方案中，與顆粒相連的每一個擴(kuò)增子的長度范圍為約500-1200個 核苷酸(包括端值)。因此，通過所連的由所述模板擴(kuò)增得到的相對較小的擴(kuò)增子，相對較 大的模板核酸基本完整地呈現(xiàn)于一個系列的編碼顆粒之上。如上文所述，各顆粒系列均含有連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所述擴(kuò)增子是第二擴(kuò) 增反應(yīng)的產(chǎn)物，其合在一起基本上代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA序 列。含有擴(kuò)增子的顆粒數(shù)目取決于諸多因素如模板尺寸、擴(kuò)增子尺寸以及可用于將擴(kuò)增子 連接到顆粒之上的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)目，所述含有擴(kuò)增子的顆粒數(shù)目足以使得合在一起基本上 代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA序列。通常，足以使得合在一起基本上 代表在第一擴(kuò)增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA的顆粒數(shù)目的范圍為約1-10，000 (包括 端值)O使用第二種基因組DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增并將作為第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的擴(kuò)增子(如 上所述)連接至第二種多個編碼顆粒，形成了另外的顆粒系列。所述第二種多個編碼顆粒 可檢測地不同于所述第一種多個編碼顆粒，從而形成用于分析基因組DNA的第二編碼顆粒 系列和第二試劑。類似地，將第三種或后續(xù)的基因組DNA模板用于形成擴(kuò)增反應(yīng)的反應(yīng)產(chǎn)物，并將 該反應(yīng)產(chǎn)物連接至第三種或后續(xù)的多個編碼顆粒。所述第三種或后續(xù)的多個編碼顆粒的每 一種均可檢測地不同于其他每一種的多個編碼顆粒，從而獲得用于分析基因組DNA的第三 或后續(xù)的編碼顆粒系列和第三或后續(xù)的試劑。多重試劑某些實(shí)施方案提供了一種用于分析基因組DNA的多重試劑，所述多重試劑包含兩 個或多個顆粒系列的混合物。在具體的實(shí)施方案中，每一編碼顆粒系列的各個編碼顆粒均 可檢測地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各個編碼顆粒。每一編碼顆粒系列均連接有擴(kuò)增 子，所述擴(kuò)增子為如本文所述的第二擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物，并且合在一起基本上代表在第一擴(kuò) 增反應(yīng)中用作模板的完整基因組DNA序列，其中其他各編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子代表另 外不同的基因組模板。一個具體實(shí)施方案的一種多重試劑包括連接有擴(kuò)增子的第一編碼顆粒系列和連 接有擴(kuò)增子的第二編碼顆粒系列，所述與第一編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子合在一起基本上 代表插入第一細(xì)菌人工染色體中的完整模板DNA序列，而所述與第二編碼顆粒系列相連的 擴(kuò)增子合在一起基本上代表插入第二細(xì)菌人工染色體中的完整模板DNA序列。例如，與第一編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子含有與人13號染色體DNA的一部分相同 的核酸序列，而與第二編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子含有與人18號染色體DNA的一部分相同 的核酸序列。與第三或后續(xù)的編碼顆粒系列相連的擴(kuò)增子含有與人的另一染色體或染色體
12的另一非重疊區(qū)域的DNA相同的核酸序列。本文所描述的多重試劑可以在單個分析中同時分析多個靶標(biāo)，如多個基因組座位 (genomic loci)0通過至少混合第一編碼顆粒系列和第二編碼顆粒系列形成用于分析基因組DNA 的多重試劑。圖2示出了一種形成多重試劑的方法的一個實(shí)施方案。如圖所示，任何數(shù)目“m” 的編碼顆粒系列均可以包含在所述多重試劑中。因此，例如，“m”可以為至少2、3、4、5、10、 15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100 或 200 個不同的編碼顆粒 系列。一個系列連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒與一個或者多個其他系列連接有擴(kuò)增子的編碼顆 粒聯(lián)合形成用于分析樣本中基因組獲得和丟失的多重試劑。分析方法分析基因組DNA的方法包括提供連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒，所述擴(kuò)增子合在一起 基本上代表完整的模板基因組核酸。在具體的實(shí)施方案中，提供了連接有擴(kuò)增子的編碼顆 粒，所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表不止一個拷貝的完整的模板基因組核酸。準(zhǔn)備用于分析基因組獲得和/或丟失的基因組DNA樣本用可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。 參照DNA也用可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，用于與樣本DNA進(jìn)行比較。樣本和參照DNA可以用相 同的或者不同的可檢測標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，這取決于所使用的分析安排。例如，在具體的實(shí)施方 案中，用不同的可檢測標(biāo)記所標(biāo)記的樣本和參照DNA可以在同一容器中一起使用，用于同 與編碼顆粒相連的擴(kuò)增子雜交。在其他實(shí)施方案中，用相同的可檢測標(biāo)記所標(biāo)記的樣本和 參照DNA可以在分開的容器中使用，用于同與顆粒相連的擴(kuò)增子雜交。術(shù)語“可檢測標(biāo)記”指可提供可檢測信號并且可以與核酸連接的任何原子或部分 (moiety)。所述可檢測標(biāo)記的實(shí)例包括熒光部分、化學(xué)發(fā)光部分、生物發(fā)光部分、配體、磁性 顆粒、酶、酶底物、放射性同位素和生色團(tuán)。多種標(biāo)記樣本和參照DNA的方法中的任何一種方法均可以用于本分析中，如DNA 的缺口平移或化學(xué)標(biāo)記。例如，通過使用如下的核苷酸進(jìn)行聚合反應(yīng)可以弓I入可檢測標(biāo)記， 所述核苷酸包括至少一些經(jīng)修飾的核苷酸，如修飾后含有生物素、地高辛、熒光素或花菁的 核苷酸。在一些實(shí)施方案中，通過隨機(jī)引物法和聚合反應(yīng)引入可檢測標(biāo)記。其他實(shí)例包括 缺 口平移(Roche Applied Science, IndianapolisInd. ； Invitrogen, Carlsbad Calif.)禾口 化學(xué)標(biāo)記(Kreatech ULS, Amsterdam NL)。對核酸的可檢測標(biāo)記為本領(lǐng)域所熟知，并且可 以使用適合標(biāo)記基因組DNA的任何標(biāo)記方法。在又另一個實(shí)施方案中，避免用可檢測標(biāo)記對樣本和參照DNA單獨(dú)地進(jìn)行共價標(biāo) 記。例如，未標(biāo)記的基因組DNA樣本與固定至編碼顆粒的擴(kuò)增子雜交。事先標(biāo)記的報告序 列也在與所述擴(kuò)增子的俘獲探針序列相鄰但不重疊的序列處與該擴(kuò)增子_樣本DNA復(fù)合物 和擴(kuò)增子_參照DNA復(fù)合物雜交。所述經(jīng)標(biāo)記的報告序列可以在同一或者不同的雜交反應(yīng) 中被雜交。通過這種方式，所述經(jīng)標(biāo)記的報告序列可以在更大規(guī)模的環(huán)境中被大量生產(chǎn)，與 在分析時單獨(dú)地標(biāo)記每一個樣本相比，降低了每個分析的成本?！皹颖尽焙汀皡⒄铡被蚪MDNA可以獲自任何適合的來源。本文描述的具體方法包 括使用受試個體的樣本基因組DNA?；蚪M樣本和/或參照DNA可以從幾乎任何的組織中 提取，所述組織包括但不限于血液、羊水、實(shí)體瘤、活檢器官、頰部拭子、絨毛膜絨毛、胚泡和
13卵裂球、妊娠物、唾液、尿液等。從經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的病理學(xué)樣本提取的 留存樣本同樣也是利用此方法分析的樣本基因組DNA的來源。樣本和/或參照基因組DNA 還可以獲自體外來源如細(xì)胞系。從這些來源或其他來源獲得基因組DNA的方法為本領(lǐng)域所 熟知。在具體的實(shí)施方案中，就待分析的樣本DNA的具體特征來對參照DNA進(jìn)行表征。 例如，如果打算對樣本DNA進(jìn)行分析，以檢測具體基因或染色體座位的復(fù)制情況，則對參照 DNA進(jìn)行表征，從而獲知有多少個拷貝的該基因或者座位包含在參照DNA中。通常，使用來 自相同物種的樣本和參照DNA?？梢允褂帽疚乃龅姆治鰜頇z測或者表征與染色體獲得或丟失相關(guān)的障礙。先天 的或者天生的障礙包括全部染色體的三體性、較小基因組座位(大約200kb至20mb)的擴(kuò) 增或缺失以及亞端粒區(qū)域或著絲粒區(qū)域的擴(kuò)增或缺失。許多癌癥的特征也在于可能與類 型、階段、藥物抗性或治療響應(yīng)有關(guān)的染色體獲得和丟失?？梢允褂帽痉椒ň腿旧w穩(wěn)定性 對實(shí)驗室細(xì)胞系(包括干細(xì)胞系)進(jìn)行表征。盡管本文所描述的方法和組合物主要涉及來源于人的核酸，但是可以理解的是， 也可以將本文所述的方法和組合物用于分析來源自許多生物體中的任一種的分析樣本基 因組DNA，所述生物體包括但不限于非人類的靈長類、嚙齒動物、兔、狗、貓、馬、牛、豬、山羊 和綿羊。還可以分析非哺乳動物來源的樣本DNA，舉例來說，包括魚和其他水生生物、鳥類、 禽類、細(xì)菌、病毒、植物、昆蟲、爬行類、兩棲類、真菌和分支桿菌。與編碼顆粒相連的擴(kuò)增子與受試個體的可檢測地標(biāo)記的樣本基因組DNA雜交，由 此實(shí)現(xiàn)所述擴(kuò)增子DNA與所述可檢測地標(biāo)記的樣本基因組DNA的特異性雜交。此外，與編 碼顆粒相連的DNA序列與可檢測地標(biāo)記的參照基因組DNA雜交，由此實(shí)現(xiàn)所述擴(kuò)增子DNA 和所述可檢測地標(biāo)記的參照基因組DNA的特異性雜交。術(shù)語“雜交”是指互補(bǔ)核酸的配對和結(jié)合。出現(xiàn)在兩個核酸之間的雜交程度因諸 如核酸的互補(bǔ)程度、核酸的解鏈溫度Tm和雜交條件的嚴(yán)格度等因素而異，正如本領(lǐng)域所 熟知的那樣。術(shù)語“雜交條件的嚴(yán)格度”指與具體的常用添加劑(如甲酰胺和Denhart’ s 溶液)相關(guān)的雜交介質(zhì)的溫度、離子濃度和組成條件。與特定核酸相關(guān)的具體雜交條件 的確定是常規(guī)的，并且為本領(lǐng)域所熟知，例如如J. Sambrook andD. W. Russell, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press ；3rd Ed. ,2001 ； 禾口 F. Μ· Ausubel, Ed. , ShortProtocols in Molecular Biology, Current Protocols ；5th Ed.，2002中所述。高嚴(yán)格度的雜交條件為僅允許基本互補(bǔ)的核酸進(jìn)行雜交的那些雜交條 件。通常，互補(bǔ)度為約85-100%的核酸被認(rèn)為是高度互補(bǔ)的，會在高嚴(yán)格度條件下雜交。中 嚴(yán)格度條件的實(shí)例有互補(bǔ)度居中(互補(bǔ)度為約50-84%)的核酸以及互補(bǔ)度高的核酸進(jìn)行 雜交的條件。相反，低嚴(yán)格度的雜交條件為互補(bǔ)度低的核酸進(jìn)行雜交的那些雜交條件。術(shù) 語“特異性的雜交”和“特異性地雜交”是指一具體的核酸與樣本中的目標(biāo)核酸進(jìn)行雜交， 但基本不與目標(biāo)核酸之外的核酸雜交。所述分析可以在任何合適的容器中進(jìn)行。在具體的實(shí)施方案中，例如，在準(zhǔn)備分析 多個樣本時，可以使用多室容器。舉例說來，多室容器包括多坑基底，如載玻片、硅片或硅盤 (silicon tray) 0在一些實(shí)施方案中，將每個樣本放于多孔板不同的孔之中。例如，多孔板 可以是96-孔、384-孔或1024-孔分析板。
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還包括對第一信號的檢測以及對第二信號的檢測，所述第一信號指示所連接的 DNA序列與受試個體的可檢測地標(biāo)記的基因組DNA的特異性雜交，所述第二信號指示所連 接的DNA序列與可檢測地標(biāo)記的參照基因組DNA的特異性雜交。可以使用任何合適的方法來檢測同與編碼顆粒相連的擴(kuò)增子雜交的樣本和參照 DNA的可檢測標(biāo)記，舉例說來，所述方法包括光譜法、光學(xué)法、光化學(xué)法、生物化學(xué)法、酶學(xué) 法、電學(xué)法和/或免疫化學(xué)法。通過評估一個或者多個可檢測標(biāo)記的信號，可以檢測每個顆粒指示雜交程度的信 號。通常對顆粒逐個進(jìn)行評估。例如，可以使顆粒通過流式細(xì)胞儀。示例性流式細(xì)胞儀包括 Beckman Coulter 公司(Fullerton Calif.)的Coulter Elite-ESP流式細(xì)胞儀或FACScan. TM.流式細(xì)胞儀，以及 Cytomation，Inc.，F(xiàn)ort Collins, Colo 的 M0FL0. TM.流式細(xì)胞儀。 除了流式細(xì)胞術(shù)之外，還可以將離心機(jī)用作顆粒分離和歸類的工具。一個合適的系統(tǒng)為描 述于美國專利No. 5，926，387中的系統(tǒng)。除了流式細(xì)胞術(shù)和離心之外，還可以將自由流動電 泳裝置用作顆粒分離和歸類的工具。一個合適的系統(tǒng)為描述于美國專利No. 4，310，408中 的系統(tǒng)。還可以將顆粒置于表面上，并進(jìn)行掃描或成像。所檢測的第一信號指示與編碼顆粒相連的DNA序列與受試個體的可檢測地標(biāo)記 的基因組DNA的特異性雜交。同時，檢測的第二信號指示與編碼顆粒相連的DNA序列與可 檢測地標(biāo)記的參照基因組DNA的特異性雜交。比較所述第一信號和所述第二信號，從而獲得有關(guān)受試個體的基因組DNA與參照 基因組DNA相比較的信息。在具體的實(shí)施方案中，將與一個或者多個顆粒系列的擴(kuò)增子雜交的參照DNA和樣 本DNA的可檢測標(biāo)記的信號比用來評估該樣本和參照DNA之間的差異，所述差異指示例如 基因組獲得和/或丟失。在某些實(shí)施方案中，參照DNA和樣本DNA與一個或者多個顆粒系 列的擴(kuò)增子在同一個容器(如多孔板的一個孔)中雜交。雜交之后，兩個標(biāo)記在一起分析， 即在雜交物中同時檢測兩個可檢測標(biāo)記，或者，將雜交物分成兩個(或者多個)部分，分別 地對每一個部分進(jìn)行評估，從而對可檢測標(biāo)記進(jìn)行檢測?？梢詫⒃u估結(jié)果用來提供所述兩 個可檢測標(biāo)記的信號比。這種方法可以使用競爭性雜交來對各分析之間的任何變異進(jìn)行標(biāo) 準(zhǔn)化在加入有相同顆粒的同一容器中同時分析參照和實(shí)驗樣本。任選地，可檢測地標(biāo)記的參照DNA和可檢測地標(biāo)記的樣本DNA與一個或多個顆粒 系列在不同的容器(如多孔板的不同孔)中雜交。可以獲得這兩個可檢測標(biāo)記的信號比， 以評估所述樣本DNA和參照DNA之間的差異。在使用這種方法時，幾個或者多個實(shí)驗樣本 可以共用一個參照樣本。對于每天涉及多個樣本的實(shí)驗，通過避免對多個雙份正常樣本進(jìn) 行標(biāo)記，可以節(jié)約試劑和人工成本。同時也沒有必要對樣本進(jìn)行處理從而獲得不同的部分 以便分別進(jìn)行分析。每個樣本都可以僅評價一次。在具體的實(shí)施方案中，通過其編碼信息來對編碼顆粒進(jìn)行鑒定，從而將顆粒編碼 情況與第一信號和第二信號聯(lián)系起來。因此，例如，將第一和第二信號與含有人13號染色 體DNA的第一編碼顆粒系列的編碼顆粒關(guān)聯(lián)。對所述與第一編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)的第一信號 和第二信號進(jìn)行比較，從而獲得受試個體13號染色體DNA與13號染色體參照DNA相比較的 信息。類似地，將第一和第二信號與含有人18號染色體DNA的第二編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)。對 所述與第二編碼顆粒系列關(guān)聯(lián)的第一信號和第二信號進(jìn)行比較，從而獲得受試個體18號
15染色體DNA與18號染色體參照DNA相比較的信息。本文的附圖和描述對最佳方式進(jìn)行了闡釋，但是可以用許多備選材料和方法進(jìn)行 替代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到合適的備選材料和方法，并且無需進(jìn)行過多試驗即可制 備和使用所述的組合物和方法。多種緩沖液和其他分析組分的組成均可被替代。用于培養(yǎng)、純化、擴(kuò)增、變性、偶聯(lián)、雜交、報告物連接、洗滌和小球處理的條件全都 可以由使用者來改變，從而適合具體類型的細(xì)胞、模板基因組DNA、樣本、所選報告物等。使用少到30ng的樣本DNA也可以很好地進(jìn)行本文實(shí)施例部分的分析。在生物學(xué)來 源產(chǎn)生的用于所述分析的DNA不足的情況下，可以通過許多全基因組擴(kuò)增(WGA)方法(如 DOP PCR或phi-29PCR)對樣本進(jìn)行擴(kuò)增。使用WGA處理的樣本時，可以以同樣的方法對參 照DNA進(jìn)行處理，從而使任何序列特異性擴(kuò)增的偏差均可以基本由樣本/參照的信號比來 校正。提供了用于分析DNA的試劑盒。在具體的實(shí)施方案中，提供了一種試劑盒，其含有 編碼顆粒系列和/或兩個或多個編碼顆粒系列的混合物。任選地，試劑盒含有使用編碼顆 粒系列和/或含有兩個或者多個編碼顆粒系列的多重試劑的說明材料。任選地，還含有輔 助試劑，如緩沖液、酶、洗滌溶液、雜交溶液、可檢測標(biāo)記、檢測試劑等。下文的實(shí)施例對用于分析的組合物和方法的實(shí)施方案進(jìn)行了闡釋。提供這些實(shí)施 例的目的是進(jìn)行說明，不能將其看作是對組合物和方法的范圍進(jìn)行限制。實(shí)施例實(shí)施例1用于基因組DNA分析的小球系列試劑的制備圖IA示出了由單個BAC克隆制備BAC擴(kuò)增子并將該擴(kuò)增子作為探針固定到一個 系列的編碼小球上的流程圖。在此實(shí)施例中，該系列中的小球全都具有相同的ID代碼。原料為活的BAC克隆材料(10)，即一段插入到大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞基因組內(nèi)的長 (通常為100-200kb)的人DNA序列。取出一小片冷凍的BAC甘油儲液材料，并將其用作標(biāo) 準(zhǔn)細(xì)菌細(xì)胞培養(yǎng)方法的原料(11)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的BAC培養(yǎng)方案，在37°C下于裝有35ml培養(yǎng)基 的50ml管中過夜培養(yǎng)細(xì)胞，并用抗生素進(jìn)行選擇。然后在4°C下將培養(yǎng)得到的細(xì)胞離心20 分鐘，使其離心到管底，取出并棄去上清液。將細(xì)胞沉淀重懸于含有RNase的緩沖液中，然 后使用LyseBlue (Qiagen，Valencia CA)和SDS裂解。以大約20，OOOg將裂解液(12)離心 (13)30分鐘，并收集上清(溶液中含有DNA)，棄去沉淀。將上清液重復(fù)離心15分鐘。收集 含有溶解的BAC DNA的澄清上清液，同時棄去離心到管底的細(xì)胞碎片、蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。 使用Qiagen基因組-Tip 20/G柱純化試劑盒，從上清液中提取和提純BAC DNA (17)。此試 劑盒含有純化柱(15)，以及洗滌和洗脫緩沖液(16)。洗脫之后，通過異丙醇(19)沉淀法將 現(xiàn)已高度純化的BAC DNA進(jìn)行沉淀并成為沉淀團(tuán)塊。產(chǎn)量通常是20至200ng的純化BAC DNA(18)。可以將此BAC DNA以干燥沉淀物形式儲存，或者重懸于水中，直接用于隨后的步 驟中。然后，使用兩輪聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，制備基本上代表各BAC DNA的完整序 列物的大量PCR擴(kuò)增子。第一輪PCR(20)是非特異性簡并寡核苷酸引物(DOP)的PCR，其 使用DOP引物混合物(21) ,DOP PCR聚合酶(22)和DOP PCR緩沖液(23)，并將上面制備的
16BAC DNA(IS)用作模板。第二輪PCR擴(kuò)增(25)利用針對DOP引物的已知序列基序的單個引 物。使用兩輪PCR來產(chǎn)生產(chǎn)量為大約20 μ g的擴(kuò)增子終產(chǎn)物(29)，用于隨后將擴(kuò)增子(29) 偶聯(lián)(32)至編碼小球(30)。如下制備擴(kuò)增子。制備50 μ 1各BAC DNA的第一 DOP PCR混合物，其含有10XD0P PCR 緩沖液5. 0 μ 1IOmMdNTP' s (每一種)Ι.ΟμΙ50mM MgCl5. 0 μ 110 μ M DOP 引物混合物(每一種)10. 0μ 120 至 50ng BAC DNA 模板2. 0 μ 1Platinum Taq 聚合Sl0. 5 μ 17jC21. 5μ 1總體積50. Ομ DOP PCR 緩沖液(23)含有 20mM Tris HCL(pH 8. 4)、50mMKCl 禾口 5mM MgCl。 dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)白勺&it 力 200 μ Μ。 Platinum TAQ M^B (Applied BioSystems)的濃度為 5 單位/μ 1。DOP 引物混合物(21)，參見 Fiegler et al. 2003, GenesChromosomes Cancer, 36 (4) :361_74，包括三個系列具有以下 22-mer 序列 的簡并寡核苷酸(Operon Biotechnologies, Huntsville AL)，其中N代表隨機(jī)的核苷酸5' CCGACTCGAGNNNNNNCTAGAA 3‘ SEQ ID No. 15' CCGACTCGAGNNNNNNTAGGAG 3‘ SEQ ID No. 25' CCGACTCGAGNNNNNNTTCTAG 3‘ SEQ ID No. 3其中N表示隨機(jī)的核苷酸。使用Qiagen基因組-Tip 20/G柱純化試劑盒，將溶于水的BACDNA模板(18)通過 柱純化法(17)純化。Platinum Taq 聚合酶(22) (Invitrogen, Carlsbad CA)的濃度為 5 單 位 / μ 1 ο根據(jù)以下溫度/時間條件，在GeneAmp 9700熱循環(huán)儀(AppliedBioSystems, Foster City CA)中進(jìn)行第一輪擴(kuò)增(20)3.0分鐘94 0C
1.5分鐘94 0C
2.5分鐘30°C，9個循環(huán)
0.10C/ 秒72 0C (斜率)
3.0分鐘72 0C
1.0分鐘94 0C
1.5分鐘62°C, 30個循環(huán)
2.0分鐘72 0C
8.0分鐘72 0C4.0°C (穩(wěn)定狀態(tài))然后，將第一輪DOP PCR(20)的擴(kuò)增子產(chǎn)物(24)用作第二輪PCR(25)的模板。第 二輪中的單一引物(26)具有針對第一輪(20)中使用的DOP引物的共有序列部分的特異
17性。此引物(26)經(jīng)胺修飾，從而使所得擴(kuò)增子(29)還在一個末端具有胺基團(tuán)，以有助于在 下一步中簡單地偶聯(lián)至編碼小球(32)。
0135]如下進(jìn)行第二輪PCR。
0136]制備100μ 1各BAC擴(kuò)增子模板的第二 PCR混合物，其含有
0137]10 X PCR 緩沖液10. Ομ
0138]IOmMdNTP' s (每一種)2. 0 μ 1
0139]50mM MgCl10. 0 μ 1
0140]10 μ M 胺引物15. Ομ
0141]模板(來自PCR#1)2. 0μ 1
0142]Platinum Taq0. 5 μ 1
0143]/K58. 5μ 1
0144]總體積100. Ομ
0145]PCR 2 緩沖液(28)含有 20mM Tris HCL(pH 8.4)、50mM KCl 禾口 5mM MgCl。 dNTP (Amersham Biosciences, Piscataway NJ)白勺&it 力 200 μ Μ。 Platinum TAQ
Applied BioSystems)的濃度為 5 單位 / μ 1。
0146]與胺相連的引物(Operon)具有以下序列。
0147]5' -GGAAACAGCCCGACTCGAG-3‘ SEQ ID Ν0. 4
0148]反應(yīng)(25)中的模板為來自上一輪DOP PCR(20)的DOP擴(kuò)增子。根據(jù)以下溫度/ 時間條件，在GeneAmp 9700熱循環(huán)儀(AppliedBioSystems)上進(jìn)行第二輪擴(kuò)增(25)
0149]10 分鐘 95 °C
0150]1.0 分鐘 95 °C
0151]1.5分鐘 60 °C，35個循環(huán)
0152]7.0 分鐘 72 °C
0153]10 分鐘 72 °C
0154]4.0°C (穩(wěn)定狀態(tài))
0155]然后，使用基于磁性小球的試劑盒(9)(PCR Clean Beads, Agencourt Bioscience Corp. , Beverley ΜΑ)，根據(jù)制造商的方案，純化此第二 PCR產(chǎn)物(29)。隨后將經(jīng)純化的擴(kuò) 增子(29)重懸于40μ1水中，并于-20°C下儲存，直至用于下文所述的小球偶聯(lián)步驟中。
以50 μ 1的標(biāo)準(zhǔn)小球濃度的規(guī)模，在Luminex羧基小球(30) (Luminex, Austin TX) 上進(jìn)行編碼小球偶聯(lián)過程(32)，以將所述擴(kuò)增子產(chǎn)物(29)作為探針DNA固定到編碼小球 的表面之上，得到大約650，000個小球。所述小球由聚苯乙烯制備，直徑大約為5. 6 μ m， 并由受控量的兩種或者多種熒光染料編碼，從而有助于在專用流式細(xì)胞儀讀取裝置上檢 測其小球ID。將50 μ 1的懸浮小球(30)(全都具有一個小球ID或區(qū)域)，從送遞它們的 Luminex管中轉(zhuǎn)移到一個1. 5mlEppendorf管進(jìn)行偶聯(lián)(32)，并通過渦旋和超聲處理來確保 懸浮。然后，以12，000RPM將小球離心3分鐘，并在不干擾小球沉淀物的情況下除去小球 緩沖上清液。將25μ1 MES緩沖液加入各小球管，然后進(jìn)行渦旋和超聲處理。另外地，將 10 μ g各BAC的PCR 2擴(kuò)增子(29)加入第二系列的1. 5ml離心管中，隨后將各管中的DNA 在 SpeedVac (ThermoFisher Scientific, Waltham ΜΑ)中徹底干燥。然后，將一份小球懸液 轉(zhuǎn)移到各DNA管中，并將各管渦旋和超聲處理5秒鐘進(jìn)行混合，仔細(xì)地跟蹤與各BAC有聯(lián)系的小球ID (區(qū)域)。接下來，將1. 5 μ 1剛?cè)芙獾腅DC (31) (1_乙基_3_ [ 二甲基氨丙基]_碳二亞胺鹽酸 鹽，Pierce，Rockford IL)以10mg/ml的濃度加入各管中，立即渦旋，并在室溫下避光(目 的是保留Luminex小球的熒光編碼)孵育30分鐘。在15分鐘時再次混合。然后再一次地 重復(fù)EDC添加、孵育和再次混合。然后，將500 μ 1 TNT 緩沖液(0. IM Tris ρΗ 7. 5,0. 15Μ NaCl, 0. 02% Tween 20) 加入各管中并進(jìn)行渦旋。然后在微型離心機(jī)上以12，OOORPM將所述管離心4分鐘，使小球 分布到底部，并小心地除去上清液。接下來，加入500 μ 1 0. 1% SDS，并且再以12，OOORPM 將小球離心4分鐘，小心地除去上清液。最后，將50μ 1 IXTE緩沖液(IOmM Tris ρΗ 7.5， ImM EDTA)加至各管，并進(jìn)行渦旋。該小球系列(33)——固定有擴(kuò)增子探針(29)——可以作為用于基因組DNA分析 的多重小球系列的一個組分納入。實(shí)施例2DNA分析用多重編碼小球系列試劑的制備圖2是示出將m個不同的編碼小球系列(各自具有各自的固定的BAC-擴(kuò)增子探 針DNA)混合在一起來制備多重編碼小球系列的流程圖。通過超聲處理、旋轉(zhuǎn)管容器、渦旋或類似方法，將編碼小球系列34、35、36和37制 成懸液。然后，使用移液管將各小球系列的整分試樣轉(zhuǎn)移到另一個容器中，各個小球系列在 該容器中合并和混合，然后變性(38)，從而有助于隨后在分析中與固定在所述小球上的探 針DNA的雜交。在一個詳盡的實(shí)施例中，將各50 μ 1的2個或多個小球系列——每一系列在一個 單獨(dú)的管子里，每一編碼小球系列均固定有探針DNA(33)——分批地合并到一個1. 5ml離 心管內(nèi)。在合并大約10個小球系列之后，將管離心，并小心除去上清液，目的是減少體積。 再次重復(fù)，直至合并所有的小球系列(例如，Luminex 200系統(tǒng)至多支持100個編碼小球ID 或區(qū)域)。在將所有的小球系列合并成為一個多重小球系列之后，將固定的探針DNA變性。 在對小球進(jìn)行離心并除去上清之后，加入500 μ 1 0. INNaOH，并在室溫下孵育2分鐘。然后 對小球進(jìn)行離心，并小心地除去上清。加入500 μ 1 IOmM Tris、15mM NaCL.O. 2% Tween 20， 渦旋該管，然后對小球進(jìn)行離心，并除去上清液。然后重復(fù)進(jìn)行此洗滌步驟。最后，用IXTE 緩沖液將體積調(diào)整為500 μ 1，并將此多重小球系列(39)在4°C下避光保存，直至用于分析 中。實(shí)施例3多重基因組獲得和丟失分析圖3A為展示一個實(shí)施方案的流程圖，所述實(shí)施方案包括使用多重編碼小球系列 對η個樣本進(jìn)行多重基因組獲得和丟失分析。在此實(shí)施例中，平行分析了兩個DNA樣本和兩個參照。事實(shí)上，可以同時地以微量 板形式平行分析幾十個樣本。也可以平行分析比此數(shù)目更多或者更少的樣本和參照。在此實(shí)施例中，將四個DNA樣本(40和41代表兩個參照，而42和43代表兩個分析 樣本)用生物素進(jìn)行酶學(xué)標(biāo)記并純化。參照樣本通常為正常男性和女性的合并樣本，如人
19類女性基因組DNA和人類男性基因組DNA (Promega，Madison WI)。將各DNA樣本和參照與 生物素標(biāo)記的核苷酸(45) (PerkinElmer，Boston ΜΑ)、非標(biāo)記核苷酸(49) (PerkinElmer)、 隨機(jī)引物(47) (Operon, Biotechnologies, Huntsville AL)和 Klenow 片段聚合酶(46) (Epicentre Biotechnologies,Madison WI)合并起來。孵育(44)之后，使用 DNA 柱純化試 劑盒(49)(如 Purelink DNA Mini Kit(Invitrogen))純化(50)反應(yīng)產(chǎn)物。大約 5 μ 1 的 約200ng/y 1經(jīng)標(biāo)記的樣本用于此分析隨后的雜交。然后，使各生物素標(biāo)記的樣本或參照(51-54)與固定在多重編碼小球系列(56)的 小球上的探針雜交(55)。使用了每個小球系列(各探針類型)的大約500個小球；在此55 重實(shí)施例中，使用了總共大約55X500 = 27，500個小球/雜交。因為編碼情況，各編碼小球系列的小球可以區(qū)別于其他編碼小球系列每一系列的 小球。此55個小球系列中的每一系列均含有多個編碼小球，與所述編碼小球相連的擴(kuò)增子 基本上代表完整的模板基因組DNA片段。各小球系列的模板DNA代表圖9所列的一個基因 組座位。雜交反應(yīng)中包括含有Cot-IDNA、甲酰胺、硫酸葡聚糖和1.9XSSC的雜交緩沖 液。總體積大約為15μ1，且反應(yīng)在PCR型硬質(zhì)微量板如Bio-Rad HSP 9631 (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA)的孔中進(jìn)行。使用鋁箔封口機(jī)(MSF 1001，Bio-Rad)嚴(yán)密地 封住該板，將蒸發(fā)降至最低。在1150rpm的微量板振蕩培養(yǎng)箱(Wallac NCS Incubator, PerkinElmer)中于50°C下過夜進(jìn)行雜交孵育(55)。在雜交孵育(55)之后，與四個樣本雜交的四個多重小球系列(58-61)就可以進(jìn) 行雜交洗滌(63)，然后與熒光報告物(65) —起孵育，再進(jìn)行報告物洗滌(67)。首先，將 ΙΟΟμ 1洗滌緩沖液a(2XSSC，50%甲酰胺)加入各孔之中，然后重新封閉該板，并在振蕩培 養(yǎng)箱(轉(zhuǎn)動速率為1150rpm)于50°C下孵育20分鐘。然后將各孔內(nèi)含物轉(zhuǎn)移到Millipore 0. 46 μ m HT 過濾板(Millipore,Billerica MA)。之后，使用 Millipore MSVMHTS00 多頭抽 真空裝置從各孔中真空除去液體。接下來，將100 μ 1洗滌緩沖液b(2XSSC，0. 1% Igepal 清潔劑)加入各孔，然后在50°C下再進(jìn)行一次為期20分鐘的振蕩孵育，并進(jìn)行真空抽吸。 隨后，將100 μ 1洗滌緩沖液c (0. 2 X SSC)加入各孔，并在50°C下重復(fù)為期20分鐘的振蕩孵 育，然后進(jìn)行真空抽吸。然后，將100 μ 1 IXPhycoLink SA溶液(鏈親和素-藻紅蛋白報告物)(64)加入 各孔。此報告物溶液是通過將 2 μ 1 500 XPhycoLink SAPJ13S (Prozyme, San Leandro CA) 混合到Iml報告物稀釋液中形成，其中所述稀釋液為1XPBS、0. BSA和0. 05% Tween 20。將此報告物溶液與多重小球系列在1050RPM的振蕩培養(yǎng)箱中于25°C下孵育30分鐘。 孵育之后，使用如前面的洗滌步驟中的多頭抽真空裝置從過濾板的孔中吸出溶液。然后用洗滌緩沖液d(66)將小球洗滌兩次(67)，所述洗滌緩沖液d為含0.01% Tween 20的1XPBS。將100 μ 1加入過濾板的各孔中，然后通過板孔底部的過濾器真空抽 吸掉液體。再一次加入100 μ 1，并在1050RPM的振蕩培養(yǎng)箱中于25°C下孵育2分鐘。所述 第二次洗滌并不進(jìn)行抽吸，而是用來懸浮小球以進(jìn)行讀數(shù)。之后，本實(shí)施例中的四個小球系列(68-71)即可在Luminex 200系統(tǒng)(Luminex Corporation, Austin TX)上讀數(shù)(72)。依次讀取各孔中的小球的信號和小球ID，并記錄 下各孔或樣本的各小球ID (小球區(qū)域)的前50個小球的熒光強(qiáng)度中值，并輸出到在一個數(shù)
20據(jù)文件(73)中。沒有發(fā)現(xiàn)小球交聯(lián)；設(shè)定Luminex讀數(shù)儀，使其分析各區(qū)域的50個小球， 并且并未記錄到失敗。圖4是96孔SBS標(biāo)準(zhǔn)微量板(80)的示意圖，其示出用于平行地對46個樣本進(jìn)行 分析的兩份參照和兩份樣本的示例性位置。各標(biāo)記樣本的兩份重復(fù)雜交可用于確?？酌芊?失敗情況下的數(shù)據(jù)形成，所述孔密封失敗會導(dǎo)致試劑從單個孔蒸發(fā)。在雙份重復(fù)沒有受到 影響時，該樣本仍然形成數(shù)據(jù)。使用此微量板和編碼小球方法，實(shí)驗員單人即可同時分析例 如46個樣本和2個參照，并且全都雙份重復(fù)進(jìn)行，在第一天進(jìn)行標(biāo)記，雜交過夜，并在第二 天進(jìn)行洗滌和讀數(shù)。或者，分析可以不重復(fù)進(jìn)行或者不止兩個重復(fù)地進(jìn)行。所示出的是雙 份的兩個參照(81和82)以及雙份的樣本，樣本的一個實(shí)例在83處標(biāo)示出。圖5是使用男性的13號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本形成數(shù)據(jù)的一 個實(shí)例。示于圖5底部的數(shù)字1-55列在圖9中。此數(shù)據(jù)由通過Luminex讀數(shù)儀獲得的各小球區(qū)域的中間熒光值計算得到。從所有 其他信號中減去陰性對照小球29、54和56的平均值(參見圖9)。然后，求出來自九個常染 色體克隆的信號與來自男性和女性參照DNA的相應(yīng)克隆信號的比值。計算標(biāo)準(zhǔn)化因子，從 而在將該因子應(yīng)用到所有的常染色體克隆信號之時，其使得平均的常染色體比值為數(shù)值1。 然后，將此標(biāo)準(zhǔn)化因子應(yīng)用到所有的樣本信號。將所得比值作圖，并示于圖5。請注意，13號染色體的克隆的比值全都在范圍1.3 至1. 6之間，而18和21號染色體的克隆以及其他常染色體克隆除了有一個之外全都低于 1.2。13號染色體中的三體性很容易顯現(xiàn)。同樣地，樣本與男性參照相比的比值圖(方塊數(shù) 據(jù)點(diǎn))對于X和Y性染色體實(shí)際上都是平坦的。此乃男性樣本所應(yīng)有的反應(yīng)。樣本與女性 參照相比較的圖(菱形數(shù)據(jù)點(diǎn))，對于X而言下移，而對于Y而言上升，這同樣也是男性樣本 應(yīng)有的反應(yīng)。圖6是使用男性的18號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實(shí)例。如針對圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。圖7是使用女性的21號染色體上具有三體性的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù) 的一個實(shí)例。如針對圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。圖8是使用X染色體5-拷貝擴(kuò)增的Coriell DNA樣本所形成的數(shù)據(jù)的一個實(shí)例。 如針對圖5所述的那樣，形成數(shù)據(jù)并作圖。圖9為一張圖表，其示出具有用于在示例性分析中形成擴(kuò)增子的人基因組DNA插 入物的BAC克隆、其染色體和cyto條帶位置、陰性對照寡核苷酸的序列以及各擴(kuò)增子探針 所固定的小球系列的小球ID(Luminex小球區(qū)域)。將圖5-8中χ軸上順序編號的作圖點(diǎn)與 圖9中自上而下列出的BAC關(guān)聯(lián)。將圖5-8中χ軸上順序編號的作圖點(diǎn)與圖9中自上而下 列出的BAC關(guān)聯(lián)。BAC RP11-186J16被固定到兩個不同的小球區(qū)域(42和86)。與人基因組沒有序列同源性的一個寡核苷酸被選擇作為陰性對照。所使用的具體 陰性對照寡核苷酸為5' GTCACATGCGATGGATCGAGCTC 3‘ SEQ ID No. 5 ；5' CTTTATCATCGTTCCCACCTTAAT 3' SEQ ID No. 6 ；5' GCACGGACGAGGCCGGTATGTT 3' SEQ ID No. 7。對與陰性對照寡核苷酸相連的三個小球區(qū)域29、54和56所形成的信號取平均值，并從所有其他小球信號中減去，然后再計算比值。本說明書中提及的任何專利或出版物均通過援引納入本文，其程度就如同每一份 出版物都逐一特別地被指出通過援引納入。以下申請均通過援引全文納入本申請2006年 12月22日提交的流水號為11/615，739的美國專利申請和2008年3月26日提交的流水號 為12/055，919的美國專利申請；以及2007年12月5日提交的流水號為60/992，489的美國 臨時專利申請、2005年12月23日提交的流水號為60/753，584的美國臨時專利申請、2005 年12月23日提交的流水號為60/753，822的美國臨時專利申請、2006年2月3日提交的流 水號為60/765，311的美國臨時專利申請和2006年2月3日提交的流水號為60/765，355 的美國臨時專利申請。本文描述的組合物和方法以示例的方式代表本發(fā)明的某些實(shí)施方案，而并無意于 限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到其改變以及其他用途。在不背離本發(fā)明權(quán)利 要求所列出的范圍的情況下，可以作出所述改變和其他用途。
權(quán)利要求
一種分析DNA樣本的方法，包括提供包含連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒的第一編碼顆粒系列，所述擴(kuò)增子包含合在一起基本上代表完整的第一種模板DNA序列的隨機(jī)核酸序列；使所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣本DNA雜交；使所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的參照DNA雜交；檢測指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣本DNA特異性雜交的第一信號，以及指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的參照DNA特異性雜交的第二信號；并且比較所述第一信號和所述第二信號，以檢測所述第一信號和所述第二信號之間的差異，所述第一信號和第二信號之間的差異指示所述樣本DNA和所述參照DNA之間的差異，由此分析所述DNA樣本。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增子的長度范圍為約500-1200個核苷酸，包括端值。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測地標(biāo)記的樣本DNA是獲自受試個體的可檢測地 標(biāo)記的DNA。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述可檢測地標(biāo)記的樣本DNA是獲自受試個體的可檢測地 標(biāo)記的基因組DNA。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述可檢測地標(biāo)記的樣本DNA是人DNA。
6.權(quán)利要求1的方法，還包括提供包含連接有擴(kuò)增子的編碼顆粒的第二編碼顆粒系列，所述擴(kuò)增子包含合在一起基 本上代表完整的第二種模板DNA序列的隨機(jī)核酸序列；使所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣本DNA雜交； 使所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的參照DNA雜交； 檢測指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的樣本DNA特異性雜交的 第一信號，以及指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的參照DNA特異性雜 交的第二信號；并且比較指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的特異性雜交的所述第一信號和指示所述 第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的特異性雜交的所述第二信號，以檢測所述第一信號和所述第 二信號之間的差異，所述第一信號和第二信號之間的差異指示所述樣本DNA與所述參照 DNA之間的差異。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述第一和第二編碼顆粒系列以混合物的形式提供，并且 還包括將所述第一編碼顆粒系列的編碼情況與指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢 測地標(biāo)記的樣本DNA特異性雜交的所述第一信號以及指示所述第一編碼顆粒系列的擴(kuò)增 子的特異性雜交的第二信號聯(lián)系起來；并將所述第二編碼顆粒系列的編碼情況與指示所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子與可檢 測地標(biāo)記的樣本DNA特異性雜交的所述第一信號以及所述第二編碼顆粒系列的擴(kuò)增子的 特異性雜交的所述第二信號聯(lián)系起來。
8.一種分析樣本DNA的方法，包括提供一種多重試劑，其包含經(jīng)編碼的兩個或更多個編碼顆粒系列的混合物，從而使每一編碼顆粒系列的各個顆粒均可檢測地區(qū)別于其他每一編碼顆粒系列的各個編碼顆粒，所 述編碼顆粒連接有由模板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子，將各編碼顆粒系列的每一種相比， 所述每一編碼顆粒系列連接有由不同的模板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子； 使所述連接的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的DNA雜交； 使所述連接的擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的參照DNA雜交； 檢測指示所述擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的DNA特異性雜交的第一信號； 檢測指示所述擴(kuò)增子與可檢測地標(biāo)記的參照DNA特異性雜交的第二信號； 鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第一信號聯(lián)系起來； 鑒定所述編碼顆粒，從而將顆粒編碼情況與所述第二信號聯(lián)系起來；和 比較各編碼顆粒系列的所述第一信號和所述第二信號，其中所述第一和第二信號的差 異指示所述樣本和參照DNA之間的差異，由此分析DNA。
9.權(quán)利要求8的方法，其中與各編碼顆粒系列相連的所述擴(kuò)增子含有合在一起基本上 代表完整的模板DNA序列的隨機(jī)核酸序列，其中所述完整的模板DNA序列比各個連接的擴(kuò) 增子都要大。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述完整的模板DNA序列的長度范圍為約20-300kb，包括 端值，并且各個連接的擴(kuò)增子包含與所述模板DNA序列的一部分相同的DNA序列，并且其長 度范圍為約500-1200個核苷酸，包括端值。
11.權(quán)利要求8的方法，其中所述可檢測地標(biāo)記的樣本DNA為獲自受試個體的可檢測地 標(biāo)記的DNA。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述可檢測地標(biāo)記的樣本DNA為獲自受試個體的可檢測 地標(biāo)記的基因組DNA。
13.權(quán)利要求8的方法，其中所述可檢測地標(biāo)記的樣本DNA為人DNA。
14.一種制備用于分析DNA的編碼小球系列的方法，包括a)使用一個DNA模板和第一種反應(yīng)寡核苷酸引物進(jìn)行第一擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生含有第 一擴(kuò)增子的第一反應(yīng)產(chǎn)物，多個所述第一種反應(yīng)引物中的每一個都包含一段可變的非特異 性簡并DNA序列和一段毗鄰的恒定DNA序列，其中各個第一擴(kuò)增子均包含一段與所述DNA 模板的一個隨機(jī)部分相同的DNA序列以及一段與所述第一種反應(yīng)引物的所述恒定DNA序列 相同的DNA序列；b)使用所述第一擴(kuò)增子的至少一部分作為模板DNA，并使用第二種反應(yīng)寡核苷酸引物 進(jìn)行第二擴(kuò)增反應(yīng)，從而產(chǎn)生含有第二擴(kuò)增子的第二反應(yīng)產(chǎn)物，所述第二種反應(yīng)寡核苷酸 引物包含所述第一種反應(yīng)引物的所述恒定DNA序列，其中各個第二擴(kuò)增子含有一段與所述 DNA模板的一個隨機(jī)部分相同的DNA序列以及一段與所述第一種反應(yīng)引物的所述恒定DNA 序列相同的DNA序列；c)將所述第二擴(kuò)增子與第一種多個編碼顆粒相連，從而產(chǎn)生用于分析DNA的編碼顆粒 系列。
15.權(quán)利要求14的制備用于分析DNA的試劑的方法，其中所述第二種反應(yīng)寡核苷酸引 物還含有用于與編碼顆粒反應(yīng)的官能團(tuán)。
16.權(quán)利要求14的制備用于分析DNA的試劑的方法，還包括重復(fù)a)-c)但其中使用 第二種DNA模板并將由此獲得的第二種擴(kuò)增子與第二種多個編碼顆粒相連，從而產(chǎn)生用于分析DNA的第二編碼顆粒系列，所述第二種多個編碼顆粒與所述第一種多個編碼顆粒具有 可檢測差異。
17.權(quán)利要求16的制備用于分析DNA的試劑的方法，還包括混合所述第一編碼顆粒系 列與所述第二編碼顆粒系列。
18.權(quán)利要求16的制備用于分析DNA的試劑的方法，還包括重復(fù)a)-c)但其中使用 第三種或后續(xù)的DNA模板，并將由此產(chǎn)生的第三種或后續(xù)的擴(kuò)增子與第三種或后續(xù)的多個 編碼顆粒相連，從而產(chǎn)生用于分析DNA的第三種或后續(xù)的編碼顆粒系列，所述第三種或后 續(xù)的多個編碼顆粒中的每一種均以可檢測方式不同于其余各種多個編碼顆粒。
19.權(quán)利要求18的制備用于分析DNA的試劑的方法，還包括混合所述第一編碼顆粒系 列、所述第二編碼顆粒系列、所述第三編碼顆粒系列和/或后續(xù)的編碼顆粒系列。
20.一種用于分析DNA的試劑，包括連接有由模板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子的多個編碼顆粒，各個連接的擴(kuò)增子均包含 一段與所述模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的DNA序列，其中所述擴(kuò)增子合在一起基本 上代表所述完整的模板DNA，并且其中各個擴(kuò)增子的與所述模板DNA序列的一個隨機(jī)部分 相同的核酸序列比所述完整的模板DNA要短。
21.權(quán)利要求20的試劑，其中所述完整的模板DNA序列的長度范圍是約20-300kb， 包括端值，并且各個連接的擴(kuò)增子均含有與所述模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的一段 DNA序列，其長度范圍為約500-1200個核苷酸，包括端值。
22.一種用于分析DNA的多重試劑，包括兩種或者更多種多個經(jīng)編碼的顆粒的混合物，這樣編碼使得每種多個顆粒的顆粒均可 檢測地區(qū)別于其他每種多個顆粒的顆粒，所述編碼顆粒連接有由模板DNA序列擴(kuò)增得到的 擴(kuò)增子，將各種多個編碼顆粒的每一種相比，所述每種多個編碼顆粒均連接有由不同的模 板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子，各個連接的擴(kuò)增子均包含一段與所述模板DNA序列的一個 隨機(jī)部分相同的DNA序列。
23.一種用于分析DNA的試劑盒，含有兩種或者更多種多個經(jīng)編碼的顆粒的混合物，這樣編碼使得每種多個顆粒的顆粒均可 檢測地區(qū)別于其他每種多個顆粒的顆粒，所述編碼顆粒連接有由模板DNA序列擴(kuò)增得到的 擴(kuò)增子，將各種多個編碼顆粒的每一種相比，所述每種多個編碼顆粒均連接有由不同的模 板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子，各個連接的擴(kuò)增子均包含一段與所述模板DNA序列的一個 隨機(jī)部分相同的DNA序列。
24.一種基本如本申請所述的用于分析DNA的方法。
25.—種基本如本申請所述的用于分析DNA的試劑。
26.—種基本如本申請所述的用于分析DNA的試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種針對染色體獲得和丟失的編碼小球多重分析，所述分析的益處是可將復(fù)雜的大型模板DNA來源(例如BAC DNA)作為探針材料，而沒有小球交聯(lián)或其他分析性能問題。本文描述了用于分析DNA的試劑，所述試劑含有連接有由模板DNA序列擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子的多個編碼顆粒。每個連接的擴(kuò)增子均含有與模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的一段核酸序列，其中所述擴(kuò)增子合在一起基本上代表完整的模板DNA，并且其中每個擴(kuò)增子的與模板DNA序列的一個隨機(jī)部分相同的核酸序列要比所述完整的模板DNA短。
文檔編號C12Q1/68GK101918596SQ200880125035
公開日2010年12月15日 申請日期2008年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月5日
發(fā)明者K·E·阿得勒, M·J·舍默爾 申請人:珀金埃爾默·拉斯公司