一種轉(zhuǎn)基因西瓜植株的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種轉(zhuǎn)化率高的轉(zhuǎn)基因西瓜植株 的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 從1983年轉(zhuǎn)基因植物誕生W來，植物基因工程成為發(fā)展最快、應(yīng)用潛力最大的生 物技術(shù)之一。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指把從動物、植物或微生物中分離到的目的基因，導(dǎo)入到目 的植物的基因組中，使之穩(wěn)定遺傳并賦予植物新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu) 質(zhì)等。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，具有易操作、低費(fèi)用、高 效率、外源基因在轉(zhuǎn)基因植物中的拷貝數(shù)低和遺傳穩(wěn)定等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，已成為轉(zhuǎn)基因策略中 的首選方法，在植物的遺傳轉(zhuǎn)化中廣泛應(yīng)用。
[0003] 西瓜（Citrulluslanatus(Thunb.)為葫蘆科一年生草本，是世界性重要瓜類蔬菜 作物。1994年韓國學(xué)者化oi等首次報道，利用農(nóng)桿菌LBA4404,將卡那霉素化anamycin) 抗性基因和GUS標(biāo)記基因轉(zhuǎn)入了 2個西瓜品種。隨后，許多研究者對西瓜遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行 了深入研究，將抗病、抗逆、耐貶藏等外源基因?qū)胛鞴?，并取得了相?yīng)進(jìn)展。但是西瓜仍 然被認(rèn)為是很難利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)取得成功轉(zhuǎn)化的物種，且轉(zhuǎn)化效率普遍偏 低。牛勝鳥等（2005)利用西瓜成熟胚子葉將小西葫蘆黃化花葉病毒狂ucchiniyellow mosaicvirus,ZYMV)復(fù)制酶基因、西瓜花葉病毒（Watermelonmosaicvirus,WMV)復(fù)制 酶基因?qū)胛鞴?，轉(zhuǎn)化效率為0.17% ;化〇等（2008)報道成功轉(zhuǎn)入bar、噸tll基因，轉(zhuǎn)化 效率為 0. 33 ~1. 16%;Huang等（HuangYC，QiiangCH，LiCH.Transgenicwatermelon linesexpressingthenucleocapsidgeneofwatermelonsilvermottlevirusand theroleofthiamineinreducinghyperhydricityinregeneratedshootsPlant CellTiss化gan化It, 2011，106:21 - 29)報道轉(zhuǎn)移西瓜銀斑病外銷蛋白基因的轉(zhuǎn)化效 率為 0.9 ~1.9% ;化等化1TA，QiiangCH，Wu冊，etal.Generationoftransgenic watermelonresistanttoZucchiniyellowmosaicvirusandPapayaringspotvirus typeW.PlantCellRep, 2011. 30:359-371)報道將小西葫蘆黃化花葉病毒外銷蛋白基因 和番木瓜環(huán)斑病毒外銷蛋白基因轉(zhuǎn)入西瓜，種子轉(zhuǎn)化效率為8. 5~10%，（由此推算出其外 植體切塊轉(zhuǎn)化效率約為1. 06%~1. 25% )。從已有的報道來看，不同研究者報道結(jié)論差異 較大，且普遍轉(zhuǎn)基因頻率低下。因此農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化技術(shù)在西瓜上的規(guī)模化應(yīng)用目前還 存在困難，現(xiàn)有技術(shù)不能滿足開展西瓜功能基因研究及遺傳改良的需要。
[0004] 目前西瓜全基因組測序及骨干育種材料的重測序工作已經(jīng)完成，大量功能基因有 待驗證，在此基礎(chǔ)上，將全面帶動西瓜分子育種工作的快速發(fā)展。該個形勢下，對建立一個 高效的西瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)提出了迫切需求。西瓜是公認(rèn)的較難轉(zhuǎn)化的作物之一，制約西瓜遺 傳轉(zhuǎn)化效率的因素主要是在西瓜轉(zhuǎn)基因過程中，普遍存在共培養(yǎng)結(jié)束后因農(nóng)桿菌過度生長 導(dǎo)致外植體生長不良；轉(zhuǎn)化細(xì)胞與再生細(xì)胞重疊性低；逃逸體形成頻率高，轉(zhuǎn)化芽頻率低； 再生株易玻璃化，生根困難等問題。該些問題是導(dǎo)致西瓜外植體轉(zhuǎn)基因植株生產(chǎn)率低的重 要原因，而在多數(shù)前人的研究工作中都沒有引起足夠重視，僅把主要研究點(diǎn)放在了激素種 類及濃度的配比使用上，取得的進(jìn)展依然有限，該需要從其他方面改進(jìn)技術(shù)，W建立高效穩(wěn) 定的轉(zhuǎn)基因西瓜的制備方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)化率高、轉(zhuǎn)基因植株生長健壯、存活率高的轉(zhuǎn)基因 西瓜植株的制備方法。
[0006] 本發(fā)明提供的一種轉(zhuǎn)基因西瓜植株的制備方法，包括W下步驟：
[0007] (1)含外源目的基因的農(nóng)桿菌菌液侵染西瓜成熟子葉外植體；
[000引 （2)侵染后，將外植體轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中培養(yǎng)，所述共培養(yǎng)基為=層無菌濾紙，加入 液體共培養(yǎng)基浸透濾紙；外植體置于濾紙之上共培養(yǎng)；
[0009] (3)共培養(yǎng)結(jié)束后，將步驟（2)的外植體轉(zhuǎn)移到含低濃度篩選劑的篩選培養(yǎng)基上 進(jìn)行篩選培養(yǎng)，之后逐漸提高篩選劑的濃度進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑選抗性外植體；
[0010] (4)將抗性外植體幼芽轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基繼續(xù)篩選，取生長良好的完整幼苗，轉(zhuǎn)入 生根培養(yǎng)基，幼苗生根后煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因西瓜植株。
[0011] 本發(fā)明方法中，步驟（1)所述的西瓜子葉外植體獲得方法為：取健康飽滿的西瓜 種子，剝?nèi)シN皮，避免傷及種仁，用70%己醇溶液消毒30sec，無菌水清洗；有效氯濃度為 0. 2% -0. 3%的次氯酸鋼溶液消毒10-15min，無菌水清洗后接入BM培養(yǎng)基，28°C暗培養(yǎng)3 天，切取健康萌動的種仁，自子葉近軸端，1. 5mmX1. 5mm切片，及時接入MS液體培養(yǎng)基中。
[0012] 本發(fā)明方法中，步驟（1)侵染方法為將OD600為0. 8-1. 0的含外源基因的農(nóng)桿菌 菌液與西瓜子葉外植體混勻，侵染lOmin。
[0013] 本發(fā)明方法中，步驟（2)所述的共培養(yǎng)是在28°C黑暗條件下培養(yǎng)4天。
[0014] 其中，步驟（2)所述共培養(yǎng)基的配方為1650mg/L NH4N〇3，1900mg/L KN〇3，170mg/ L KH2P〇4,370mg/L MgS〇4.7H2〇,332mg/L CaCl2, 223mg/L MnS〇4. 4&0,6. 2mg/L &8〇3,8.6mg/ L ZnS〇4. 7&0,0. 83mg/L KI，0. 025mg/L P'JasMoO*. 2馬0,0. 025mg/L OiS〇4. 5馬0,0. 025mg/ L C0CI2.6&0,27.8mg/L FeS〇4. 7&0 37. 3mg/L EDTA.化2，1000mg/L肌醇5mg/L煙酸，5mg/ LVBi，0. 5mg/L VBe，1. 5mg/L6-BA，30g/L庶糖，6g/L瓊脂（液體共培養(yǎng)基不加瓊脂），p冊.8， 118°C，20min高壓滅菌；
[0015] 所述液體共培養(yǎng)基的配方為上述固體培養(yǎng)基配方中不含瓊脂。
[0016] 其中，步驟（2)的加入液體共培養(yǎng)基的量應(yīng)同時滿足W下條件，即剛好浸潤濾紙 且無多余液體流出并保證28°C共培養(yǎng)4天后濾紙不干澗。
[0017] 本發(fā)明方法的步驟（3)中，選擇除草劑為篩選劑，優(yōu)選地，選擇草錠麟（PPT， Phosphinot虹icin)為篩選劑。
[0018] 進(jìn)一步地，步驟（3)的具體方法為，共培養(yǎng)結(jié)束后，選擇正常膨大的黃色子葉切片 外植體直接轉(zhuǎn)入含3-3. 5mg/L草錠麟和300mg/L駿節(jié)青霉素的篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)2-3 周后，將抗性外植體轉(zhuǎn)入含4. 5-5. 5mg/L草錠麟和300mg/L駿節(jié)青霉素的篩選培養(yǎng)基，繼 續(xù)篩選培養(yǎng)2-3周，當(dāng)抗性外植體在切口邊緣有綠色瘤狀愈傷生成并分化出不定芽時，將 不定芽切下轉(zhuǎn)入含6. 5-7. 5mg/L草錠麟和300mg/L駿節(jié)青霉素的篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2-3 周。
[0019] 優(yōu)選地，步驟（3)的具體方法為，共培養(yǎng)結(jié)束后，選擇正常膨大的黃色子葉切片外 植體直接轉(zhuǎn)入含3mg/L草錠麟和300mg/L駿節(jié)青霉素的篩選培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)2周后，將抗 性外植體轉(zhuǎn)入含5mg/L草錠麟和300mg/L駿節(jié)青霉素的篩選培養(yǎng)基，繼續(xù)篩選培養(yǎng)2周，當(dāng) 抗性外植體在切口邊緣有綠色瘤狀愈傷生成并分化出不定芽時，將不定芽切下轉(zhuǎn)入含7mg/ L草錠麟和300mg/L駿節(jié)青霉素的篩選培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周。
[0020] 本發(fā)明方法中，步驟（4)是將抗性外植體幼芽轉(zhuǎn)入芽伸長培養(yǎng)基繼續(xù)篩選2-3周， 每周繼代一次，將不定芽基部殘留外植體和瘤狀愈傷逐漸切除，使芽與培養(yǎng)基充分接觸。
[0021] 其中，步驟（4)中，轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基后的培養(yǎng)條件為2000LUX，12小時/天； 25-28 °C。
[0022] 步驟（4)所述的移栽，是指待植株發(fā)育正常，小屯、取出再生苗，洗凈根部瓊脂，移 栽到事先滅菌的草炭；胚石；園±為1:1:2(V/V/V)的基質(zhì)中，附上薄膜注意保濕，成活后移 栽到溫室常規(guī)管理。
[0023] 本發(fā)明所述的含外源基因的農(nóng)桿菌為本領(lǐng)域公知的通過基因工程方法轉(zhuǎn)化得到 的含有外源目的基因的農(nóng)桿菌。在本發(fā)明的實施例中，采用的農(nóng)桿菌菌株類型為EHA105或 C58。
[0024] 本發(fā)明方法還包括對篩選得到的除草劑抗性西瓜植株進(jìn)行PCR鑒定，鑒定的目標(biāo) 基因為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的外源目的基因。
[0025] 本發(fā)明提供了上述方法在西瓜遺傳改良及育種中的應(yīng)用。
[0026] 基于本發(fā)明的上述技術(shù)方案，本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)表現(xiàn)在：外植體細(xì)胞活力高，生 長能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)目多，轉(zhuǎn)化細(xì)胞與再生細(xì)胞重疊性