專(zhuān)利名稱(chēng)：鎘積累減少的轉(zhuǎn)基因植物的制作方法
鎘積累減少的轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明涉及用于減少植物，特別是煙草中鎘積累的工具(means)和方法。大量耕地中存在濃度逐漸升高的鎘。這一方面是由于某些土壤中天然的高金屬水 平，而另一方面是由于肥料(由于用于制造肥料其的磷鹽巖中存在鎘)的應(yīng)用，污水處理站 淤泥的擴(kuò)散，使用城市污水灌溉田地，以及浮質(zhì)(aerosol)的沉降造成的。由于作為肥料 使用的無(wú)鎘磷酸鹽礦被耗盡，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，農(nóng)田中的鎘濃度還會(huì)持續(xù)顯著地提高。結(jié)果， 在植物，主要是供食用的那些植物中存在的鎘含量越來(lái)越頻繁地超過(guò)由不同國(guó)家規(guī)定的標(biāo) 準(zhǔn)，或聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織推薦的標(biāo)準(zhǔn)。舉例而言，綠色沙拉、土豆、胡椒、小麥，特別是煙草的情 況正是如此。關(guān)于煙草，已知這種植物在葉中積累高水平的鎘，文獻(xiàn)中報(bào)道煙草中的鎘濃度 為 0. 5-5ppm。鎘是屬于元素周期表中IIB族的金屬元素。由于其化學(xué)毒性，吸入或攝取高水平 的鎘將造成人和動(dòng)物的嚴(yán)重健康風(fēng)險(xiǎn)(包括對(duì)呼吸系統(tǒng)、腎臟或肝臟的損傷，以及癌癥)。因此，需要能夠在包含高鎘濃度的土壤中生長(zhǎng)，并且能夠具有低的這一有害金屬 含量的植物。盡管可以依照不同的策略降低植物中的鎘濃度，生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物也可有助于 獲得此類(lèi)植物。Lee等人提出了生產(chǎn)抗性增強(qiáng)且鎘吸收減少的植物的方法(2003， PlantPhysiol. 133 :589-96 ；和國(guó)際申請(qǐng)WO 02/081707)。該作者獲得了表達(dá)大腸桿菌 (Escherichia coli)重金屬ZntA蛋白的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsis thaliana)。此轉(zhuǎn)基 因植物具有顯示改進(jìn)的Pb和Cd抗性，并且與野生型相比，其芽(shoot)具有降低的Pb和 Cd含量。ZntA 是 Pib-型 ATP 酶(P1B_type ATPase)，其通過(guò)使例如 Zn2+、Cd2+ 和 Pb2+ 的二價(jià) 陽(yáng)離子主動(dòng)流出細(xì)胞質(zhì)外，而賦予大腸桿菌對(duì)毒性濃度的這些金屬離子的抗性(Rensing et al. , 1997, PNAS,94 14326-14331 ；Rensing et al. , 1998, J Biol Chem. ,273 32614-32617 ；Dutta et al.，2007，Biochemistry, 46 :3692_3703)。Pib-ATP酶是利用ATP水解放能反應(yīng)釋放的能量，使例如Zn2+、Cd2+、Pb2+、Co2+、Cu+ 和Ag+的軟金屬陽(yáng)離子跨膜轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Inesi，1985，Annu RevPhysiol. ,47 :573_601 ； Axelsen and Palmgren，2001，Plant Physiol.，126 :696_706 ；及綜述 ArgUello et al., 2007，BioMetals，20 233-248)。有時(shí)也將它們稱(chēng)作HMA (重金屬ATP酶)，或者稱(chēng)作CPx-型 ATP酶。Pib-ATP酶發(fā)現(xiàn)于原核生物和真核生物，包括古細(xì)菌、細(xì)菌、酵母、昆蟲(chóng)、植物和哺乳 動(dòng)物中。它們都包含標(biāo)志性的DKTGT氨基酸序列?；趯?duì)底物陽(yáng)離子的選擇性和系統(tǒng)發(fā)育 分析，將Pib-ATP酶分成兩個(gè)主要的不同亞類(lèi)(族)(Rensing et al.，1999，J Bacteriol.， 181 =5891-5897) Cu+ 族 Pib-ATP 酶參與 Cu+ 和 Ag+ 的轉(zhuǎn)運(yùn)，而 Zn2+ 族 Pib-ATP 酶轉(zhuǎn)運(yùn) Zn2+ 和其 他重金屬，例如 Co2+、Cd2+和 Pb2+(Axelsen and Palmgren，2001，如上)。不同亞類(lèi)的 Pib-ATP 酶在其跨膜域中具有不同的保守氨基酸基序。舉例而言，基于選擇轉(zhuǎn)運(yùn)的陽(yáng)離子，它們的第 六跨膜域包含(C，S，T)P(C，H)基序(Solioz and Vulpe, 1996, Trends Biochem Sci. ,21 237-241 ；Rensing et al.，1998，如上；Williams et al.，2000，Biochim Biophys Acta.， 1465 104-126 ；Dutta et al.，2007，如上)。
在擬南芥中，HMA2和HMA4蛋白(分別為AtHMA2和AtHMA4)是與Zn27Co2+/Cd27 Pb2+亞類(lèi)聚類(lèi)在一起的Pib-型ATP酶。AtHMA2和AtHMA4在植物(in planta)中位于質(zhì)膜， 并參與這些二價(jià)陽(yáng)離子向植物地上部分的轉(zhuǎn)運(yùn)(Hussain et al.，2004，Plant Cell. ,16 1327-39 ；Verret et al. ,2004, FEBS Lett.，576 :306_312)。鋅是植物需要的必要微量元 素，而鈷、鎘和鉛則具有毒性作用?？煞謩e通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)的登錄號(hào)GI112229675和 GI112229637獲得AtHMA2和AtHMA4的氨基酸序列；本文中復(fù)制AtHMA4氨基酸序列，稱(chēng)為 SEQ ID No. 1。這些蛋白在其第六跨膜域中包含保守的CPC基序(下文中也稱(chēng)作C1PC2)，并 且在其第六和第七跨膜域之間的可溶性環(huán)中包含DKTGT基序(Argilello et al.，2007，如 上)。在AtHMA4中，第一個(gè)半胱氨酸殘基(C1)位于氨基酸序列的第357位(Mills et al.， 2003，Plant J. ,35 164-76) Mills等人的文章(2003，如上)顯示AtHMA4在釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)中的表達(dá)降低了酵母對(duì)Cd的敏感性，并且賦予酵母對(duì)此金 屬離子的抗性。在Mills等人2005年公開(kāi)的第二篇文章(FEBS Letters, 579 783-791)中 顯示在釀酒酵母中表達(dá)CPC基序的第一個(gè)半胱氨酸(C1) (357C)被甘氨酸取代的AtHMA4突變 體(AtHMA4-C357G)沒(méi)有賦予酵母對(duì)Cd和Zn的抗性，即與表達(dá)野生型AtHMA4的那些酵母 相比，表達(dá)AtHMA4-C357G的酵母對(duì)高水平的Cd和Zn更為敏感?，F(xiàn)已獲得過(guò)表達(dá)AtHMA4的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Verret et al.，如上和國(guó)際申請(qǐng)WO 2005/090583)。與Lee等人(如上)獲得的表達(dá)ZntA (與Zn2+亞類(lèi)聚類(lèi)的大腸桿菌Pib-型 ATP酶)轉(zhuǎn)基因擬南芥相反，Verret等人獲得的轉(zhuǎn)基因擬南芥顯示其芽的Zn和Cd含量比 野生型提高。由以上描述可見(jiàn)，依照Pib-型ATP酶的原核生物或植物起源，在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá) 或過(guò)表達(dá)與Zn2+亞類(lèi)聚類(lèi)的Pib-型ATP酶能導(dǎo)致不同的表型。在導(dǎo)致獲得本發(fā)明的研究框架內(nèi)，本發(fā)明的發(fā)明人意想不到地發(fā)現(xiàn)表達(dá)AtHMA4 變體(AtHMA4-C357S)(其中第六跨膜域中保守(^^2基序的第一個(gè)半胱氨酸(C1)殘基被絲 氨酸取代)的釀酒酵母表現(xiàn)降低的Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力，但Zn外流幾乎與野生型酵母相同。隨后， 本發(fā)明的發(fā)明人證明了表達(dá)AtHMA4-C357S變體的轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)鎘的攝取低于野生型， 并且有利的是其生理Zn2+微量元素的穩(wěn)態(tài)并沒(méi)有改變。因此，在第一方面，本發(fā)明提供了減少鎘在植物地上部分中積累的方法，其特征在 于所述方法包括在所述植物中表達(dá)在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于質(zhì)膜的 Zn2VCo2VCd2VPb2+亞類(lèi)植物Pib-型ATP酶的變體，所述變體具有突變，該突變由選自絲氨 酸、丙氨酸、組氨酸和蘇氨酸組成的組的任何氨基酸取代C1殘基組成，其中優(yōu)選該突變由絲 氨酸取RC1殘基組成。術(shù)語(yǔ)“地上部分”包括，但不限于芽、葉、莖、花、果實(shí)和種子，優(yōu)選葉和種子?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域熟知的方法測(cè)定所述Pib-型ATP酶在植物中質(zhì)膜的定位。舉例而 言，可引用Hussain et al.，2004和/或Verret et al.，2004 (如上)中描述的方法。簡(jiǎn) 要而言，通過(guò)水兩相分配使植物的總質(zhì)膜分成部分(fraction)，并通過(guò)以Pib-型ATP酶特 異性抗體為探針的蛋白質(zhì)凝膠斑點(diǎn)分析表征所述部分。為了驗(yàn)證所述Pib-型ATP酶在質(zhì)膜 的定位，可將其編碼序列與例如綠色熒光蛋白(GFP)的標(biāo)記酶融合在一個(gè)讀碼框中，并在 轉(zhuǎn)基因植物或原生質(zhì)體內(nèi)的組成型啟動(dòng)子的控制下表達(dá)(瞬時(shí)表達(dá))?？赏ㄟ^(guò)共焦顯微鏡 觀察Pib-型ATP酶-標(biāo)記酶在細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方式，所述Pib-型ATP酶來(lái)自高等植物，例如擬南芥、煙草 (Iiicotiana)Jjag (Oryza)和楊樹(shù)(Populus)，且更優(yōu)選來(lái)自與需要進(jìn)行所述表達(dá)的植物 相同的植物物種。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述Pib-型ATP酶選自擬南芥的HMA4和HMA2、天 藍(lán)遏藍(lán)菜(Thlaspi caerulescens)的 HMA4 (可由 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào) GI | 46361-990 獲得)、葉芽鼠耳芥(Arabidopsis halleri subsp. Gemmifera)的 HMA4 (可由 GenBank 數(shù) 據(jù)庫(kù)登錄號(hào)GII 63056225獲得)、水稻的HMA2和HMA3 (可分別由GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登錄號(hào) GI1125598398 和 GI1125557764 獲得)和葡萄(Vitis vinifera)的 HMA (可由 GenBank 數(shù) 據(jù)庫(kù)登錄號(hào)GI1157357491獲得)組成的組。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述Pib-型ATP酶與SEQ ID NO 1的AtHMA4 蛋白質(zhì)具有至少50 %，優(yōu)選至少54 %的序列同一性，并且按照優(yōu)選度遞增的順序，具有至 少 56%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%和 99%序列同一性，或 者至少70%，優(yōu)選73%的序列相似性，且按照優(yōu)選度遞增的順序，具有至少79%、80%、 85 %、90 %、95 %、97 %、98 %和99 %的序列相似性，條件是所述Pib-型ATP酶在第六跨膜域 中包含保守的C1PC2基序。除非另有說(shuō)明，本文提供的蛋白序列同一性和相似性是在包括蛋白完整序列的比 較窗口上使用默認(rèn)參數(shù)的BLASTP程序計(jì)算的。使用計(jì)分矩陣BL0SUM62進(jìn)行相似度計(jì)算。任選地，上述定義的取代可與旨在改進(jìn)這些突變體活性的一種或多種其他突變組
I=I O根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式
，所述變體具有氨基酸序列SEQ IDNO :2。此氨 基酸序列對(duì)應(yīng)于野生型AtHMA4蛋白(SEQ ID NO :1)，其中此蛋白第六跨膜域中保守(^(2基 序中的第一半胱氨酸(C1)殘基被上述氨基酸(即絲氨酸、丙氨酸、組氨酸或蘇氨酸)取代。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式，降低鎘在植物中積累的方法還進(jìn)一步包括抑制所 述植物中在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于質(zhì)膜的Zn27Co27Cd27Pb2+亞類(lèi)的至 少一種，優(yōu)選所有內(nèi)源性(野生型)P1B-型ATP酶。本發(fā)明的這一實(shí)施方式的方法僅涉及表達(dá)所述內(nèi)源性Pib-型ATP酶的植物。實(shí)際 上，植物可能表達(dá)一種或多種上以上定義的內(nèi)源性Pib-型ATP酶。舉例而言，擬南芥表達(dá) Pib-型ATP酶的HMA2和HMA4。因此，當(dāng)此實(shí)施方式的方法應(yīng)用于擬南芥時(shí)，此方法包括抑 制 HMA2 禾口 / 或 HMA4?？赏ㄟ^(guò)消除、阻斷或降低其功能，或者通過(guò)有利地抑制或下調(diào)其基因的表達(dá)來(lái)獲 得對(duì)內(nèi)源性Pib-型ATP酶的抑制。舉例而言，可通過(guò)誘變相應(yīng)基因或其啟動(dòng)子，并選擇具有部分或完全喪失Pib-型 ATP酶活性的突變體來(lái)獲得對(duì)內(nèi)源性Pib-型ATP酶的抑制。例如，根據(jù)突變的性質(zhì)，在編碼 序列內(nèi)的突變能夠誘導(dǎo)表達(dá)無(wú)活性的蛋白；與此相同，在啟動(dòng)子序列內(nèi)的突變能夠誘導(dǎo)所 述內(nèi)源性Pib-型ATP酶的表達(dá)缺失，或使其表達(dá)下降?？梢酝ㄟ^(guò)，例如對(duì)內(nèi)源性Pib-型ATP酶編碼序列或啟動(dòng)子或其部分的靶向刪除，或 在所述編碼序列或所述啟動(dòng)子內(nèi)靶向插入外源序列來(lái)進(jìn)行誘變。還可以通過(guò)隨機(jī)的化學(xué)或 物理誘變，隨后篩選在編碼所述內(nèi)源性Pib-型ATP酶基因內(nèi)的突變體來(lái)進(jìn)行。用于高通量 誘變和篩選的方法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的。例如，可以引用Hussain et al.，2004(如上)中描述的方法，其中將T-DNA插入到來(lái)自擬南芥的hma2和hma4等位基因中，并使突變體在含 高濃度Zn的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(這些突變體是Zn缺陷型的)。有利地，可通過(guò)沉默相應(yīng)的基因獲得所述內(nèi)源性Pib-型ATP酶的抑制。用于在植 物中沉默基因的方法在本領(lǐng)域中是已知的。例如，可通過(guò)反義抑制或共抑制進(jìn)行。還可使 用靶向所述內(nèi)源性Pib-型ATP酶mRNA的核酶。在優(yōu)選的方法中，通過(guò)靶向待沉默的所述內(nèi)源性Pib-型ATP酶編碼基因的RNA干 擾(RNAi)的方式誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄后基因沉默。在本領(lǐng)域中可獲得用于遞送RNAi的各種方法和 DNA 構(gòu)建體(綜述參見(jiàn)Watson et al. ,2005, FEBSLetters, 579 5982-5987)。本發(fā)明還提供了如上文定義的Pib-型ATP酶蛋白變體。本發(fā)明還提供了用于實(shí)施所述表達(dá)的工具(means)。本發(fā)明還提供了編碼如上文定義的Pib-型ATP酶蛋白變體的多核苷酸?？赏ㄟ^(guò) DNA重組技術(shù)和/或化學(xué)DNA合成的已知方法獲得本發(fā)明的多核苷酸。這些方法還可以在 天然存在的編碼如上文定義的Pib-型ATP酶蛋白變體的核苷酸序列中引入所需的取代。
本發(fā)明還提供了重組表達(dá)盒，其包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下編碼如上文定義的 Pib-型ATP酶變體的多核苷酸，由轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制以允許在宿主細(xì)胞中調(diào)控所述多核苷酸。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子是在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的任何啟動(dòng)子， 即能夠在植物細(xì)胞中指導(dǎo)編碼如上文定義的Pib-型ATP酶的多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。特別地，可 根據(jù)希望進(jìn)行表達(dá)的器官或組織，或表達(dá)的類(lèi)型(即組成型或誘導(dǎo)型)來(lái)選擇更為適合的 啟動(dòng)子。本領(lǐng)域中可獲得大量適合在植物，特別是在煙草中進(jìn)行基因表達(dá)的啟動(dòng)子。例如， 可從植物(例如擬南芥和煙草)、植物病毒或細(xì)菌，例如土壤桿菌(Agrobacterium)獲得。 其包括組成型啟動(dòng)子，即在大多數(shù)組織和細(xì)胞中以及大多數(shù)環(huán)境條件下都具有活性的啟動(dòng) 子，或僅在或主要在某些組織(例如葉)或某些細(xì)胞類(lèi)型中具有活性的組織或細(xì)胞特異性 啟動(dòng)子，以及通過(guò)物理或化學(xué)刺激激活的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。還包括所述內(nèi)源性Pib-型ATP酶 的啟動(dòng)子，其來(lái)自與需要進(jìn)行所述表達(dá)的植物相同的植物物種。啟動(dòng)子序列也可重復(fù)兩次 或更多次(例如串聯(lián)重復(fù))。常用的組成型啟動(dòng)子的非限制性實(shí)例為公知的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng) 子和胭脂堿合酶(Nos)啟動(dòng)子，木薯葉脈花葉病毒(CsVMV)啟動(dòng)子(Verdaguer et al.， 1996，Plant Mol. Biol. ,31 :1129_39)，用于轉(zhuǎn)基因單子葉植物的質(zhì)粒pActl_F4中包含的 后接水稻肌動(dòng)蛋白內(nèi)含子的水稻肌動(dòng)蛋白(1或2)啟動(dòng)子(RAP-RAI) (McElroy et al., 1991, Mol. Gen. Genet.，231 (1) :150_160)。表達(dá)盒通常還包括轉(zhuǎn)錄終止子，例如35S轉(zhuǎn)錄終止子或Nos終止子(D印icker et al.，1982，J. Mol. Appl. Genet.，1 :561_73)。還可包括其他調(diào)控序列，例如轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列?？蓪⒈景l(fā)明的重組表達(dá)盒插入到允許對(duì)宿主細(xì)胞基因組進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的適合的 載體中。因此，本發(fā)明還涉及包含上述定義的表達(dá)盒的重組載體，其中所述表達(dá)盒的啟動(dòng) 子優(yōu)選為在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。本發(fā)明還提供了包含上文定義的重組表達(dá)盒或重組載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的宿主細(xì)胞為原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，優(yōu)選植物細(xì)胞，且更優(yōu)選煙草細(xì)胞。在另一方面，本發(fā)明提供了生產(chǎn)鎘積累減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法。所述方法包括以下步驟a)提供包含上文定義的重組表達(dá)盒或重組載體的植物細(xì)胞，并且任選地抑制所述 植物細(xì)胞中如上文定義的內(nèi)源性Pib-型ATP酶，和b)由步驟a)中獲得的植物細(xì)胞再生表達(dá)如上述定義的Pib-型ATP酶變體的轉(zhuǎn)基 因植物。由于使用來(lái)自植物源的Pib-型ATP酶的變體，本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于所生產(chǎn)的轉(zhuǎn) 基因植物包含最小含量的外源元件或外源序列，從而使所述變體的表達(dá)更加穩(wěn)定且更加有 效。本發(fā)明還包括通過(guò)本發(fā)明的重組表達(dá)盒遺傳轉(zhuǎn)化并表達(dá)如上文定義的Pib-型ATP 酶變體的植物。優(yōu)選所述轉(zhuǎn)基因植物可通過(guò)本發(fā)明的方法獲得。在所述轉(zhuǎn)基因植物中，本 發(fā)明的重組表達(dá)盒包含在整合(即穩(wěn)定整合)到植物基因組中一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)基因中，從而 能夠被傳遞至后續(xù)的植物世代。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物不僅包括從最初轉(zhuǎn)基因獲得的 植物，而且還包括其后代，只要其包含本發(fā)明的重組表達(dá)盒。有利地，與沒(méi)有所述轉(zhuǎn)基因的相同品種的植物相比，表達(dá)如上文定義的Pib-型ATP 酶變體的本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)鎘吸收減少，特別是在地上部分中。因此，本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)基因植物或其分離的器官(例如種子、葉、花、根、莖、穗，優(yōu) 選葉)或其組織，轉(zhuǎn)基因植物或其分離的器官或其組織在其基因組中穩(wěn)定整合了包含編碼 上文定義的Pib-型ATP酶的變體的多核苷酸的重組表達(dá)盒。本發(fā)明應(yīng)用于農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)目標(biāo)的單子葉或雙子葉植物，例如小麥、大麥、玉米、油菜、 水稻、甜菜、菠菜、萵苣、西紅柿、煙草，優(yōu)選煙草。煙草葉天然地積累并濃縮相對(duì)高水平的鎘，這些鎘在燃燒期間揮發(fā)，并對(duì)接觸鎘 的吸煙者造成顯著的影響。有利地，與野生型煙草或沒(méi)有上述轉(zhuǎn)基因的煙草相比，來(lái)自本發(fā) 明轉(zhuǎn)基因植物的煙草葉具有較低的鎘含量。因此，另一方面，本發(fā)明涉及來(lái)自本發(fā)明轉(zhuǎn)基因植物的煙草葉在制造煙草產(chǎn)品中 的應(yīng)用，所述煙草產(chǎn)品包括冒煙產(chǎn)品(smoking product)例如卷煙、雪茄和粗煙絲，以及無(wú) 煙產(chǎn)品例如鼻煙、嚼煙(chewing tobacco)或吮煙(suckingtobacco)等。所述產(chǎn)品也包含 在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明的上述和其他目標(biāo)和優(yōu)點(diǎn)更清楚地體現(xiàn)于下文的詳述和附圖中。然而，應(yīng) 理解上述詳細(xì)說(shuō)明僅為例證，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。


圖1 :a)在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)僅pYES-酵母轉(zhuǎn)化體、AtHMA4-酵母轉(zhuǎn)化體和 AtHMA4SPC-酵母轉(zhuǎn)化體，隨后測(cè)量600nm的光密度(OD)。酵母細(xì)胞在存在80 μ M Cd的條 件下于30°C生長(zhǎng)48小時(shí)。b-d)在與a)相同的條件下進(jìn)行液體培養(yǎng)。收集細(xì)胞，使用IOmM EDTA清洗一次，隨后使用去礦物質(zhì)水清洗兩次，以除去吸附在酵母細(xì)胞壁上的鎘。將沉淀物 干燥、稱(chēng)重并用HNO3礦化，隨后通過(guò)ICP-AES測(cè)定金屬含量；在b)和d)中，在存在80 μ MCd 的條件下進(jìn)行酵母培養(yǎng)；在c)中，在受控的營(yíng)養(yǎng)溶液(1.5μΜ Zn)中進(jìn)行酵母培養(yǎng)。圖2顯示了 Wassilewskija生態(tài)型擬南芥(Ws)和過(guò)表達(dá)AtHMA4(CPC)或 AtHMA4SPC (SPC)的轉(zhuǎn)基因擬南芥的體外根生長(zhǎng)測(cè)量。幼苗垂直地生長(zhǎng)在不含(對(duì)照)或含有以下金屬的細(xì)菌培養(yǎng)瓊脂(bactoagar)營(yíng)養(yǎng)溶液中20μΜ Cd、50yM Zn或200 μ M Zn。 在發(fā)芽14天后進(jìn)行根長(zhǎng)度測(cè)量。圖中表明了 100-150個(gè)測(cè)量的平均值+/-SD。實(shí)施例表達(dá)AtHMA4變體形式的轉(zhuǎn)基因酵母和擬南芥的表征1)材料和方法通過(guò)定點(diǎn)突變修飾克隆到誘導(dǎo)型酵母載體pYES-GFP (Gravot et al. ,2004, FEBS Lett. ,561 -.22-28.)中的擬南芥HMA4cDNA(可由2005年3月10日版的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)登 錄號(hào)AF412407獲得)。使用絲氨酸取代序列中第357位的半胱氨酸殘基(克隆pVF472)， 從而獲得其中Xaa為氨基酸絲氨酸的氨基酸序列SEQ ID NO :2 (命名為AtHMA4SPC)。將此構(gòu)建體分別轉(zhuǎn)化入對(duì)Cd和Pb高度敏感的酵母突變株(ycfl) (Li et al.， 1996，J Biol Chem.，271 :6509_6517)和對(duì) Zn 高度敏感的酵母突變株(zrcl) (MacDiarmid et al. ,2003, J Biol Chem.，278 15065-15072)中(分別為克隆 pVF4121 和 pVF4136)，以 進(jìn)行異源試驗(yàn)(heterologous experiments)。通過(guò)PCR進(jìn)行pVF472的插入，以使其用于克隆到帶有強(qiáng)異位啟動(dòng)子CaMV35S 的植物載體中(克隆PAP4152和pAP4154)。將載體pAP4154引入到根癌土壤桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)株 AglI 中。通過(guò)蘸花轉(zhuǎn)染擬南芥植物(Wassilewskija生態(tài)型)(Clough and Bent, 1998, Plant J.，16 :735-743)。在潮霉素上篩選轉(zhuǎn)化體。通過(guò)表型表征帶有一個(gè)構(gòu)建體插入的 純合植物的多個(gè)獨(dú)立株系。在對(duì)照土壤或包含由AtHMA4轉(zhuǎn)運(yùn)的各種陽(yáng)離子的培養(yǎng)基中培 養(yǎng)野生型(Ws)和過(guò)表達(dá)AtHMA4變體形式(AtHMA4SPC)的植物。種子在受控環(huán)境(8h光周 期，在300μπιΟ1 HT2iT1、21°C和70%相對(duì)濕度下)中發(fā)芽。在發(fā)芽14天后測(cè)量根長(zhǎng)度。使 用T3植物(攜帶獨(dú)特T-DNA的純合植物)進(jìn)行表型表征。按照Verret et al. 2004, FEBS Lett.，576 :306_312 中的描述獲得過(guò)表達(dá) AtHMA4 的擬南芥。2)結(jié)果2-1)轉(zhuǎn)染的酵母的表征2-1-1)使用空載體(pYES)、編碼擬南芥野生型 HMA4 的 cDNA(AtHMA4，SEQ ID NO 1)，或者編碼第357位的半胱氨酸被取代為絲氨酸的AtHMA4變體的cDNA (AtHMA4SPC，SEQ ID NO 2)轉(zhuǎn)化野生型釀酒酵母。在存在80 μ M Cd的條件下于30°C進(jìn)行液體培養(yǎng)，并在48 小時(shí)期間監(jiān)測(cè) 600nm 的 0. D.。與 Verret 等人獲得結(jié)果(2005, FEBS Lett.，579 1515-1522) 一致，觀察到用野生型AtHMA4轉(zhuǎn)化的酵母在存在80 μ M Cd的條件下的生長(zhǎng)較好。AtHMA4 誘導(dǎo)鎘耐受性提高。在由變體形式(AtHMA4SPC)轉(zhuǎn)化時(shí)，酵母沒(méi)有表現(xiàn)出這種提高的耐受 性，并且生長(zhǎng)與對(duì)照株相同。結(jié)果顯示于圖Ia中。2-1-2)通過(guò)Gravot等人(2004，如上)描述的ICP-AES測(cè)定酵母中的金屬含量。 結(jié)果顯示于圖lb-d中。如此前Verret等人(如上)的描述，發(fā)現(xiàn)表達(dá)AtHMA4的酵母中的Cd濃度遠(yuǎn)低于 (60% )對(duì)照株中的Cd濃度(圖lb)。AtHMA4表達(dá)于酵母質(zhì)膜，并在依賴ATP的Cd/Zn外 流中發(fā)揮作用。表達(dá)AtHMA4SPC的酵母中的Cd濃度介于其它兩個(gè)菌株之間(比對(duì)照低27. 5% )。 此觀察結(jié)果可解釋為轉(zhuǎn)運(yùn)和外流Cd的能力較低。
在以下兩種生長(zhǎng)條件下測(cè)量Zn濃度在包含1. 5 μ M Zn的營(yíng)養(yǎng)溶液中，和在存在 80 μ M Cd的條件下。在這兩種條件下，AtHMA4-和AtHMA4SPC-轉(zhuǎn)化酵母中的Zn濃度相同， 且都低于對(duì)照酵母(圖Ic和圖Id)。這些實(shí)驗(yàn)顯示即使在存在毒性濃度的Cd的條件下，AtHMA4的Zn轉(zhuǎn)運(yùn)功能也沒(méi)有 因C357S取代而改變，而Cd轉(zhuǎn)運(yùn)能力下降。2-2)轉(zhuǎn)染的擬南芥的表征通過(guò)測(cè)量細(xì)菌培養(yǎng)瓊脂固體培養(yǎng)基上的根長(zhǎng)度來(lái)測(cè)定植物對(duì)AtHMA4或 AtHMA4SPC轉(zhuǎn)運(yùn)的各種金屬的耐受性。在對(duì)照條件下，兩種表型的根長(zhǎng)度相同。結(jié)果顯示于 圖2中。在存在不同濃度的Zn、Co和Pb的條件下，過(guò)表達(dá)AtHMA4SPC的幼苗的根長(zhǎng)度大 于野生型。這些結(jié)果與在酵母中獲得的結(jié)果相符，并且與Verret等人(如上)在過(guò)表達(dá)天 然形式AtHMA4的植物中的觀察結(jié)果相符。與過(guò)表達(dá)天然形式AtHMA4的植物相似，過(guò)表達(dá) AtHMA4變體形式(AtHMA4SPC)的植物表現(xiàn)出對(duì)這三種金屬的耐受性提高。這是由于更重要 的向其芽轉(zhuǎn)運(yùn)和轉(zhuǎn)移金屬的能力。在存在20 μ M Cd的條件下，兩種株系(野生型和變體)的根長(zhǎng)度相同。鎘耐受性 的提高消失，該鎘耐受性的提高在過(guò)表達(dá)AtHMA4的植物中也觀察到。此結(jié)果與在酵母中獲 得的那些結(jié)果相符。綜上所述，在第六跨膜域中具有C1PC2基序的源自真核生物的Zn27Co27Cd27Pb2+ 亞類(lèi)的Pib-型ATP酶的變體可能由于對(duì)鎘的親和力下降而表現(xiàn)出改變的金屬轉(zhuǎn)運(yùn)特異性， 其中所述變體具有由絲氨酸取代C1殘基的突變。然而，對(duì)于其他三種轉(zhuǎn)運(yùn)金屬Co、Pb、Zn， 特別是生理性的Zn的轉(zhuǎn)運(yùn)性質(zhì)則沒(méi)有改變。
權(quán)利要求
用于減少鎘在植物地上部分中積累的方法，其特征在于所述方法包括在所述植物中表達(dá)在第六跨膜域具有C1PC2基序且在植物中位于質(zhì)膜的Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亞類(lèi)的植物P1B 型ATP酶的變體，所述變體具有突變，該突變由選自絲氨酸、丙氨酸、組氨酸和蘇氨酸組成的組中的任何氨基酸取代C1殘基所組成。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶來(lái)自高等植物。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶來(lái)自與需要進(jìn)行所述表達(dá) 的植物相同的植物物種。
4.如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶選自由來(lái)自擬 南芥的HMA4和HMA2、來(lái)自天藍(lán)遏藍(lán)菜的HMA4、來(lái)自葉芽鼠耳芥的HMA4、來(lái)自水稻的HMA2和 HMA3以及來(lái)自葡萄的HMA組成的組。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述Pib-型ATP酶的變體具有氨基酸序列SEQ ID NO :2。
6.如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于所述方法還包括抑制在第六跨膜 域具有C1PC2基序且在植物中位于質(zhì)膜的Zn27Co27Cd27Pb2+亞類(lèi)的至少一種內(nèi)源性Pib-型 ATP 酶。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)定義的Pib-型ATP酶的變體。
8.一種多核苷酸，其特征在于其編碼權(quán)利要求7所述的Pib-型ATP酶的變體。
9.一種重組表達(dá)盒，其特征在于其包含在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子控制下的權(quán)利要求8所述的多核 苷酸。
10.一種重組載體，其特征在于其包含權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)盒，其中所述表達(dá)盒 的啟動(dòng)子優(yōu)選為在植物細(xì)胞中發(fā)揮功能的啟動(dòng)子。
11.一種宿主細(xì)胞，其特征在于其包含權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)盒或權(quán)利要求10所 述的重組載體。
12.如權(quán)利要求11所述的宿主細(xì)胞，其特征在于其為植物細(xì)胞，優(yōu)選為煙草細(xì)胞。
13.用于生產(chǎn)鎘積累減少的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其特征在于其包括以下步驟a)提供權(quán)利要求12所述的植物細(xì)胞，并且任選地該植物細(xì)胞內(nèi)的如權(quán)利要求6所定義 的內(nèi)源性Pib-型ATP酶被抑制，和b)由步驟a)中獲得的植物細(xì)胞再生表達(dá)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所定義的Pib-型ATP 酶的變體的轉(zhuǎn)基因植物。
14.一種轉(zhuǎn)基因植物，其可由權(quán)利要求13的方法獲得。
15.一種轉(zhuǎn)基因植物或分離的其器官或其組織，其特征在于其包含穩(wěn)定地整合到其基 因組中的權(quán)利要求9所述的重組表達(dá)盒。
16.如權(quán)利要求14或15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于其為轉(zhuǎn)基因煙草植物。
17.如權(quán)利要求15所述的分離的器官，其特征在于其為煙草葉。
18.權(quán)利要求17所述的煙草葉在制備煙草產(chǎn)品中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于減少植物中鎘積累的方法和工具例如多核苷酸、重復(fù)表達(dá)盒和重組載體以及表達(dá)Zn2+/Co2+/Cd2+/Pb2+亞類(lèi)的植物P1B-型ATP酶的變體的轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物顯示在地上部分中的鎘積累減少。
文檔編號(hào)C12N9/14GK101896608SQ200780101868
公開(kāi)日2010年11月24日 申請(qǐng)日期2007年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月12日
發(fā)明者安托萬(wàn)·格拉沃, 帕斯卡利娜·奧魯瓦, 皮埃爾·里紹, 阿拉因·瓦瓦瑟爾 申請(qǐng)人:原子能與替代能源署