本發(fā)明涉及一種基因突變的引物及試劑盒，特別涉及一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的引物及試劑盒。
背景技術(shù)：
：地中海貧血簡(jiǎn)稱“地貧”，英文名稱叫“thalassemia”。這種病是首先由thomascooley和pearllee這兩位科學(xué)家，于1925年在地中海地區(qū)發(fā)現(xiàn)的，所以這種病就被命名為“地中海貧血”。實(shí)際上，這種病廣泛地分布在熱帶、和亞熱帶地區(qū)，因地中海貧血致病基因的攜帶者，對(duì)瘧疾有一定的抵抗能力。瘧原蟲(chóng)要通過(guò)按蚊傳播，按蚊生長(zhǎng)在熱帶、亞熱帶，所以瘧疾也主要出現(xiàn)在熱帶、亞熱帶地區(qū)。中國(guó)的廣東省、廣西省、海南省地處熱帶，這些地方也是中國(guó)出現(xiàn)瘧疾最多的地方。因地中海貧血的攜帶者對(duì)瘧疾有一定的抵抗能力，所以通過(guò)許多代人被瘧疾的選擇，廣東省、廣西省等省的人群當(dāng)中，攜帶地中海貧血致病變異的人數(shù)比例，就相當(dāng)高。據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，廣東省β-珠蛋白生成障礙性貧血為2.54％。一、血紅蛋白與地中海貧血的關(guān)系一個(gè)人患地中海貧血，是因?yàn)樗幕虍?dāng)中，編碼血紅蛋白的基因有致病的變異。血紅蛋白是人體的紅細(xì)胞當(dāng)中專門(mén)負(fù)責(zé)攜帶氧氣的蛋白。正常成年人的一個(gè)血紅蛋白，是由兩個(gè)α珠蛋白、和兩個(gè)β珠蛋白組成的。每個(gè)珠蛋白結(jié)合一個(gè)亞鐵血紅素。一個(gè)亞鐵血紅素，是由一個(gè)卟啉環(huán)結(jié)合一個(gè)亞鐵離子組成的。這個(gè)亞鐵離子負(fù)責(zé)直接與氧氣分子結(jié)合。血紅蛋白在肺部與氧氣分子結(jié)合之后，再通過(guò)血液的輸送，把氧氣輸送到全身。當(dāng)一個(gè)人編碼血紅蛋白的基因發(fā)生了變異，血紅蛋白的數(shù)量就可能減少，血紅蛋白的穩(wěn)定性也可能會(huì)降低，進(jìn)而就會(huì)導(dǎo)致供氧不足、黃疸、肝脾腫大、特殊的地中海貧血面容、易患各感染性疾病等癥狀。二、α型地中海貧血地中海貧血根據(jù)致病基因變異的不同，分成兩大類：α地貧、和β地貧。α地貧，就是指因?yàn)榫幋aα珠蛋白的基因發(fā)生致病變異，而導(dǎo)致的地貧。編碼α珠蛋白的基因位于第16號(hào)染色體上。正常情況下，1條16號(hào)染色體上有2個(gè)串聯(lián)排列的α珠蛋白基因拷貝，這兩個(gè)拷貝是緊挨著的。所以，一個(gè)正常人應(yīng)該有4個(gè)α珠蛋白基因的拷貝。α地貧的主要基因變異，是α珠蛋白的基因拷貝數(shù)量減少。α地貧的癥狀的嚴(yán)重程度，是與α珠蛋白基因缺失的拷貝數(shù)量呈正相關(guān)的，缺失的拷貝數(shù)越多，臨床癥狀越嚴(yán)重。α地貧的基因變異，除了基因拷貝數(shù)的缺失之外，還有部分的變異是因?yàn)棣羴喕木幋a出現(xiàn)了變異。比如單個(gè)堿基的替換(snv)、插入缺失變異(indel)，也可能會(huì)導(dǎo)致α地貧。三、β型地中海貧血β地貧，就是指編碼β珠蛋白的基因發(fā)生致病變異，而導(dǎo)致的地貧。β珠蛋白基因位于11號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶，β珠蛋白基因的常見(jiàn)變異，是因?yàn)棣轮榈鞍谆虻木幋a序列出現(xiàn)了異常，導(dǎo)致不能合成出β珠蛋白，或者合成出的β珠蛋白不能正常地與α珠蛋白結(jié)合，導(dǎo)致不能形成正常的、有功能的血紅蛋白。現(xiàn)在已知有200多種β珠蛋白基因的致病變異，中國(guó)也發(fā)現(xiàn)了30多種突變，一般輕型珠蛋白生成障礙性貧血受測(cè)者臨床上多無(wú)明顯癥狀，無(wú)需特殊治療，但由于地貧的遺傳性,可能會(huì)將其異?；蜻z傳給下一代。血液學(xué)篩查結(jié)合基因診斷是目前篩查診斷珠蛋白生成障礙性貧血的重要手段，但進(jìn)一步的確認(rèn)還有賴于dna分析地貧基因分型。四、目前通用的檢測(cè)方法及局限性目前有關(guān)地貧的檢測(cè)方法中，血液學(xué)表型分析在實(shí)際的檢測(cè)過(guò)程中能給到很好的提示，有助于進(jìn)一步地貧檢測(cè)分析提供線路，故在珠蛋白生成障礙性貧血的實(shí)驗(yàn)分析和研究中占有非常重的地位；同時(shí)，“基因型和表型相結(jié)合”這一操作理念也是進(jìn)行地貧檢測(cè)和研究的基本原則，血液學(xué)表型和基因檢測(cè)結(jié)果均正常的個(gè)體，一般可排除β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變?；驕y(cè)序作為檢測(cè)地貧的金標(biāo)準(zhǔn)，但目前國(guó)內(nèi)對(duì)于珠蛋白生成障礙性貧血的基因檢測(cè)方法通常只限于α-珠蛋白生成障礙性貧血的常見(jiàn)3種缺失與常見(jiàn)的點(diǎn)突變，β-珠蛋白生成障礙性貧血的常見(jiàn)17個(gè)位點(diǎn)點(diǎn)突變的檢測(cè)，因此能檢測(cè)到的突變有限，少部分罕見(jiàn)類型珠蛋白生成障礙性貧血受測(cè)者往往被因沒(méi)有相應(yīng)的基因引物和試劑盒而不能確定具體是哪種珠蛋白基因的變異。如前所述，廣東省、廣西省等省的人群當(dāng)中，攜帶地中海貧血致病變異的人數(shù)比例相當(dāng)高，據(jù)現(xiàn)有流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，廣東省β-珠蛋白生成障礙性貧血為2.54％。金域檢驗(yàn)作為國(guó)內(nèi)第三方醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的龍頭企業(yè)，其主要是為提供更多的大健康一體化檢測(cè)服務(wù)方案。金域檢驗(yàn)每天會(huì)接收全省2000多家醫(yī)療機(jī)構(gòu)的檢測(cè)樣本，其中每天約1000例地貧的檢測(cè)樣本。而目前國(guó)內(nèi)有關(guān)的檢測(cè)方法中，中國(guó)人群常見(jiàn)的17種突變位點(diǎn)中，通常采用反向點(diǎn)雜(rdb)法檢測(cè)β-珠蛋白生成障礙性貧血，能基本檢測(cè)出絕大多數(shù)的β-珠蛋白生成障礙性貧血，但是β珠蛋白基因的致病變異較多，針對(duì)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變用rdb檢測(cè)方法具有很大的局限性，這類攜帶者常常被漏檢。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的引物及試劑盒，該引物具有特異性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，用于準(zhǔn)確的確定少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的基因序列，對(duì)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血的分析和研究具有重要的作用。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的引物，引物可以擴(kuò)增含有β珠蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置出現(xiàn)c>t突變beta+(hbb:c.-140c>t)的核酸序列。特別的，針對(duì)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因基因第一對(duì)特異性pcr引物的正向引物為：gccaagagatatatcttagag，反向引物為：actgtaccctgttacttatcc；針對(duì)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因基因第二對(duì)特異性pcr引物的正向引物為：ggcaatagcaatatctctgcat，反向引物為：aatgcactgacctcccacattc。一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的試劑盒，試劑盒中含有可以擴(kuò)增含有β珠蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置c>t突變beta+(hbb:c.-140c>t)的核酸序列的引物。特別的，試劑盒的擴(kuò)增引物的序列如下：bf1：gccaagagatatatcttagag(seqidno：1)br1：actgtaccctgttacttatcc(seqidno：2)bf2：ggcaatagcaatatctctgcat(seqidno：3)br2：aatgcactgacctcccacattc(seqidno：4)。此外，本發(fā)明還提供了檢測(cè)一種少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因的引物在制備檢測(cè)一種少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因試劑盒中的用途。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血的引物，可以有效地檢出少見(jiàn)型β珠蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置(c>t)beta+(hbb:c.-140c>t)突變，為產(chǎn)前的檢測(cè)提供了相應(yīng)依據(jù)。同時(shí)本發(fā)明技術(shù)可用于準(zhǔn)確的確定少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的基因序列，對(duì)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血的分析和研究具有重要的作用。本發(fā)明提供的引物的特異性好，準(zhǔn)確性好，提高了檢測(cè)效率。此外，本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因的試劑盒，通過(guò)使用特異性的引物，具有特異性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，用于準(zhǔn)確的檢測(cè)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因序列，促進(jìn)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因的功能分析和研究。附圖說(shuō)明圖1是瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果圖；圖2是hplc結(jié)果圖；圖3是毛細(xì)管電泳結(jié)果；圖4是常見(jiàn)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失檢測(cè)結(jié)果；圖5是常見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測(cè)結(jié)果；圖6是α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測(cè)結(jié)果；圖7少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變基因測(cè)序結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面進(jìn)一步結(jié)合實(shí)施例，說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案。實(shí)施例1、引物發(fā)明人針對(duì)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變基因特異性pcr引物設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好的引物，該引物能檢測(cè)到突變?yōu)棣轮榈鞍邹D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置(c>t)beta+(hbb:c.-140c>t)的點(diǎn)突變，引物序列如下表1本發(fā)明提供的引物實(shí)施例2、一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的試劑盒一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的試劑盒，突變?yōu)棣轮榈鞍邹D(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置(c>t)beta+(hbb:c.-140c>t)的點(diǎn)突變，包括：dna抽取試劑、擴(kuò)增試劑，擴(kuò)增試劑中使用的引物序列如下：bf1：gccaagagatatatcttagagbr1：actgtaccctcgtacttatccbf2：ggcaatagcaatatctctgcatbr2：aatgcactgacctcccacattc。下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明的技術(shù)方案。一、檢測(cè)流程1.對(duì)象：為到廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行體檢的男性青年，22歲，籍貫為廣東省陽(yáng)江市。2.方法：2.1血液學(xué)檢查：各項(xiàng)血液指標(biāo)分析采用全自動(dòng)血球分析儀(型號(hào)：lh750)及配套試劑(美國(guó)beckmancoulter公司提供)進(jìn)行紅細(xì)胞參數(shù)計(jì)數(shù)。血紅蛋白電泳及定量分析采用全自動(dòng)快速電泳系統(tǒng)(美國(guó)helenaspife3000)、hplc(美國(guó)primusclc385)、毛細(xì)管電泳(法國(guó)sebiacapillarys)，及配套試劑進(jìn)行檢測(cè)(電泳法)。2.2珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)2.2.1α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)：基于跨躍斷裂點(diǎn)pcr(gap-pcr)，以多重pcr并結(jié)合電泳和凝膠成像系統(tǒng)，檢測(cè)受測(cè)者標(biāo)本中常見(jiàn)的α-珠蛋白--sea、-α3.7、-α4.2等三類缺失型α-地中海貧血，采用深圳亞能公司的α-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。2.2.2β-珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)：采用膜反向雜交技術(shù)，采用24條探針，檢測(cè)17種常見(jiàn)的β-地中海貧血基因突變位點(diǎn)，試劑盒由深圳益生堂生物公司提供。2.2.3.β-珠蛋白基因測(cè)序：根據(jù)ncbi中國(guó)人正常珠蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增全mrna序列進(jìn)行測(cè)序，3.判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》(黃有文。珠蛋白生成障礙性貧血//張之南。血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)。2版。北京：科學(xué)出版社，1998：49-58)電泳法結(jié)果診斷a-珠蛋白生成障礙性貧血時(shí)hba2臨界值為≤2.6％，診斷β-珠蛋白生成障礙性貧血時(shí)hba2臨界值為≥3.8％，hplc&ce結(jié)果診斷前者為≤1.9％，后者為≥3.0％，以基因檢測(cè)為金標(biāo)準(zhǔn)。4.實(shí)驗(yàn)流程：采用經(jīng)典的全血細(xì)胞計(jì)數(shù)(fbc)和血紅蛋白成分分析(瓊脂糖凝膠電泳或高效液相色譜和毛細(xì)管電泳)，血液學(xué)表型分析方法能篩出絕大多數(shù)珠蛋白生成障礙性貧血基因攜帶者，對(duì)于血液表型篩出異常結(jié)果的受測(cè)者，經(jīng)珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)或dna序列分析進(jìn)一步明確。二、結(jié)果1.血液學(xué)表型分析結(jié)果：血液學(xué)結(jié)果見(jiàn)表2。表2、血液學(xué)表型分析結(jié)果1.1受測(cè)者血常規(guī)顯示：mcv(平均紅細(xì)胞體積)76.6fl，呈小細(xì)胞低色素；rbc(紅細(xì)胞計(jì)數(shù))6.04×1012/l；hb(血紅蛋白)139g/l。1.2堿性血紅蛋白電泳第2號(hào)位發(fā)現(xiàn)受測(cè)者h(yuǎn)ba2增高占4.95％(見(jiàn)圖1)；高效液相(hplc)和毛細(xì)管電泳(ce)結(jié)果均為5.3％(見(jiàn)圖2～3)。發(fā)明人通過(guò)對(duì)全自動(dòng)電泳瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行地貧初篩檢測(cè)，結(jié)果hba2增高，結(jié)合紅細(xì)胞數(shù)參數(shù)及形態(tài)學(xué)鏡檢結(jié)果，根據(jù)發(fā)明人對(duì)于地貧檢測(cè)20年的從業(yè)經(jīng)驗(yàn)，高度懷疑受檢都為輕型β-地貧，鑒于此，發(fā)明人對(duì)此進(jìn)行了地貧基因檢測(cè)。2.珠蛋白生成障礙性貧血基因檢測(cè)結(jié)果2.2.1常見(jiàn)α-珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)缺失型α珠蛋白生成障礙性貧血(--sea/αα，--α3.7/αα，--α4.2/αα)，通過(guò)條帶與對(duì)照比較得出結(jié)果，未檢驗(yàn)到缺失基因；(見(jiàn)圖4)2.2.2常見(jiàn)β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測(cè)結(jié)果：檢測(cè)β珠蛋白生成障礙性貧血中國(guó)人常見(jiàn)的17個(gè)突變(β0包括int,cd41-42，cd31，cd14-15，cd17，cd71-72，ivs-i-1，cd43，cd27/28；β+包括ivs-ii-654,-28，-29，-30，-32，cap，ivs-i-5,βe)，根據(jù)膜條上的雜交斑點(diǎn)判斷突變位點(diǎn)，未檢測(cè)到突變基因(見(jiàn)圖5)。2.2.3.α-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變檢測(cè)結(jié)果：鑒于在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，未檢測(cè)到常見(jiàn)的α-珠蛋白生成障礙性貧血基因缺失和β-珠蛋白生成障礙性貧血基因突變，發(fā)明人同時(shí)還加做了α珠蛋白生成障礙性貧血點(diǎn)突變(αwsα/，αcsα/，αqsα/)，結(jié)果均未發(fā)現(xiàn)突變(見(jiàn)圖6)。2.2.4.一種少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因測(cè)序結(jié)果：根據(jù)珠蛋白生成障礙性貧血血液學(xué)表型分析結(jié)果與以上所測(cè)珠蛋白生成障礙性貧血基因不符的現(xiàn)象，對(duì)該受測(cè)者樣本加做β珠蛋白基因測(cè)序。對(duì)此，發(fā)明人根據(jù)ncbi(nationalcenterforbiotechnologyinformation)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心有關(guān)中國(guó)人正常珠蛋白基因序列設(shè)計(jì)引物，針對(duì)β-珠蛋白基因特異性pcr引物設(shè)計(jì)了大量引物，通過(guò)引物反應(yīng)條件的優(yōu)化和比較，篩選出了特異性好的引物，同時(shí)擴(kuò)增全mrna序列進(jìn)行測(cè)序。表3本發(fā)明提供的引物根據(jù)本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物，通過(guò)業(yè)內(nèi)公認(rèn)的一代測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)的abi3730測(cè)序儀進(jìn)行基因測(cè)序，得到以下測(cè)序結(jié)果(見(jiàn)圖7)：通過(guò)第一對(duì)特異性pcr引物所擴(kuò)增的基因序列如下：1gccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtg61ccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccaca121ccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcata181aaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactag241caacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgcc301ctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca361aggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagac421tcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttag481gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccac541tcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgc601ctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtga661gctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgc721ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataag781taacagggtacagt(seqidno：5)。通過(guò)第二對(duì)特異性pcr引物所擴(kuò)增的基因序列如下：1ggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaaga61ggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt121gggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacc181tcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactt241tggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggc301taatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaa361ggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagc421atctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatt481tctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatt(seqidno：6)。三、一種少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因測(cè)序的具體技術(shù)方案1.dna測(cè)序模板處理1)exosap-it和h2o以2.0μl：3.0μl混合，震蕩混勻后，分裝5.0μl至新的8連管中；2)每孔加入pcr產(chǎn)物2.0μl，混勻微離心；3)在pcr儀中進(jìn)行酶切反應(yīng)，程序：37℃,15min；80℃,15min；4℃,infinite。2.測(cè)序pcr體系配制按以下比例準(zhǔn)備測(cè)序pcr反應(yīng)體系：reaction1/4×bdtv3.11.0μl5xseqbuffer1.5μlprimer3.2μm1.0μlh2o5.5μltemplate1.0μl處理方式：a)取出引物、無(wú)dnaase和rnaase的h2o、bdtv3.1和buffer，室溫溶解后微離心；b)選擇合適的體系，1/4×，按表格中比例配制好，加入順序?yàn)閔2o、buffer、primer，最后為bdtv3.1，震蕩混勻后微離心，分裝每孔9.0μl至96孔板相應(yīng)位置。3.測(cè)序pcr反應(yīng)a)向每管中加入經(jīng)exosap-it處理的dna測(cè)序模板1.0μl；b)蓋好上蓋后，振蕩混勻后，微離，使混合物沉入管底；c)在pcr儀中進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，反應(yīng)程序：96℃,1min→(96℃,10sec→50℃,5sec→60℃,4min),25個(gè)循環(huán)→4℃保溫。4.測(cè)序pcr產(chǎn)物純化方案：10μl化反應(yīng)體系，96孔板，酒精/edta/naac法a)每管加入1.0μl125mmedta到管底，每管加入1.0μl3mnaac到管底；b)每管加入35.0μl100％酒精，鋁箔或膠蓋封嚴(yán)密，震蕩混勻4次，室溫放置15min；c)3700rpm離心30min，馬上倒置96孔板，離心至850rpm停止離心；d)每管加入50.0μ0的-20入預(yù)冷70％酒精，3700rpm離心15min；馬上倒置96孔板，離心至850rpm停止離心；e)重復(fù)用預(yù)冷70％酒精洗滌1次；f)室溫?fù)]發(fā)凈酒精，加入10.0μlhi-diformamide溶解dna；g)溶解后的樣品需要在95℃變性4min，迅速置冰中冷卻4min后(取出后置于-20℃冰箱)，上樣電泳。5.電泳參考基因分析儀abi3730標(biāo)準(zhǔn)操作流程。6.結(jié)果分析方法打開(kāi)軟件sequencinganalysis5.2，載入測(cè)序結(jié)果，察看lor值、rawdata、bcstatus、ppstatus。原則上應(yīng)該盡量使質(zhì)控品的結(jié)果達(dá)到最佳，詳細(xì)的軟件操作說(shuō)明參考《appliedbiosystemsdnasequencinganalysissoftwarev5.1》，根據(jù)具體的測(cè)序要求評(píng)價(jià)測(cè)序結(jié)果，應(yīng)滿足以下情況：6.1.測(cè)序目的信號(hào)強(qiáng)度應(yīng)該在500-2000fu，噪音信號(hào)應(yīng)該控制在0-15fu；6.2.對(duì)所有測(cè)序序列進(jìn)行評(píng)估，依照以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，如下：7.測(cè)序結(jié)果發(fā)明人采用上述引物對(duì)基因進(jìn)行擴(kuò)增，有效地?cái)U(kuò)增了該待測(cè)對(duì)象的β珠蛋白基因。通過(guò)第一對(duì)特異性pcr引物所擴(kuò)增的基因序列如下：1gccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtg61ccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccaca121ccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcata181aaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactag241caacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgcc301ctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca361aggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagac421tcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttag481gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccac541tcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgc601ctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtga661gctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgc721ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataag781taacagggtacagt。通過(guò)第二對(duì)特異性pcr引物所擴(kuò)增的基因序列如下：1ggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaaga61ggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt121gggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacc181tcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactt241tggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggc301taatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaa361ggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagc421atctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatt481tctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatt。測(cè)序結(jié)果表明，發(fā)現(xiàn)待測(cè)對(duì)象的β珠蛋白基因中，β珠蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置出現(xiàn)c>t突變，即β珠蛋白轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游-90位置(c->t)beta+雜合突變(hbb:c.-140c>t)。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，若基因型診斷結(jié)果正常，受測(cè)者具有明顯小細(xì)胞低色素且hba2＞3.5％的個(gè)體，則應(yīng)考慮受試者具有除17種β-珠蛋白生成障礙性貧血突變以外的罕見(jiàn)或少見(jiàn)基因型突變，須進(jìn)一步做β-珠蛋白生成障礙性貧血基因序列分析，這些技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用能有效地檢測(cè)出稀有珠蛋白生成障礙性貧血基因并明確具體的基因型。本發(fā)明技術(shù)可用于準(zhǔn)確的檢測(cè)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因序列，促進(jìn)一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血基因的功能分析和研究。sequencelisting<110>廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司<120>一種檢測(cè)少見(jiàn)型β-珠蛋白生成障礙性貧血突變的引物及試劑盒<130>hbb<160>6<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工引物<400>1gccaagagatatatcttagag21<210>2<211>21<212>dna<213>人工引物<400>2actgtaccctgttacttatcc21<210>3<211>22<212>dna<213>人工引物<400>3ggcaatagcaatatctctgcat22<210>4<211>22<212>dna<213>人工引物<400>4aatgcactgacctcccacattc22<210>5<211>794<212>dna<213>人類<400>5gccaagagatatatcttagagggagggctgagggtttgaagtccaactcctaagccagtg60ccagaagagccaaggacaggtacggctgtcatcacttagacctcaccctgtggagccaca120ccctagggttggccaatctactcccaggagcagggagggcaggagccagggctgggcata180aaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactag240caacctcaaacagacaccatggtgcatctgactcctgaggagaagtctgccgttactgcc300ctgtggggcaaggtgaacgtggatgaagttggtggtgaggccctgggcaggttggtatca360aggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagac420tcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacccttag480gctgctggtggtctacccttggacccagaggttctttgagtcctttggggatctgtccac540tcctgatgctgttatgggcaaccctaaggtgaaggctcatggcaagaaagtgctcggtgc600ctttagtgatggcctggctcacctggacaacctcaagggcacctttgccacactgagtga660gctgcactgtgacaagctgcacgtggatcctgagaacttcagggtgagtctatgggacgc720ttgatgttttctttccccttcttttctatggttaagttcatgtcataggaaggggataag780taacagggtacagt794<210>6<211>524<212>dna<213>人類<400>6ggcaatagcaatatctctgcatataaatatttctgcatataaattgtaactgatgtaaga60ggtttcatattgctaatagcagctacaatccagctaccattctgcttttattttatggtt120gggataaggctggattattctgagtccaagctaggcccttttgctaatcatgttcatacc180tcttatcttcctcccacagctcctgggcaacgtgctggtctgtgtgctggcccatcactt240tggcaaagaattcaccccaccagtgcaggctgcctatcagaaagtggtggctggtgtggc300taatgccctggcccacaagtatcactaagctcgctttcttgctgtccaatttctattaaa360ggttcctttgttccctaagtccaactactaaactgggggatattatgaagggccttgagc420atctggattctgcctaataaaaaacatttattttcattgcaatgatgtatttaaattatt480tctgaatattttactaaaaagggaatgtgggaggtcagtgcatt524當(dāng)前第1頁(yè)12