本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

我國是抗生素濫用情況最為嚴重的國家之一，然而隨著抗生素使用量的加大，細菌耐藥情況也越發(fā)嚴重?？股胤N類繁多，作用機制多樣，其中β-內(nèi)酰胺類抗生素中的碳青霉烯類可以通過與革蘭氏陽性細菌或陰性細菌中大分子量青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的高度親和力，通過抑制細菌細胞壁合成而發(fā)揮殺菌作用。耐藥細菌體內(nèi)的耐藥基因(如耐藥基因OXA-23、耐藥基因OXA-24、耐藥基因OXA-58、耐藥基因OXA-66、耐藥基因KPC-2、耐藥基因IMP-4或耐藥基因VIM-2)則可通過產(chǎn)生滅活碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，OprD缺乏或存在外排泵，PBP靶位改變導(dǎo)致親和力下降等機制完成使碳青霉烯類抗生素失活的作用。

細菌產(chǎn)生耐藥性的原因很多，主要分為產(chǎn)生滅活酶、抗菌藥物作用靶位改變、改變細菌外膜通透性、影響主動泵出系統(tǒng)、影響細菌被膜的形成及交叉耐藥性等六方面。

目前關(guān)于對細菌耐藥性的檢測主要有以下幾種方法：細菌耐藥表型的檢測(包括耐藥篩選試驗、折點敏感試驗及藥敏試驗的儀器化和自動化等)、β-內(nèi)酰胺酶檢測、特殊耐藥菌檢測和耐藥基因檢測等。其中最為直觀的檢測方法是以體外培養(yǎng)的藥物檢測，但仍存在培養(yǎng)時間長等缺陷。隨著耐藥機理的研究逐步深入，分子生物學(xué)方法檢測細菌耐藥逐漸被臨床接受。常見檢測細菌耐藥基因的方法主要有：聚合酶鏈式反應(yīng)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析、PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析、生物芯片技術(shù)、自動DNA測序等。傳統(tǒng)的基因鑒定方法為PCR法和DNA測序法，其中傳統(tǒng)的PCR法檢測周期較長，通常需要3-4個小時；Sanger DNA測序法對引物特異性要求較高，且價格較昂貴，后期數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜，不適合臨床推廣使用。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是利用一種具有鏈置換活性和瀑布式核酸擴增功能的Bst DNA聚合酶，在等溫條件下進行核酸的變性和自動循環(huán)的鏈置換核酸擴增反應(yīng)。LAMP針對靶序列的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用具備鏈置換功能的DNA聚合酶在恒定溫度下不斷復(fù)制擴增DNA。為了提高反應(yīng)效率，可在反應(yīng)體系中添加兩條環(huán)引物，使之分別與莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合，啟動鏈置換合成，循環(huán)復(fù)制。

LAMP具有簡便、快速、靈敏、特異的優(yōu)勢，尤其適合在基層開展LAMP試劑盒的應(yīng)用推廣。LAMP技術(shù)中，引物是決定檢測結(jié)果靈敏度和特異性的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的為提供一種用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用。

本發(fā)明首先提供了一種引物組合，為如下(a1)或(a2)或(a3)：

(a1)由引物組Ⅰ、引物組Ⅱ、引物組Ⅲ、引物組Ⅳ、引物組Ⅴ、引物組Ⅵ和引物組Ⅶ組成；

(a2)由所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ、所述引物組Ⅵ和所述引物組Ⅶ中的任意兩個、任意三個、任意四個、任意五個或任意六個組成；

(a3)所述引物組Ⅰ、所述引物組Ⅱ、所述引物組Ⅲ、所述引物組Ⅳ、所述引物組Ⅴ、所述引物組Ⅵ或所述引物組Ⅶ。

所述引物組Ⅰ可由引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB組成；

所述引物Ⅰ-F3可為如下(b1)或(b2)；

(b1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(b2)將序列1經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-B3可為如下(b3)或(b4)；

(b3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(b4)將序列2經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-FIP可為如下(b5)或(b6)；

(b5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；

(b6)將序列3經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-BIP可為如下(b7)或(b8)；

(b7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；

(b8)將序列4經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LF可為如下(b9)或(b10)；

(b9)序列表的序列5所示的單鏈DNA分子；

(b10)將序列5經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅰ-LB可為如下(b11)或(b12)；

(b11)序列表的序列6所示的單鏈DNA分子；

(b12)將序列6經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅱ可由引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB組成；

所述引物Ⅱ-F3可為如下(c1)或(c2)；

(c1)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；

(c2)將序列7經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-B3可為如下(c3)或(c4)；

(c3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子；

(c4)將序列8經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-FIP可為如下(c5)或(c6)；

(c5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；

(c6)將序列9經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-BIP可為如下(c7)或(c8)；

(c7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；

(c8)將序列10經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-LF可為如下(c9)或(c10)；

(c9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；

(c10)將序列11經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅱ-LB可為如下(c11)或(c12)；

(c11)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子；

(c12)將序列12經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅲ可由引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB組成；

所述引物Ⅲ-F3可為如下(d1)或(d2)；

(d1)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；

(d2)將序列13經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-B3可為如下(d3)或(d4)；

(d3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子；

(d4)將序列14經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-FIP可為如下(d5)或(d6)；

(d5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子；

(d6)將序列15經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-BIP可為如下(d7)或(d8)；

(d7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子；

(d8)將序列16經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-LF可為如下(d9)或(d10)；

(d9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子；

(d10)將序列17經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅲ-LB可為如下(d11)或(d12)；

(d11)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子；

(d12)將序列18經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅳ可由引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB組成；

所述引物Ⅳ-F3可為如下(e1)或(e2)；

(e1)序列表的序列19所示的單鏈DNA分子；

(e2)將序列19經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅳ-B3可為如下(e3)或(e4)；

(e3)序列表的序列20所示的單鏈DNA分子；

(e4)將序列20經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅳ-FIP可為如下(e5)或(e6)；

(e5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子；

(e6)將序列21經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅳ-BIP可為如下(e7)或(e8)；

(e7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子；

(e8)將序列22經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅳ-LF可為如下(e9)或(e10)；

(e9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子；

(e10)將序列23經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅳ-LB可為如下(e11)或(e12)；

(e11)序列表的序列24所示的單鏈DNA分子；

(e12)將序列24經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅴ可由引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB組成；

所述引物Ⅴ-F3可為如下(f1)或(f2)；

(f1)序列表的序列25所示的單鏈DNA分子；

(f2)將序列25經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列25具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅴ-B3可為如下(f3)或(f4)；

(f3)序列表的序列26所示的單鏈DNA分子；

(f4)將序列26經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列26具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅴ-FIP可為如下(f5)或(f6)；

(f5)序列表的序列27所示的單鏈DNA分子；

(f6)將序列27經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列27具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅴ-BIP可為如下(f7)或(f8)；

(f7)序列表的序列28所示的單鏈DNA分子；

(f8)將序列28經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列28具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅴ-LF可為如下(f9)或(f10)；

(f9)序列表的序列29所示的單鏈DNA分子；

(f10)將序列29經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列29具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅴ-LB可為如下(f11)或(f12)；

(f11)序列表的序列30所示的單鏈DNA分子；

(f12)將序列30經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列30具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅵ可由引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB組成；

所述引物Ⅵ-F3可為如下(g1)或(g2)；

(g1)序列表的序列31所示的單鏈DNA分子；

(g2)將序列31經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列31具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅵ-B3可為如下(g3)或(g4)；

(g3)序列表的序列32所示的單鏈DNA分子；

(g4)將序列32經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列32具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅵ-FIP可為如下(g5)或(g6)；

(g5)序列表的序列33所示的單鏈DNA分子；

(g6)將序列33經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列33具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅵ-BIP可為如下(g7)或(g8)；

(g7)序列表的序列34所示的單鏈DNA分子；

(g8)將序列34經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列34具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅵ-LF可為如下(g9)或(g10)；

(g9)序列表的序列35所示的單鏈DNA分子；

(g10)將序列35經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列35具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅵ-LB可為如下(g11)或(g12)；

(g11)序列表的序列36所示的單鏈DNA分子；

(g12)將序列36經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列36具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅶ可由引物Ⅶ-F3、引物Ⅶ-B3、引物Ⅶ-FIP、引物Ⅶ-BIP、引物Ⅶ-LF和引物Ⅶ-LB組成；

所述引物Ⅶ-F3可為如下(h1)或(h2)；

(h1)序列表的序列37所示的單鏈DNA分子；

(h2)將序列37經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列37具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅶ-B3可為如下(h3)或(h4)；

(h3)序列表的序列38所示的單鏈DNA分子；

(h4)將序列38經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列38具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅶ-FIP可為如下(h5)或(h6)；

(h5)序列表的序列39所示的單鏈DNA分子；

(h6)將序列39經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列39具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅶ-BIP可為如下(h7)或(h8)；

(h7)序列表的序列40所示的單鏈DNA分子；

(h8)將序列40經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列40具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅶ-LF可為如下(h9)或(h10)；

(h9)序列表的序列41所示的單鏈DNA分子；

(h10)將序列41經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列41具有相同功能的DNA分子；

所述引物Ⅶ-LB可為如下(h11)或(h12)；

(h11)序列表的序列42所示的單鏈DNA分子；

(h12)將序列42經(jīng)過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列42具有相同功能的DNA分子。

所述引物組Ⅰ中，引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅱ中，引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅲ中，引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅳ中，引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅴ中，引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅵ中，引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

所述引物組Ⅶ中，引物Ⅶ-F3、引物Ⅶ-B3、引物Ⅶ-FIP、引物Ⅶ-BIP、引物Ⅶ-LF和引物Ⅶ-LB的摩爾比具體可為0.5：0.5：2：2：1：1。

本發(fā)明還保護所述引物組合在制備試劑盒中的應(yīng)用；所述試劑盒的用途可為如下(y1)或(y2)或(y3)：

(y1)鑒定耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2；

(y2)用于檢測待測樣本中是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2；

(y3)用于檢測待測菌是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2。

本發(fā)明還保護含有所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途可為如下(y1)或(y2)或(y3)：

(y1)鑒定耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2；

(y2)用于檢測待測樣本中是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2；

(y3)用于檢測待測菌是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2。

本發(fā)明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。

本發(fā)明還保護一種檢測待測菌是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測菌的基因組DNA；

(2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，分別采用所述引物組合中的每個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，然后進行如下判斷：

如果采用所述引物組Ⅰ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因OXA-23；如果采用所述引物組Ⅰ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-23；

如果采用所述引物組Ⅱ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因OXA-24；如果采用所述引物組Ⅱ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-24；

如果采用所述引物組Ⅲ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因OXA-58；如果采用所述引物組Ⅲ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-58；

如果采用所述引物組Ⅳ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因OXA-66；如果采用所述引物組Ⅳ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-66；

如果采用所述引物組Ⅴ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因KPC-2；如果采用所述引物組Ⅴ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因KPC-2；

如果采用所述引物組Ⅵ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因IMP-4；如果采用所述引物組Ⅵ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因IMP-4；

如果采用所述引物組Ⅶ可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中含有或疑似含有耐藥基因VIM-2；如果采用所述引物組Ⅶ不可以實現(xiàn)以所述基因組DNA為模板的特異性擴增，待測菌中不含有或疑似不含有耐藥基因VIM-2。

本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣本的總DNA；

(2)以步驟(1)提取的總DNA為模板，分別采用所述引物組合中的每個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增，然后進行如下判斷：

如果采用所述引物組Ⅰ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因OXA-23；如果采用所述引物組Ⅰ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-23；

如果采用所述引物組Ⅱ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因OXA-24；如果采用所述引物組Ⅱ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-24；

如果采用所述引物組Ⅲ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因OXA-58；如果采用所述引物組Ⅲ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-58；

如果采用所述引物組Ⅳ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因OXA-66；如果采用所述引物組Ⅳ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因OXA-66；

如果采用所述引物組Ⅴ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因KPC-2；如果采用所述引物組Ⅴ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因KPC-2；

如果采用所述引物組Ⅵ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因IMP-4；如果采用所述引物組Ⅵ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因IMP-4；

如果采用所述引物組Ⅶ可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中含有或疑似含有耐藥基因VIM-2；如果采用所述引物組Ⅶ不可以實現(xiàn)以所述總DNA為模板的特異性擴增，待測樣本中不含有或疑似不含有耐藥基因VIM-2。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅰ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅰ-F3、引物Ⅰ-B3、引物Ⅰ-FIP、引物Ⅰ-BIP、引物Ⅰ-LF和引物Ⅰ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅱ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅱ-F3、引物Ⅱ-B3、引物Ⅱ-FIP、引物Ⅱ-BIP、引物Ⅱ-LF和引物Ⅱ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅲ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅲ-F3、引物Ⅲ-B3、引物Ⅲ-FIP、引物Ⅲ-BIP、引物Ⅲ-LF和引物Ⅲ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅳ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅳ-F3、引物Ⅳ-B3、引物Ⅳ-FIP、引物Ⅳ-BIP、引物Ⅳ-LF和引物Ⅳ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅴ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅴ-F3、引物Ⅴ-B3、引物Ⅴ-FIP、引物Ⅴ-BIP、引物Ⅴ-LF和引物Ⅴ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅵ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅵ-F3、引物Ⅵ-B3、引物Ⅵ-FIP、引物Ⅵ-BIP、引物Ⅵ-LF和引物Ⅵ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，采用所述引物組Ⅶ時，所述環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的反應(yīng)體系中引物Ⅶ-F3、引物Ⅶ-B3、引物Ⅶ-FIP、引物Ⅶ-BIP、引物Ⅶ-LF和引物Ⅶ-LB的摩爾濃度依次為0.5μM、0.5μM、2μM、2μM、1μM、1μM。

以上任一所述方法中，環(huán)介導(dǎo)等溫擴增反應(yīng)條件為：65℃恒溫50min。

本發(fā)明還保護所述引物組合在檢測待測菌是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護所述引物組合在檢測待測樣本中是否含有耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2中的應(yīng)用。

本發(fā)明還保護所述引物組合在鑒定耐藥基因OXA-23和/或耐藥基因OXA-24和/或耐藥基因OXA-58和/或耐藥基因OXA-66和/或耐藥基因KPC-2和/或耐藥基因IMP-4和/或耐藥基因VIM-2中的應(yīng)用。

以上任一所述待測樣本可為人(Homo sapiens)的膿液。

以上任一所述耐藥基因OXA-23具體可為Genebank號為KP203815.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐藥基因OXA-24具體可為Genebank號為KR922888.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐藥基因OXA-58具體可為Genebank號為KF740447.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐藥基因OXA-66具體可為Genebank號為DQ923479.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐藥基因KPC-2具體可為Genebank號為KT001101.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐藥基因IMP-4具體可為Genebank號為AY795963.1的核苷酸序列所示的DNA分子。以上任一所述耐藥基因VIM-2具體可為NCBI Gene ID號為14678525的核苷酸序列所示的DNA分子。

環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是近年來發(fā)展出的一種敏感、特異、簡便、快捷的核酸擴增技術(shù),其原理是在一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶的作用下，識別6-8個區(qū)域的4-6條引物，在等溫條件下快速、特異地擴增目的基因，可推廣應(yīng)用于快速、準確的檢測常見的碳青霉烯類耐藥基因。LAMP方法具有靈敏性高、特異性好、反應(yīng)時間短、判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢。

本發(fā)明提供的引物組合鑒定用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因，具有高特異性和高靈敏度，可以實現(xiàn)簡便、快速、準確檢測。本發(fā)明具有重大的推廣價值。

附圖說明

圖1為實施例2中采用引物組Ⅰ的檢測結(jié)果。

圖2為實施例2中采用引物組Ⅱ的檢測結(jié)果。

圖3為實施例2中采用引物組Ⅲ的檢測結(jié)果。

圖4為實施例2中采用引物組Ⅳ的檢測結(jié)果。

圖5為實施例2中采用引物組Ⅴ的檢測結(jié)果。

圖6為實施例2中采用引物組Ⅵ的檢測結(jié)果。

圖7為實施例2中采用引物組Ⅶ的檢測結(jié)果。

圖8為實施例4中樣本一的檢測結(jié)果。

圖9為實施例4中樣本二的檢測結(jié)果。

圖10為實施例4中樣本三的檢測結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

反應(yīng)液為博奧生物集團有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為CP.440020。pUC57質(zhì)粒為生工生物工程(上海)股份有限公司的產(chǎn)品。-T Easy質(zhì)粒為Promega公司的產(chǎn)品。

DNA拷貝數(shù)的計算方法如下：

1 A260吸光度值＝ds DNA 50μg/ml；

核酸濃度＝(OD260)×(稀釋倍數(shù))×(50)＝x ng/μl；

平均分子量(MW)代表克/摩爾，單位道爾頓(dolton)，即1dolton＝1g/mol；

摩爾＝6.02×10²³；

平均分子量(MW)：dsDNA＝(堿基數(shù))×(660道爾頓/堿基)；

拷貝數(shù)計算公式：

(6.02×10²³copies/摩爾)×(x ng/μl×10^-9)/(DNA長度×660)＝copies/μl。

實施例1、試劑盒的制備

試劑盒由七個LAMP引物組組成，每個引物組用于檢測一種耐碳青霉烯類抗生素的耐藥基因。

用于檢測耐藥基因OXA-23的引物組如下：

外引物F3：5’-GAATATGTGCCAGCCTCTA-3’(序列表中序列1)；

外引物B3：5’-TCTTTTTGCATGAGATCAAGAC-3’(序列表中序列2)；

內(nèi)引物FIP：5’-CCTTTTCTCGCCCTTCCATTTAAATTTGAATGCCCTGATCGGA-3’(序列表中序列3)；

內(nèi)引物BIP：5’-TACCGCTTGGGAAAAAGACATGGTCGCGCAAGTTCCTGA-3’(序列表中序列4)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-CCGTTTTCTGGTTCTCCAA-3’(序列表中序列5)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-ACACTAGGAGAAGCCATGA-3’(序列表中序列6)。

用于檢測耐藥基因OXA-24的引物組如下：

外引物F3：5’-CTGTGTTCCAATATTTGTATTTCC-3’(序列表中序列7)；

外引物B3：5’-GCAACAACAAATGAGATTTTCA-3’(序列表中序列8)；

內(nèi)引物FIP：5’-ATCAAGAGCTTGCAAGACGGACATTAACCCGCTTTACTTCTTTCTG-3’(序列表中序列9)；

內(nèi)引物BIP：5’-CTGGAACTGCTGACAATGCCATTGAATGGGATGGTAAAAAAAGAACTT-3’(序列表中序列10)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-TGGCCTAGAGCTAATG-3’(序列表中序列11)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-CCTCACCTAAAGTCATATC-3’(序列表中序列12)。

用于檢測耐藥基因OXA-58的引物組如下：

外引物F3：5’-CCAATTAGTGCATTGGCAATT-3’(序列表中序列13)；

外引物B3：5’-TTGGGGCTTGTGCTGAG-3’(序列表中序列14)；

內(nèi)引物FIP：5’-TGTGTTTGTCACATATGATGGTCAAAGATGCAGGAATATAAGCTGTT-3’(序列表中序列15)；

內(nèi)引物BIP：5’-CGCTTGAACATTCTGATCGATGATTATGAGTCGAGCAAAAACAAGTACA-3’(序列表中序列16)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-GCATTTAGACCGAGCA-3’(序列表中序列17)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-GAGTTATTCACTTGTGGAA-3’(序列表中序列18)。

用于檢測耐藥基因OXA-66的引物組如下：

外引物F3：5’-CTAATAAAACGCTTCCATTTAGC-3’(序列表中序列19)；

外引物B3：5’-GAACAGAGCTAGGTATTCCTT-3’(序列表中序列20)；

內(nèi)引物FIP：5’-ACATCCCATCCCCAACCACTTTTTGTCCAAGATGAAGTGCAATCC-3’(序列表中序列21)；

內(nèi)引物BIP：5’-CCACAAGTAGGCTGGTTAACTGTCTAAGTTAAGGGAGAACGCTACA-3’(序列表中序列22)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-CCATTCTTTTCTTCTATGAATAGCA-3’(序列表中序列23)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-TTGTTCAGCCTCAAGGGAAT-3’(序列表中序列24)。

用于檢測耐藥基因KPC-2的引物組如下：

外引物F3：5’-CTGACGGCCTTCATGCG-3’(序列表中序列25)；

外引物B3：5’-GCCAATCAACAAACTGCT-3’(序列表中序列26)；

內(nèi)引物FIP：5’-ATGGCGGAGTTCAGCTCCATCTATCGGCGATACCACGT-3’(序列表中序列27)；

內(nèi)引物BIP：5’-AGGCGATGCGCGCGATACCCAGTGTCAGTTTTTGTAAGC-3’(序列表中序列28)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-CCAGCGGTCCAGACG-3’(序列表中序列29)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-GCGCCGTGACGGAAA-3’(序列表中序列30)。

用于檢測耐藥基因IMP-4的引物組如下：

外引物F3：5’-TCTAATTGACACTCCATTTACG-3’(序列表中序列31)；

外引物B3：5’-AGTTAACCCCGCCAAAT-3’(序列表中序列32)；

內(nèi)引物FIP：5’-ATGAAAATGAGAGGAAATACTGCCTATACTGAAAAGTTAGTCACTTGGT-3’(序列表中序列33)；

內(nèi)引物BIP：5’-TGGCTTAATTCTCAATCCATCCCTTAGCTTGAACCTTACCGTCT-3’(序列表中序列34)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-ATAGCCACGTTCCACAA-3’(序列表中序列35)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-CGTATGCGTCTGAATTAAC-3’(序列表中序列36)。

用于檢測耐藥基因VIM-2的引物組如下：

外引物F3：5’-GGCACTTCTCGCGGAGA-3’(序列表中序列37)；

外引物B3：5’-GCTCGATGAGAGTCCTTCT-3’(序列表中序列38)；

內(nèi)引物FIP：5’-CGACGCGGTCGTCATGAAAGCAAATTGGACTTCCTGTAACG-3’(序列表中序列39)；

內(nèi)引物BIP：5’-GGCTGGGGTGGCAACGTACAGTGCGTGGGAATCTCG-3’(序列表中序列40)；

環(huán)引物L(fēng)F：5’-GCGTGGAGACTGCAC-3’(序列表中序列41)；

環(huán)引物L(fēng)B：5’-GCATCACCGTCGACAC-3’(序列表中序列42)。

用于檢測耐藥基因OXA-23的引物組命名為引物組Ⅰ。用于檢測耐藥基因OXA-24的引物組命名為引物組Ⅱ。用于檢測耐藥基因OXA-58的引物組命名為引物組Ⅲ。用于檢測耐藥基因OXA-66的引物組命名為引物組Ⅳ。用于檢測耐藥基因KPC-2的引物組命名為引物組Ⅴ。用于檢測耐藥基因IMP-4的引物組命名為引物組Ⅵ。用于檢測耐藥基因VIM-2的引物組命名為引物組Ⅶ。

實施例2、特異性實驗

待測樣本1：含耐藥基因OXA-23的質(zhì)粒。含耐藥基因OXA-23的質(zhì)粒的制備方法為：將-T Easy質(zhì)粒的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號為KP203815.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因OXA-23的質(zhì)粒。

待測樣本2：含耐藥基因OXA-24的質(zhì)粒。含耐藥基因OXA-24的質(zhì)粒的制備方法為：將-T Easy質(zhì)粒的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號為KR922888.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因OXA-24的質(zhì)粒。

待測樣本3：含耐藥基因OXA-58的質(zhì)粒。含耐藥基因OXA-58的質(zhì)粒的制備方法為：將-T Easy質(zhì)粒的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號為KF740447.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因OXA-58的質(zhì)粒。

待測樣本4：含耐藥基因OXA-66的質(zhì)粒。含耐藥基因OXA-66的質(zhì)粒的制備方法為：將pUC57質(zhì)粒的MCS區(qū)間的DNA片段替換為Genebank號為DQ923479.1所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因OXA-66的質(zhì)粒。

待測樣本5：含耐藥基因KPC-2的質(zhì)粒。含耐藥基因KPC-2的質(zhì)粒的制備方法為：將-T Easy質(zhì)粒的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號為KT001101.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因KPC-2的質(zhì)粒。

待測樣本6：含耐藥基因IMP-4的質(zhì)粒。含耐藥基因IMP-4的質(zhì)粒的制備方法為：將-T Easy質(zhì)粒的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為Genebank號為AY795963.1的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因IMP-4的質(zhì)粒。

待測樣本7：含耐藥基因VIM-2的質(zhì)粒。含耐藥基因VIM-2的質(zhì)粒的制備方法為：將-T Easy質(zhì)粒的EcoRI和SpeI間的DNA片段替換為NCBI Gene ID號為14678525的核苷酸序列所示的DNA分子，得到的重組質(zhì)粒即為含耐藥基因VIM-2的質(zhì)粒。

各個待測樣本分別進行如下步驟：

1、提取待測樣本的質(zhì)粒DNA。

2、以步驟1提取的質(zhì)粒DNA為模板，分別采用實施例1制備的各個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。

反應(yīng)體系(10μL)：7.0μL反應(yīng)液、1μL引物混合物、1μL質(zhì)粒DNA(5pg-50pg)，補水至10μL。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物F3和外引物B3的終濃度均為0.5μM，內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP的終濃度均為2μM，環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B的終濃度均為1μM。

反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。反應(yīng)過程中，采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

按照上述方法，將質(zhì)粒DNA替換為無菌水，其它步驟均不變，作為空白對照。

采用引物組Ⅰ的結(jié)果見圖1(“S型”擴增曲線為待測樣本1，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因OXA-23的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本2、待測樣本3、待測樣本4、待測樣本5、待測樣本6或待測樣本7的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅱ的結(jié)果見圖2(“S型”擴增曲線為待測樣本2，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因OXA-24的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本1、待測樣本3、待測樣本4、待測樣本5、待測樣本6或待測樣本7的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅲ的結(jié)果見圖3(“S型”擴增曲線為待測樣本3，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因OXA-58的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本1、待測樣本2、待測樣本4、待測樣本5、待測樣本6或待測樣本7的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅳ的結(jié)果見圖4(“S型”擴增曲線為待測樣本4，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因OXA-66的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本1、待測樣本2、待測樣本3、待測樣本5、待測樣本6或待測樣本7的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅴ的結(jié)果見圖5(“S型”擴增曲線為待測樣本5，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因KPC-2的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本1、待測樣本2、待測樣本3、待測樣本4、待測樣本6或待測樣本7的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅵ的結(jié)果見圖6(“S型”擴增曲線為待測樣本6，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因IMP-4的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本1、待測樣本2、待測樣本3、待測樣本4、待測樣本5或待測樣本7的時候均不顯示陽性擴增曲線。

采用引物組Ⅶ的結(jié)果見圖7(“S型”擴增曲線為待測樣本7，非“S型”擴增曲線為其它待測樣本或空白對照)。待測樣本為含耐藥基因VIM-2的質(zhì)粒的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。待測樣本為待測樣本1、待測樣本2、待測樣本3、待測樣本4、待測樣本5或待測樣本6的時候均不顯示陽性擴增曲線。

以上結(jié)果表明，本發(fā)明提供的七個引物組分別對其靶標基因具有很高的特異性。

實施例3、靈敏度實驗

待測樣本1：實施例2中制備的含耐藥基因OXA-23的質(zhì)粒。

待測樣本2：實施例2中制備的含耐藥基因OXA-24的質(zhì)粒。

待測樣本3：實施例2中制備的含耐藥基因OXA-58的質(zhì)粒。

待測樣本4：實施例2中制備的含耐藥基因OXA-66的質(zhì)粒。

待測樣本5：實施例2中制備的含耐藥基因KPC-2的質(zhì)粒。

待測樣本6：實施例2中制備的含耐藥基因IMP-4的質(zhì)粒。

待測樣本7：實施例2中制備的含耐藥基因VIM-2的質(zhì)粒。

1、提取待測樣本的質(zhì)粒DNA，用無菌水進行梯度稀釋，得到各個稀釋液。

2、以步驟1得到的稀釋液為模板，分別采用實施例1制備的引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。

待測樣本為待測樣本1時，采用引物組Ⅰ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。待測樣本為待測樣本2時，采用引物組Ⅱ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。待測樣本為待測樣本3時，采用引物組Ⅲ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。待測樣本為待測樣本4時，采用引物組Ⅳ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。待測樣本為待測樣本5時，采用引物組Ⅴ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。待測樣本為待測樣本6時，采用引物組Ⅵ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。待測樣本為待測樣本7時，采用引物組Ⅶ進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。

反應(yīng)體系(10μL)：7.0μL反應(yīng)液、1μL引物混合物、1μL稀釋液(1μL稀釋液中含有的基因組拷貝數(shù)分別為10³、5×10²、10²或10¹)，補水至10μL。引物混合物即引物組中的各條引物組成的混合物。反應(yīng)體系中，外引物F3和外引物B3的終濃度均為0.5μM，內(nèi)引物FIP和內(nèi)引物BIP的終濃度均為2μM，環(huán)引物L(fēng)F和環(huán)引物L(fēng)B的終濃度均為1μM。

反應(yīng)條件：65℃恒溫50min。反應(yīng)過程中，采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

如果在50min內(nèi)出現(xiàn)陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)，表明反應(yīng)體系中的相應(yīng)基因組含量可以被檢測出來。如果在50min內(nèi)沒有出現(xiàn)陽性擴增曲線，表明反應(yīng)體系中的相應(yīng)基因組含量不能被檢測出來。

引物組Ⅰ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅱ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅲ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅳ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅴ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅵ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系，引物組Ⅶ檢測靶標基因的靈敏度為5×10²個拷貝數(shù)/反應(yīng)體系。

實施例4、應(yīng)用

待測樣本為如下樣本一、樣本二或樣本三：

樣本一：已通過藥敏鑒定及PCR測序鑒定確認含有耐藥基因OXA-23的膿液；

樣本二：已通過藥敏鑒定及PCR測序鑒定確認含有耐藥基因KPC-2的膿液；

樣本三：已通過藥敏鑒定及PCR測序鑒定確認含有耐藥基因IMP-4的膿液。

1、提取待測樣本的總DNA。

2、以步驟1提取的待測樣本的總DNA為模板，分別采用實施例1制備的各個引物組進行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增。

反應(yīng)體系與反應(yīng)條件均同實施例2。反應(yīng)過程中，采用熒光PCR儀檢測熒光信號。

按照上述方法，將待測樣本的總DNA替換為無菌水，其它步驟均不變，作為空白對照。

樣本一的結(jié)果見圖8(“S型”擴增曲線為引物組Ⅰ，非“S型”擴增曲線為其它引物組或空白對照)。采用引物組Ⅰ的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。采用引物組Ⅰ以外的其它六個引物組或空白對照的時候均不顯示陽性擴增曲線，與實際情況完全一致。

樣本二的結(jié)果見圖9(“S型”擴增曲線為引物組Ⅴ，非“S型”擴增曲線為其它引物組或空白對照)。采用引物組Ⅴ的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。采用引物組Ⅴ以外的其它六個引物組或空白對照的時候均不顯示陽性擴增曲線，與實際情況完全一致。

樣本三的結(jié)果見圖10(“S型”擴增曲線為引物組Ⅵ，非“S型”擴增曲線為其它引物組或空白對照)。采用引物組Ⅵ的時候顯示陽性擴增曲線(即擴增曲線為“S型”擴增曲線)。采用引物組Ⅵ以外的其它六個引物組或空白對照的時候均不顯示陽性擴增曲線，與實際情況完全一致。

以上結(jié)果表明，利用本發(fā)明提供的試劑盒可以對耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因進行檢測，結(jié)果準確可靠。

<110> 博奧生物集團有限公司

<120> 用于檢測耐碳青霉烯類抗生素的七種耐藥基因的LAMP引物組合及其應(yīng)用

<160> 42

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 1

gaatatgtgc cagcctcta 19

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 2

tctttttgca tgagatcaag ac 22

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 3

ccttttctcg cccttccatt taaatttgaa tgccctgatc gga 43

<210> 4

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 4

taccgcttgg gaaaaagaca tggtcgcgca agttcctga 39

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 5

ccgttttctg gttctccaa 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 6

acactaggag aagccatga 19

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 7

ctgtgttcca atatttgtat ttcc 24

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 8

gcaacaacaa atgagatttt ca 22

<210> 9

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 9

atcaagagct tgcaagacgg acattaaccc gctttacttc tttctg 46

<210> 10

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 10

ctggaactgc tgacaatgcc attgaatggg atggtaaaaa aagaactt 48

<210> 11

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 11

tggcctagag ctaatg 16

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 12

cctcacctaa agtcatatc 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 13

ccaattagtg cattggcaat t 21

<210> 14

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 14

ttggggcttg tgctgag 17

<210> 15

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 15

tgtgtttgtc acatatgatg gtcaaagatg caggaatata agctgtt 47

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 16

cgcttgaaca ttctgatcga tgattatgag tcgagcaaaa acaagtaca 49

<210> 17

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 17

gcatttagac cgagca 16

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 18

gagttattca cttgtggaa 19

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 19

ctaataaaac gcttccattt agc 23

<210> 20

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 20

gaacagagct aggtattcct t 21

<210> 21

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 21

acatcccatc cccaaccact ttttgtccaa gatgaagtgc aatcc 45

<210> 22

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 22

ccacaagtag gctggttaac tgtctaagtt aagggagaac gctaca 46

<210> 23

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 23

ccattctttt cttctatgaa tagca 25

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 24

ttgttcagcc tcaagggaat 20

<210> 25

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 25

ctgacggcct tcatgcg 17

<210> 26

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 26

gccaatcaac aaactgct 18

<210> 27

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 27

atggcggagt tcagctccat ctatcggcga taccacgt 38

<210> 28

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 28

aggcgatgcg cgcgataccc agtgtcagtt tttgtaagc 39

<210> 29

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 29

ccagcggtcc agacg 15

<210> 30

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 30

gcgccgtgac ggaaa 15

<210> 31

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 31

tctaattgac actccattta cg 22

<210> 32

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 32

agttaacccc gccaaat 17

<210> 33

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 33

atgaaaatga gaggaaatac tgcctatact gaaaagttag tcacttggt 49

<210> 34

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 34

tggcttaatt ctcaatccat cccttagctt gaaccttacc gtct 44

<210> 35

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 35

atagccacgt tccacaa 17

<210> 36

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 36

cgtatgcgtc tgaattaac 19

<210> 37

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223>

<400> 37

ggcacttctc gcggaga 17

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 38

gctcgatgag agtccttct 19

<210> 39

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 39

cgacgcggtc gtcatgaaag caaattggac ttcctgtaac g 41

<210> 40

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 40

ggctggggtg gcaacgtaca gtgcgtggga atctcg 36

<210> 41

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<400> 41

gcgtggagac tgcac 15

<210> 42

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

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<400> 42

gcatcaccgt cgacac 16