本發(fā)明及微生物分子生物學(xué)檢測試劑，具體涉及一種基于LAMP技術(shù)的干粉化產(chǎn)氣莢膜梭菌核酸快速診斷試劑盒及其使用方法。
背景技術(shù)：
：產(chǎn)氣莢膜梭菌曾稱魏氏梭菌或產(chǎn)氣莢膜桿菌，是臨床上氣性壞疽病原菌中最多見的一種梭菌，因能分解肌肉和結(jié)締組織中的糖，產(chǎn)生大量氣體，導(dǎo)致組織嚴重氣腫，繼而影響血液供應(yīng)，造成組織大面積壞死，加之本菌在體內(nèi)能形成莢膜，故名產(chǎn)氣夾膜梭菌。產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛分布于人畜糞便、土壤、污水等外環(huán)境中，其產(chǎn)生的腸毒素是引起食物中毒的主要因素，被產(chǎn)氣莢膜梭菌污染的水在加熱后，其芽孢仍可在較高溫度、長時間貯存的過程中生長、繁殖，最后進入腸道并產(chǎn)生腸毒素而引起中毒。產(chǎn)氣莢膜梭菌是指能夠指示水體已有糞便污染，并可能伴存有腸道病原菌的一類細菌，根據(jù)規(guī)定飲用天然礦泉水中不得檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌，現(xiàn)可用于瓶裝水中產(chǎn)氣莢膜梭菌檢驗的傳統(tǒng)生化方法有涂布法、多試管MPN法和濾膜法，為提高檢測效率，也可用酶聯(lián)免疫技術(shù)、核酸探針技術(shù)、核酸擴增技術(shù)等分子生物學(xué)檢測方法，進行快速檢測和結(jié)果初篩。這些技術(shù)試圖突破傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)、生化反應(yīng)等傳統(tǒng)模式，不需要對目標菌進行分離提純，而直接用樣品或者樣品的增菌液檢測，使得檢測向準確、快速和低成本方向發(fā)展。LAMP技術(shù)是2000年由日本研究人員Notomi等開發(fā)的一種新型的體外等溫擴增特異核酸片段的技術(shù)。該技術(shù)利用兩對特殊引物和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶。使反應(yīng)中在模板兩端引物結(jié)合處循環(huán)出現(xiàn)環(huán)狀單鏈結(jié)構(gòu)，在等溫條件下使引物順利與模板結(jié)合并進行鏈置換擴增反應(yīng)。LAMP用于快速檢測無需復(fù)雜儀器，具有結(jié)果判讀簡單、靈敏度高、特異性好、檢測范圍廣泛以及應(yīng)用成本低的優(yōu)點。在實際應(yīng)用中，檢測前均要配制相應(yīng)的溶液反應(yīng)體系，且其中成分較多，極易導(dǎo)致頻繁操作引起的試劑污染、檢測區(qū)間污染以及結(jié)果誤差等，加之該反應(yīng)體系中部分試劑需要冷凍儲存，如所需的BstDNA聚合酶需嚴格在-20℃條件下保存，溫度過高會影響其酶活性，造成檢測試劑失效。因此對該試劑的高溫長途運輸以及現(xiàn)場應(yīng)用等造成不便，也提高了相應(yīng)成本。同時，當前該檢測方法尚未在食品安全、醫(yī)藥等領(lǐng)域推廣開來，尤其在水體的快速檢測上，作為非標方法，目前已有的LAMP產(chǎn)品僅僅針對檢測流程，涉及到樣品前處理的方式均無提及。且市場上基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)的產(chǎn)氣莢膜梭菌快速診斷試劑盒較少，且能用于常溫運輸?shù)母煞坌屯惍a(chǎn)品尚未出現(xiàn)。干粉型LAMP快速檢測試劑盒開發(fā)的難點主要有以下幾個：1)保持凍干過程中BstDNA聚合酶的活力基本不損失；2)設(shè)計出合適的引物；3)顯色不夠明顯，難以區(qū)分結(jié)果。為了保持BstDNA聚合酶的活力，添加凍干保護劑是比較常規(guī)的選擇，常用的凍干保護劑是海藻糖，但是其保護效果比較有限，比較難以保證產(chǎn)品質(zhì)量。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有產(chǎn)氣莢膜梭菌檢測技術(shù)以及其相關(guān)產(chǎn)品制備工藝的不足，提供一種適于常溫運輸?shù)幕贚AMP技術(shù)的干粉化產(chǎn)氣莢膜梭菌快速診斷試劑盒以及其制備使用方法。該試劑盒和使用方法涵蓋從取樣到檢測的整體解決方案，可滿足食品安全中飲用水的生產(chǎn)流通各個環(huán)節(jié)的快速檢測的需求。本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：一種應(yīng)用于水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測試劑盒，包括凍干等溫擴增劑，復(fù)溶液、陽性對照干粉、陰性對照、顯色液、裂解液和封閉液，凍干等溫擴增劑中含有dNTPs、BstDNA聚合酶、外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物和凍干保護劑，凍干保護劑由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白組成。凍干等溫擴增劑在凍干前的組成為：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L環(huán)引物LF/LB以及凍干復(fù)合保護劑含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量為無菌超純水。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，凍干等溫擴增劑在凍干前的組成為：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L環(huán)引物LF/LB以及凍干復(fù)合保護劑含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量為無菌超純水。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，復(fù)溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜堿。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP以及環(huán)引物LF/LB的序列如下：產(chǎn)氣莢膜梭菌-F3：CTAGATATGAATGGCAAAGAGG產(chǎn)氣莢膜梭菌-B3：AGATATCAGCATAAAAATCCTCA產(chǎn)氣莢膜梭菌-FIP：GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTC-TATCTTGG產(chǎn)氣莢膜梭菌-BIP：TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT產(chǎn)氣莢膜梭菌-LF：CTCCAAAATAGTGCATAGCCTCT產(chǎn)氣莢膜梭菌-LB：TGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAA。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，顯色液由0.3～1.5mmol/L的鈣黃綠素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2混合得到，鈣黃綠素的終濃度為15～75μmol/L，MnCl2的終濃度為120～360μmol/L。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，封閉液為液體石蠟。一種水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測方法，包括如下步驟：1)取水樣抽濾，濾膜置于產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)；2)增菌培養(yǎng)完成后分離微生物，裂解后提取核酸；3)將復(fù)溶液加入凍干等溫擴增劑中，使凍干等溫擴增劑完全溶解，得到反應(yīng)液；4)按等溫擴增操作分別在不同管內(nèi)的反應(yīng)液中加入提取得到的樣品核酸、陽性對照和陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色液，對結(jié)果進行判斷。本發(fā)明的有益效果是：1)該試劑的干粉化制備工藝加入復(fù)合凍干保護劑，大大增加試劑穩(wěn)定性，試劑的保質(zhì)期時間可以延長到2年，便于常溫運輸，節(jié)約運輸成本，臨用前暴露于室溫72小時后基本不影響使用效果。2)該干粉化試劑已將反應(yīng)體系中部分組分試劑按相應(yīng)比例組合，并經(jīng)復(fù)溶液即溶即用，減少溶液配置步驟，使用更加便捷、準確，更適于基層現(xiàn)場檢測；3)該反應(yīng)過程在等溫條件下即可進行，無需特殊配套試劑以及儀器，大大降低了檢測成本；4)反應(yīng)所需模板量少，靈敏度高，最低檢驗限可低至11CFU/Test；5)利用靶基因序列設(shè)計并篩選三對引物，特異性地識別靶序列上的八個獨立區(qū)域，具有高度特異性，實現(xiàn)反應(yīng)在30～45min內(nèi)完成，高效而快速；6)通過反應(yīng)前加入由鈣黃綠素和氯化錳按照一定比例混合的顯色液，可通過肉眼顏色變化或者熒光監(jiān)測儀器對熒光圖譜的變化對結(jié)果進行判讀，陰陽性的顏色變化差異明顯，判讀直觀方便，且避免反應(yīng)后開蓋造成的氣溶膠污染。具體實施方式一種應(yīng)用于水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測試劑盒，包括凍干等溫擴增劑，復(fù)溶液、陽性對照干粉、陰性對照、顯色液、裂解液和封閉液，凍干等溫擴增劑中含有dNTPs、BstDNA聚合酶、外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物和凍干保護劑，凍干保護劑由海藻糖、甘氨酸和牛血清白蛋白組成。凍干等溫擴增劑在凍干前的組成為：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L環(huán)引物LF/LB以及凍干復(fù)合保護劑含3％～6％(w/v)海藻糖、0.01％-0.1％(w/v)甘氨酸、0.1％-1％牛血清白蛋白，余量為無菌超純水。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，凍干等溫擴增劑在凍干前的組成為：0.9～1.6mmol/LdNTPs、0.3～0.4U/μLBstDNA聚合酶、0.1～0.5μmol/L外引物F3/B3、1.0～2.0μmol/L內(nèi)引物FIP/BIP、0.5～1.5μmol/L環(huán)引物LF/LB以及凍干復(fù)合保護劑含4％～5％(w/v)海藻糖、0.04％-0.07％(w/v)甘氨酸、0.4％-0.7％牛血清白蛋白，余量為無菌超純水。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，復(fù)溶液含有2～9mmol/LMgSO4、8～12mmol/LKCl、15～20mmol/LTris-HCl、8～12mmol/L(NH4)2SO4、0.1～0.3％TritonX-100以及0.5～1.5mol/L甜菜堿。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，外引物F3/B3、內(nèi)引物FIP/BIP以及環(huán)引物LF/LB的序列如下：產(chǎn)氣莢膜梭菌-F3：CTAGATATGAATGGCAAAGAGG產(chǎn)氣莢膜梭菌-B3：AGATATCAGCATAAAAATCCTCA產(chǎn)氣莢膜梭菌-FIP：GGCAGTAACATTAGCAGGATGATATTAAACAAGCTACATTC-TATCTTGG產(chǎn)氣莢膜梭菌-BIP：TGATAGCGCAGGACATGTTAAGTTTGCAACCTGCTGTGTT產(chǎn)氣莢膜梭菌-LF：CTCCAAAATAGTGCATAGCCTCT產(chǎn)氣莢膜梭菌-LB：TGAAACTTTTGCAGAGGAAAGAAA。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，顯色液由0.3～1.5mmol/L的鈣黃綠素和2.4～7.2mmol/L的MnCl2混合得到，鈣黃綠素的終濃度為15～75μmol/L，MnCl2的終濃度為120～360μmol/L。作為上述快速檢測試劑盒的進一步改進，封閉液為液體石蠟。一種水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的快速檢測方法，包括如下步驟：1)取水樣抽濾，濾膜置于產(chǎn)氣莢膜梭菌增菌培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)；2)增菌培養(yǎng)完成后分離微生物，裂解后提取核酸；3)將復(fù)溶液加入凍干等溫擴增劑中，使凍干等溫擴增劑完全溶解，得到反應(yīng)液；4)按等溫擴增操作分別在不同管內(nèi)的反應(yīng)液中加入提取得到的樣品核酸、陽性對照和陰性對照，反應(yīng)結(jié)束后加入顯色液，對結(jié)果進行判斷。本試劑盒基于環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)快速檢測產(chǎn)氣莢膜梭菌，是利用三對特殊引物和具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，特異性識別靶序列上的八個獨立區(qū)域，并實現(xiàn)在恒溫條件下(60～65℃)進行鏈置換擴增反應(yīng)，克服了傳統(tǒng)PCR反應(yīng)需要通過熱變性過程獲得單鏈模板、檢測時間長、易污染以及成本高等缺點，同時該方法在溫和溫度條件進行，操作簡便，對檢測人員的技術(shù)素質(zhì)要求也低，便于對大樣本實現(xiàn)成本低廉的快速篩選。目前國內(nèi)主要以微生物分離培養(yǎng)和形態(tài)學(xué)鑒定為主、結(jié)合生化鑒定和血清學(xué)分型鑒定等通行方法進行食品微生物學(xué)相關(guān)檢驗，其初步鑒定一般需要2～3天，而最終完成鑒定報告則需10～15天，但采用本試劑盒檢測從收集樣本到檢測完成僅需12～14小時，且本試劑盒采用鈣黃綠素顯色液，使得通過肉眼即可判讀結(jié)果，更加直觀清晰。如無特別說明，本發(fā)明中的w/v為質(zhì)量體積比，組成中的百分比如無特別說明，均指質(zhì)量百分比。下面結(jié)合實驗，進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。引物的篩選發(fā)明人設(shè)計了6組引物，分別如下：表1、不同產(chǎn)氣莢膜梭菌LAMP引物序列注：表中，組1中6條引物cpa-F3、cpa-B3、cpa-FIP、cpa-BIP、cpa-LF、cpa-LB依次編號為1～6，組2中的6條引物cpa-F3、cpa-B3、cpa-FIP、cpa-BIP、cpa-LF、cpa-LB依次編號為7～12，其他組的編號類似。采用最優(yōu)的6組引物序列組合，均含有環(huán)引物，經(jīng)過統(tǒng)一的優(yōu)化的反應(yīng)體系測試，通過瓊脂糖凝膠電泳觀察反應(yīng)產(chǎn)物，引物組1僅需35min即有明顯的擴增條帶，引物組2和引物組5在40min左右，引物組3、引物組4和引物組6在45min左右。試劑盒的制備：引物：表1中的引物組1。凍干等溫擴增劑：凍干前的組成如表2:表2、不同凍干檢測劑的組成表凍干檢測劑的制備方法：無菌環(huán)境下混合需要凍干處理的相關(guān)組分混合液，封裝于容器中，按照常規(guī)冷凍干燥程序進行干燥，即可得到凍干等溫擴增劑。復(fù)溶液：組成如下，組分終濃度KCl8mmol/LTris-HCl,，pH8.816mmol/L(NH4)2SO49mmol/LMgSO46mmol/LTritonX-1000.2％甜菜堿1.2mol/L水余量無菌環(huán)境下混合復(fù)溶液組分，置于容器中。陽性對照干粉：向提純的產(chǎn)氣莢膜梭菌基因組DNA溶液分別加入3％(w/v)的海藻糖，分裝與容器中，同樣經(jīng)上述凍干程序制備陽性對照干粉。顯色液：由0.3mmol/L的鈣黃綠素和7.2mmol/L的MnCl2等體積混合得到，鈣黃綠素的終濃度為15μmol/L，MnCl2的終濃度為360μmol/L，置于容器中。封閉液：液體石蠟，無菌分裝，置于容器。裂解液：含有10～20mmol/LTris-HCl(pH8.3)、1mmol/LEDTA、0.3～1％(w/v)SDS，置于容器中。穩(wěn)定性實驗分別取例1～6的凍干等溫擴增劑進行穩(wěn)定性實驗，4℃保存，每隔3個月利用試劑盒進行產(chǎn)品的反應(yīng)效果驗證，結(jié)果見表3：表3、不同凍干等溫擴增劑的穩(wěn)定性采用例1復(fù)合凍干保護劑進行反應(yīng)試劑的凍干，經(jīng)過液氮預(yù)凍和冷凍干燥后，試劑凍干粉能保持較高的穩(wěn)定性，最長的保質(zhì)期時間為21-24個月，遠高于同類型產(chǎn)品的12個月保質(zhì)期，24個月保質(zhì)期時其檢驗限略有下降，靈敏度仍然可達到58CFU/Test左右。除含5％海藻糖的單一保護劑有吸潮現(xiàn)象外，其余復(fù)合保護劑凍干成粉狀制劑后在各自保質(zhì)期范圍內(nèi)均保持良好形態(tài)，沒有塌陷和鏤空現(xiàn)象。最低檢驗限和靈敏度的比較1)用無菌接種環(huán)分別挑取產(chǎn)氣莢膜梭菌(ATCC13124)的純菌菌落，用滅菌生理鹽水進行梯度稀釋(稀釋倍數(shù)分別為100，101，102，103，104，105，106，107，108)，并分別取各個稀釋菌液100μL螺旋接種到TSA平板進行培養(yǎng)和計數(shù)；2)分別取以上稀釋菌液100μL，6000r/min離心5min，棄上清，加入10μL裂解液充分懸浮菌體沉淀，99℃加熱裂解菌體10min，菌體裂解液12000r/min離心15min，取上清即為粗提的菌體模板基因；3)以上粗提DNA為模板進行PCR和LAMP反應(yīng)，產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR引物為：PF-5’-GCTGGGACATCAACTAAAGTC-3’(SEQIDNO：37)，PR-5’-CGCTATCA-ACGGCAGTAAC-3’(SEQIDNO：38)；4)擴增條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸10min，35個循環(huán)；5)以上粗提DNA為模板進行LAMP反應(yīng)，取出干粉化檢測反應(yīng)管，每管分別加入上述復(fù)溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分別加入以上各個稀釋菌液對應(yīng)的粗提DNA模板2.5μL，無菌超純水2.5μL，充分混勻后加入20μL/管封閉液，緊蓋，設(shè)置64℃恒溫反應(yīng)50min；6)以上PCR與LAMP擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳來判讀，平板菌落計數(shù)確定最低檢驗限。結(jié)果：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示產(chǎn)氣莢膜梭菌PCR的最低檢驗限在105倍數(shù)稀釋處，LAMP最低檢驗限制在106倍數(shù)稀釋處。對應(yīng)的菌落計數(shù)采用GB4789.2-2010食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定標準，產(chǎn)氣莢膜梭菌在106倍數(shù)稀釋處為11CFU，結(jié)果顯示LAMP檢測的靈敏度遠高于PCR。純菌的檢測1)樣品處理：用于純菌的篩選鑒定中，用接種環(huán)挑取單菌落半環(huán)，轉(zhuǎn)移到含有30μL裂解液的無菌PCR管中，充分混勻后水浴或者金屬浴99℃熱裂解10min；裂解結(jié)束后轉(zhuǎn)到離心機中12000r/min離心10min，取上清即為樣品粗提基因組DNA，選用的菌株見表4：表42)恒溫擴增反應(yīng)：取出干粉化檢測反應(yīng)管，每管分別加入上述復(fù)溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分別加入以上各類菌粗提的DNA模板2.5μL，其中，取1管作為陰性對照，1管作為陽性對照，分別加入對應(yīng)的對照試劑2.5μL，后分別向所有各管中加入顯色液2.5μL，充分混勻后加入20μL封閉液，緊蓋，經(jīng)BiometraprofessionalPCR儀進行恒溫擴增，64℃恒溫反應(yīng)50min；3)反應(yīng)后判讀：反應(yīng)結(jié)束后，對比反應(yīng)前后顏色變化，若呈現(xiàn)熒光綠則為陽性，淡橙色則為陰性，若陰陽性對照反應(yīng)管結(jié)果與上述情況不符，則本次檢測結(jié)果無效，應(yīng)重新檢測，整個觀察過程不得打開反應(yīng)管蓋。檢測結(jié)果見表5：結(jié)果，經(jīng)本發(fā)明檢測，以上所選的產(chǎn)氣莢膜梭菌和非產(chǎn)氣莢膜梭菌的核酸快速檢測中，產(chǎn)氣莢膜梭菌的標準菌株在各自的檢測體系中出現(xiàn)明顯熒光綠，而所選非產(chǎn)氣莢膜梭菌屬各菌反應(yīng)前后均未出現(xiàn)明顯顏色變化，仍為淡橙色，可見本發(fā)明具有極好的特異性，能有效檢出產(chǎn)氣莢膜梭菌。本發(fā)明所述的包裝飲用水中產(chǎn)氣莢膜梭菌的檢測方法如下：1)樣品處理：取250mL待檢水樣進行抽濾，后將濾膜浸泡于100mL梭菌增菌培養(yǎng)基，37±1℃條件下增菌8-12h。吸增菌液1mL到1.5mL規(guī)格的無菌離心管中，6000r/min離心5min，棄上清。加入30μL裂解液，充分懸浮菌體，輕彈管壁消除氣泡，99℃加熱10min，12000r/min離心15min，上清即為粗提的DNA；2)恒溫擴增反應(yīng)：取出干粉化檢測反應(yīng)管，每管分別加入上述復(fù)溶液20μL，待管中干粉完全溶解，分別加入以上各樣品粗提的DNA模板2.5μL，其中，取1管作為陰性對照，1管作為陽性對照，分別加入對應(yīng)的對照試劑2.5μL，后分別向所有各管中加入顯色液2.5μL，充分混勻后加入20μL封閉液，緊蓋，經(jīng)BiometraprofessionalPCR儀進行恒溫擴增，64℃恒溫反應(yīng)45min；3)反應(yīng)后判讀：反應(yīng)結(jié)束后，觀察反應(yīng)管中溶液由檢測前的淡橙色變?yōu)闊晒饩G色，與陽性對照管變化相同，表示有產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出，反之，無顏色變化，表示無檢出。通過增加前增菌步驟，對比其他方法的效果，可使產(chǎn)氣莢膜梭菌檢出率更高，避免漏檢現(xiàn)象。SEQUENCELISTING<110>廣東環(huán)凱生物科技有限公司廣東環(huán)凱微生物科技有限公司<120>產(chǎn)氣莢膜梭菌干粉化LAMP快速檢測試劑盒及其使用方法<130>cpa<160>38<170>PatentInversion3.5<210>1<211>22<212>DNA<213>人工引物<400>1ctagatatgaatggcaaagagg22<210>2<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>2agatatcagcataaaaatcctca23<210>3<211>49<212>DNA<213>人工引物<400>3ggcagtaacattagcaggatgatattaaacaagctacattctatcttgg49<210>4<211>40<212>DNA<213>人工引物<400>4tgatagcgcaggacatgttaagtttgcaacctgctgtgtt40<210>5<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>5ctccaaaatagtgcatagcctct23<210>6<211>24<212>DNA<213>人工引物<400>6tgaaacttttgcagaggaaagaaa24<210>7<211>22<212>DNA<213>人工引物<400>7ctagatatgaatggcaaagagg22<210>8<211>23<212>DNA<213>人工引物<400>8agatatcagcataaaaatcctca23<210>9<211>49<212>DNA<213>人工引物<400>9ggcagtaacattagcaggatgatattaaacaagctacattctatcttgg49<210>10<211>40<212>DNA<213>人工引物<400>10tgatagcgcaggacatg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