本發(fā)明屬于扇貝雜交育種的后裔鑒定技術(shù)，尤其是涉及一種紫扇貝與海灣扇貝及其回交后代母本來源的鑒定方法。

背景技術(shù)：

海灣扇貝(Argopectenirradians)自1982年從美國引進(jìn)以來,產(chǎn)量逐年增加，已成為中國最重要的養(yǎng)殖貝類之一，但是近年來出現(xiàn)的種質(zhì)退化問題成為制約中國扇貝養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。

紫扇貝(Argopectenpurpuratus)是南美洲太平洋海岸的優(yōu)良經(jīng)濟(jì)貝類，大小中等，廣泛養(yǎng)殖于智利和秘魯，并使智利成為僅次于中國的扇貝養(yǎng)殖大國。為了改善海灣扇貝的種質(zhì)，提高扇貝養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，王春德等于2008年從秘魯引進(jìn)紫扇貝并與海灣扇貝成功雜交，培育出生長優(yōu)勢(shì)極其顯著的兩種雜交子一代，即紫海雜交扇貝(紫扇貝卵子×海灣扇貝精子)和海紫雜交扇貝(海灣扇貝卵子×紫扇貝精子)(王春德等，2009；Wang et al,2011)。而雜交子一代中存在著少量雄性可育個(gè)體，可通過回交的方法培育出生長優(yōu)勢(shì)極其顯著的回交扇貝后代，即海紫紫回交扇貝(海紫雜交扇貝卵子×紫扇貝精子)、紫海?；亟簧蓉?紫海扇貝卵子×海灣扇貝精子)、紫海紫回交扇貝(紫海雜交扇貝卵子×紫扇貝精子)、海紫?；亟簧蓉?海紫雜交扇貝卵子×海灣扇貝精子)，因而具有巨大的育種潛力。但紫扇貝和海灣扇貝均為雌雄同體的動(dòng)物，在繁育時(shí)兩種扇貝均同時(shí)排放精子和卵子，在育種實(shí)踐中存在著精子或卵子污染的問題，為確保育種進(jìn)程的順利進(jìn)行并確證后代的譜系，經(jīng)常需要確定某一后代是否為真正的回交后代及其母本來源，因此需要建立一種方法來快速鑒定其親本來源尤其是母本來源。

利用來自核基因組的分子標(biāo)記(如微衛(wèi)星標(biāo)記)鑒定方法雖然可以用來鑒定回交后代是否為真正的雜交種，但無法辨別其父母本來源，導(dǎo)致回交后代譜系混亂、難以對(duì)優(yōu)良的品系進(jìn)行篩選等問題，而且在回交試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用作回交的母體不同，其回交一代性狀的表現(xiàn)也不同，有的甚至完全表現(xiàn)為母體的性狀，因此快速鑒定回交扇貝的母本來源是非常必要的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種鑒定紫扇貝與海灣扇貝及其回交后代的母本來源的方法，基于線粒體DNA序列差異而設(shè)計(jì)的標(biāo)記引物，并利用該標(biāo)記引物序列鑒定紫扇貝與海灣扇貝及其回交后代母本來源。

研究已發(fā)現(xiàn)，線粒體基因組嚴(yán)格遵循母系遺傳規(guī)律，且缺少基因重組，回交后代的線粒體必定來自其母本，因此通過鑒定其線粒體DNA的來源就可以確定回交種的母本來源。本發(fā)明根據(jù)海灣扇貝和紫扇貝線粒體基因組差異性特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，能夠通過PCR方法鑒定雜交后代線粒體基因的類型，從而快速鑒定回交扇貝的母本來源。

本發(fā)明基于以下構(gòu)思：研究發(fā)現(xiàn)，扇貝的線粒體基因組遵循嚴(yán)格的母系遺傳，即后代的線粒體基因與其母本線粒體基因型完全相同，而與父本的線粒體基因型無關(guān)；具體到海灣扇貝和紫扇貝均為Argopecten屬的近緣種，雖然其線粒體基因組序列相似性高達(dá)82.34％，但仍可以根據(jù)兩者線粒體基因序列的少許差異設(shè)計(jì)出特異的引物，從而區(qū)分回交后代線粒體基因的來源，為育種工作的順利進(jìn)行提供保障。

本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種鑒定紫扇貝與海灣扇貝雜交后代母本來源的方法，所用標(biāo)記引物為mtDNA-Z，分別由左端引物序列mtDNA-Z-F：5’-TATGAGGTGTCCCCCAAGTC-3’和右端引物序列mtDNA-Z-R：5’-ACTGGCAGACAAACAAATCGT-3’組成。

本發(fā)明利用上述標(biāo)記引物對(duì)紫扇貝、海灣扇貝及其回交后代母本來源進(jìn)行鑒定的方法如下：

(1)分別取待鑒定的紫扇貝、海灣扇貝與海紫紫回交扇貝、紫海海回交扇貝、紫海紫回交扇貝、海紫?；亟簧蓉惖拈]殼肌，直接用常規(guī)的方法提取上述扇貝全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終濃度100ng/μL保存在-20℃?zhèn)溆茫?/p>

(2)以提取的上述紫扇貝、海灣扇貝與各回交扇貝的DNA為模板，用上述引物mtDNA-Z對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，包括0.25U Taq DNA酶，含1.5mM MgCl₂的1×PCR buffer,0.2mM dNTP mix,左右端引物各1μM,50ngDNA模板；反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min；PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察；如果在近460bp處有PCR特異性條帶出現(xiàn)，則確定其母本線粒體基因來源為紫扇貝，如果在近460bp處沒有PCR特異性條帶出現(xiàn)，則確定其母本線粒體基因來源為海灣扇貝。

本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明基于線粒體DNA序列的引物設(shè)計(jì)排除了核基因組DNA的影響，因此不需要單獨(dú)提取線粒體DNA來進(jìn)行鑒定，利用常規(guī)提取的全基因組中的少量線粒體DNA，即可用標(biāo)記引物mtDNA-Z進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)后就能夠得到鑒定結(jié)果，周期時(shí)間短，方法簡便，可大批量進(jìn)行，快速高效。

(2)本發(fā)明基于線粒體DNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物能夠快速簡便地鑒別出四個(gè)回交后代及其兩個(gè)親本。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中所用標(biāo)記引物mtDNA-Z PCR擴(kuò)增紫扇貝、海灣扇貝及其回交后代海紫紫扇貝、紫海海扇貝產(chǎn)物的電泳圖；其中1:Marker，2-3：海灣扇貝，4-5：紫扇貝,6-9：海紫紫回交扇貝，10-13：紫海海回交扇貝；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2中所用標(biāo)記引物mtDNA-Z PCR擴(kuò)增紫扇貝、海灣扇貝及其回交后代紫海紫扇貝、海紫海扇貝產(chǎn)物的電泳圖；其中注：1-2：海灣扇貝，3-4：紫扇貝,5-8：紫海紫扇貝，9-12：海紫海扇貝.M:DL2000。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1以紫扇貝、海灣扇貝及回交后代海紫紫回交扇貝、紫海?；亟簧蓉悶槔?，進(jìn)行鑒定的結(jié)果。

(1)分別取紫扇貝、海灣扇貝各2個(gè)，海紫紫回交扇貝、紫海?；亟簧蓉惛?個(gè)的閉殼肌，用天根DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)分別提取全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終濃度100ng/μL保存在-20℃?zhèn)溆茫崛〉娜蚪MDNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，以確保提取的全基因組DNA的純度和質(zhì)量符合要求。

(2)以提取的上述扇貝DNA為模板，用上述引物mtDNA-Z對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan)，1×PCR buffer(含1.5mM MgCl₂),0.2mM dNTP mix，上下游引物各1μM，50ngDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察電泳結(jié)果。

(3)電泳結(jié)果表明，在海灣扇貝和海紫紫回交扇貝中未擴(kuò)增出條帶，在紫扇貝、紫海?；亟簧蓉愒诩s460bp附近擴(kuò)增出明顯的條帶(見圖1)，大小與預(yù)期的463bp相符；將上述紫扇貝中的擴(kuò)增產(chǎn)物純化后測(cè)序結(jié)果大小為460bp，與紫扇貝的線粒體DNA序列進(jìn)行DNAMAN比對(duì)，測(cè)得序列與紫扇貝線粒體DNA的片段相似度為97.81％(見表1),從而排除了mtDNA-Z引物受核基因組的影響，確定為以紫扇貝線粒體DNA作為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。顯然本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物能夠鑒定出紫扇貝與海灣扇貝及其回交后代的母本來源。

表1測(cè)序結(jié)果比對(duì)表

實(shí)施例2以紫扇貝、海灣扇貝及回交后代紫海紫扇貝、海紫海扇貝為例，進(jìn)行鑒定的結(jié)果。

(1)分別取紫扇貝、海灣扇貝各2個(gè)，海紫紫回交扇貝和紫海?；亟簧蓉惛?個(gè)的閉殼肌，用天根DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)分別提取上述扇貝的全基因組DNA，用TE緩沖液稀釋至終濃度100ng/μL保存在-20℃?zhèn)溆?，提取的全基因組DNA經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察，以保證提取的全基因組DNA的純度和質(zhì)量是否符合要求。

(2)以提取的上述扇貝的DNA為模板，用引物mtDNA-Z對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10μL，包括0.25U Taq DNA酶(Takara Inc.,Shiga,Japan)，1×PCR buffer(含1.5mM MgCl₂),0.2mM dNTP mix，左右端引物各1μM，50ngDNA模板。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min,94℃1min,56℃1min,72℃1min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)照相觀察電泳結(jié)果。

(3)電泳結(jié)果表明，紫扇貝、紫海紫回交扇貝在近460bp處擴(kuò)增出明顯的條帶，而在海灣扇貝和海紫海回交扇貝中均未擴(kuò)增出條帶(見圖2)，說明本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物對(duì)鑒定紫扇貝與海灣扇貝及其回交后代的母本來源是無誤的。

SQUENCE LISTING

<110> 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 紫扇貝與海灣扇貝及其回交后代母本來源的鑒定方法

<160> 1

<210> 1

<211> 463

<212> DNA

<213> 紫扇貝（Argopecten purpuratus）

<220>

<221> misc_feature

<400> 1

tatgaggtgt cccccaagtc ttgggttttt gggggaggtt ataataggga tagggatttg 60

tagaattttt ccacaaggct atattttttg ttttattcta ctattctttt tcggtggtgc 120

aagaataatg gtgctttaca ccagggtaat acacggaagg ttttcgactg ccctggttcc 180

tggggggtct ggaattacga agtgtagtta tcttggtctt ttccatgggg tgccgttaat 240

tattttgttt tttttacctg cgttcttgtc tttgcgggct cttcggagcg gtctttaaga 300

agtagggcta aagcccacgc actgttgaca gagtaggaga ggaggaagta gaaaaccaga 360

ttaaatgggt ggcgagagcg atgagattgt acaagacccg ggataaaggc taagagaagg 420

ggtctcccga tcgaattagg gtacgatttg tttgtctgcc agt 463