本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及人工創(chuàng)制玉米雄性不育系與高效的轉(zhuǎn)育方法。

背景技術(shù)：

雜種優(yōu)勢在遺傳學(xué)上是指雜交子代在生長、成活、繁殖能力或生產(chǎn)性能等方面均優(yōu)于雙親均值的現(xiàn)象。玉米是雜種優(yōu)勢利用最為成功的作物之一。因此，雜交種制種是種業(yè)開發(fā)的重要環(huán)節(jié)。人們可通過人工或機(jī)械去雄來保持雜交種的純度，但這種方法存在著工作量大、成本高、去雄不徹底而影響種子純度與質(zhì)量等缺點(diǎn)。雄性不育系的應(yīng)用可以大大降低種子生產(chǎn)成本、提高種子質(zhì)量、保護(hù)母本等優(yōu)勢，在玉米雜種優(yōu)勢利用過程中具備重要應(yīng)用價(jià)值。以細(xì)胞質(zhì)不育為基礎(chǔ)的三系配套法(不育系、保持系、恢復(fù)系)的出現(xiàn)大大的提高了雜交種創(chuàng)制的效率，但依然存在著不育系不穩(wěn)定、恢復(fù)系匹配不成功、細(xì)胞質(zhì)?；孕“卟〉壬a(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。目前，以單隱性基因控制的核不育為基礎(chǔ)的兩系配套法(不育系、恢復(fù)系)可以有效解決了細(xì)胞質(zhì)不育系的問題，提高效率，降低生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)。

當(dāng)前已經(jīng)鑒定出幾十種玉米相關(guān)的育性基因。以玉米育性核基因ms26為例，該基因位于1號染色體的短臂上，由5個(gè)外顯子組成，它的氨基酸序列和細(xì)胞色素p450家族中的一個(gè)成員cyp704b1-zm基因高度的同源。細(xì)胞色素p450蛋白多數(shù)屬于長鏈脂肪酸ω-羥化酶，參與長鏈脂肪酸的ω-羥化過程，這種酶是花粉粒形成孢外壁的關(guān)鍵酶，缺少這種酶就會造成花粉孢外壁長鏈脂肪酸合成受阻，從而出現(xiàn)花粉粒孢外壁異常導(dǎo)致植株敗育。heme結(jié)合結(jié)構(gòu)域是細(xì)胞色素p450蛋白中關(guān)鍵的保守結(jié)構(gòu)域，位于ms26基因的5號外顯子上，其氨基酸序列如圖1所示。通過對該基因定向突變，可以創(chuàng)制隱性核基因不育系。

2012年，一種基于細(xì)菌利用rna向?qū)У拿庖呦到y(tǒng)—規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，crispr)是繼歸巢核酸酶(meganuclease)、鋅指核酸酶(zinc-fngernucleases，zfns)、類轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornucleases，talens)之后，具有高靈敏度、靶向范圍廣、設(shè)計(jì)操作簡便等優(yōu)點(diǎn)的基因編輯技術(shù)。crispr/cas9技術(shù)原理是通過向?qū)na的定點(diǎn)靶向作用，融合cas9蛋白結(jié)合dna靶點(diǎn)產(chǎn)生雙鍵斷裂(double-strandbreaks，dsb)，并引入兩種修復(fù)方式—非同源末端連接修復(fù)方式(non-homologousend-joining，nhej)和同源重組修復(fù)(homology-directedrepair，hdr)，從而實(shí)現(xiàn)dna的定向編輯,創(chuàng)制目標(biāo)基因定點(diǎn)突變。

傳統(tǒng)的回交育種過程中，通常通過目標(biāo)基因回交導(dǎo)入到受體，再通過受體高代回交實(shí)現(xiàn)輪回親本遺傳背景回復(fù)。在目標(biāo)基因的回交導(dǎo)入過程中，尤其是在目標(biāo)基因的兩側(cè)往往帶入了供體親本的染色體片段，稱之為連鎖累贅。要打破這種連鎖累贅需要通過在大群體中逐個(gè)單株鑒定減數(shù)分裂過程中，于目標(biāo)基因兩側(cè)發(fā)生雙交換而導(dǎo)入目標(biāo)基因但遺傳背景回復(fù)高的個(gè)體，工作量巨大，成本高，效率低。連鎖累贅成為回交育種中重要的限制因素。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是如何培育玉米雄性不育系及其高效轉(zhuǎn)育的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了一種培育玉米雄性不育系的方法。

本發(fā)明提供的培育玉米雄性不育系的方法包括如下步驟：利用crispr/cas9系統(tǒng)對受體玉米基因組中的育性基因進(jìn)行編輯，進(jìn)而使所述育性基因功能喪失，得到玉米雄性不育系。

上述方法中，應(yīng)用實(shí)例中所述育性基因?yàn)榫幋ams26蛋白的基因,并不僅限于該基因；

所述crispr/cas9系統(tǒng)中包括兩個(gè)sgrna，分別命名為sgrna1和sgrna2；

所述sgrna1和所述sgrna2識別的靶序列均為所述受體玉米基因組中編碼ms26蛋白的dna片段。

上述方法中，所述ms26蛋白為a1)或a2)：

a1)氨基酸序列是序列8所示的蛋白質(zhì)；

a2)將序列8所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基得到的由a1)衍生的蛋白質(zhì)。

上述方法中，

所述sgrna1識別的靶序列為序列4所示的dna分子；

所述sgrna2識別的靶序列為序列5所示的dna分子。

上述方法中，所述編輯的方法為將向所述受體玉米中導(dǎo)入玉米基因組編輯的載體；所述玉米基因組編輯的載體含有所述sgrna1的編碼基因、所述sgrna2的編碼基因、rna聚合酶ⅲ識別的啟動子、cas9蛋白表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因。

上述方法中，

所述sgrna1的編碼基因是序列7第7245-7347位所示的dna分子；

所述sgrna2的編碼基因是序列7第6692-6794位所示的dna分子；

用于啟動所述sgrna1的編碼基因轉(zhuǎn)錄的rna聚合酶ⅲ識別的啟動子可為啟動子zmu6-2；所述啟動子zmu6-2是下述b1)或b2)或b3)所示的dna分子：

b1)序列2所示的dna分子；

b2)與b1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性，且具有啟動子功能的dna分子；

b3)在嚴(yán)格條件下與b1)或b2)限定的dna序列雜交，且具有啟動子功能的dna分子；

用于啟動所述sgrna2的編碼基因轉(zhuǎn)錄的rna聚合酶ⅲ識別的啟動子可為啟動子zmu6-6；所述啟動子zmu6-6是下述c1)或c2)或c3)所示的dna分子：

c1)序列3所示的dna分子；

c2)與c1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性，且具有啟動子功能的dna分子；

c3)在嚴(yán)格條件下與c1)或c2)限定的dna序列雜交，且具有啟動子功能的dna分子。

上述方法中，所述cas9蛋白表達(dá)盒自上游至下游依次包括用于啟動cas9蛋白表達(dá)的啟動子、cas9蛋白的編碼基因和終止子，所述用于啟動cas9蛋白表達(dá)的啟動子具體為玉米u(yù)bi啟動子，所述終止子具體為nos終止子；

所述cas9蛋白的編碼基因是下述d1)或d2)或d3)所示的dna分子：

d1)序列7自5’末端起第447-4547位所示的dna分子；

d2)與d1)限定的dna序列具有75％或75％以上同一性的dna分子；

d3)在嚴(yán)格條件下與d1)或d2)限定的dna序列雜交的dna分子。

上述方法中，所述篩選標(biāo)記基因具體為抗草銨膦的bar基因。

上述方法中，所述玉米基因組編輯的載體具體為載體cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2，其核苷酸序列為序列7。其中，序列7自5’末端起第115-367位所示的核苷酸為nos終止子，第399-446位所示的核苷酸為核定位序列(nls)，第447-4547位所示的核苷酸序列為cas9蛋白的編碼基因，第4572-4592位所示的核苷酸為核定位信號(sv40nls)，第4599-4664位所示的核苷酸為3×flag標(biāo)簽，第4691-6662位所示的核苷酸序列為玉米u(yù)bi啟動子，第6692-6794位所示的核苷酸序列為sgrna2的編碼基因(sgrna2識別的靶序列為序列5)，第6795-7239位所示的核苷酸序列為啟動子zmu6-6，第7245-7347位所示的核苷酸序列為sgrna1的編碼基因(sgrna1識別的靶序列為序列4)，第7348-7742位所示的核苷酸序列為啟動子zmu6-2，第9377-10006位所示的核苷酸序列為psv1staa，第10435-11508位所示的核苷酸序列為psv1repa，第12438-13029位所示的核苷酸序列為復(fù)制子ori，第14451-15245位所示的核苷酸序列為卡那霉素抗性基因，第15772-15946位所示的核苷酸序列為camvpoly(a)signal，第15953-16504位所示的核苷酸序列為抗草銨膦的bar基因，第16549-17225位所示的核苷酸序列為camv35s增強(qiáng)型啟動子。

上述載體cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2可通過使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)、ti質(zhì)粒、ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接dna轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、基因槍等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞或組織培育成植株。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，上述載體cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化受體玉米的愈傷組織，并經(jīng)過共培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)、抗除草劑陽性篩選、誘導(dǎo)胚狀體、分化、再分化、生根壯苗和煉苗等步驟，得到轉(zhuǎn)基因陽性植株。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明又提供了上述玉米基因組編輯的載體。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了上述玉米基因組編輯的載體的新用途。

本發(fā)明提供了上述玉米基因組編輯的載體在培育玉米雄性不育系中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了上述方法獲得的玉米雄性不育系的新用途。

本發(fā)明提供了上述方法獲得的玉米雄性不育系在玉米育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述方法獲得的玉米雄性不育系在培育玉米雄性不育系品種中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了上述方法獲得的玉米雄性不育系在提高玉米回交轉(zhuǎn)育效率中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明最后提供了一種培育玉米雄性不育系品種的方法。

本發(fā)明提供的培育玉米雄性不育系品種的方法包括如下步驟：

(1)按照上述方法獲得玉米雄性不育系；

(2)以受體玉米為輪回親本，對所述玉米雄性不育系進(jìn)行回交轉(zhuǎn)育，得到玉米雄性不育系品種。

上述所述方法包括如下步驟：

1)以所述玉米雄性不育系為母本，以受體玉米為父本進(jìn)行雜交，得到f1代；

2)從所述f1代中選取具有雄性不育表型的植株為母本，以所述受體玉米為父本進(jìn)行雜交，得到bc1代；

3)從所述bc1代中選取具有雄性不育表型的植株為母本，以所述受體玉米為父本進(jìn)行雜交，得到bc2代；

4)用檢測上述篩選標(biāo)記基因的物質(zhì)對所述bc2代植株個(gè)體進(jìn)行檢測，從所述bc2代中選取沒有所述篩選標(biāo)記基因的植株進(jìn)行自交，得到自交后代；從所述自交后代中選取具有雄性不育表型的植株個(gè)體，即為玉米雄性不育系品種。

上述方法中，所述雄性不育表型具體為小穗緊湊，護(hù)穎緊閉。

上述方法中，所述檢測上述篩選標(biāo)記基因的物質(zhì)具體為bar試紙條，沒有所述篩選標(biāo)記基因的植株即為沒有出現(xiàn)陽性條帶的植株。

上述方法或應(yīng)用中，所述受體玉米具體可為玉米自交系ca335。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)勢是基于crispr/cas9基因編輯技術(shù)對玉米育性基因進(jìn)行定點(diǎn)定向突變。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)例為對ms26進(jìn)行定點(diǎn)修飾，并不限于該基因。通過cas9的靶向編輯作用，將ms26基因的5號外顯子刪除，從而改變ms26基因表達(dá)的蛋白功能，影響花粉粒孢外壁的形成，造成敗育，創(chuàng)制出雄性不育植株，為玉米雜種優(yōu)勢的利用提供了基礎(chǔ)。具體來說是設(shè)計(jì)雙向?qū)na介導(dǎo)的crispr/cas9編輯載體，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到受體中，表達(dá)出cas9與向?qū)na復(fù)合體，定向結(jié)合到靶位點(diǎn)行使剪切功能，當(dāng)兩個(gè)靶位點(diǎn)同時(shí)被編輯，5號外顯子被敲除，就產(chǎn)生了ms26刪除突變體，進(jìn)而使ms26基因失去功能，影響花粉粒孢外壁的發(fā)育，獲得玉米雄性不育植株。本發(fā)明還有一個(gè)優(yōu)勢是利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)快速高效的創(chuàng)制純合突變體，并且因crispr/cas9基因編輯技術(shù)是通過轉(zhuǎn)入基因編輯元件，表達(dá)出編輯復(fù)合物對靶標(biāo)基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，修飾后的靶標(biāo)基因的遺傳背景還是受體親本，不是通過回交過程中的遺傳重組來導(dǎo)入目標(biāo)基因，攜帶該編輯元件的單株與受體雜交后，在孢子體與配子體水平，均能活體中誘導(dǎo)受體目標(biāo)基因定向突變，成為隱性核不育基因。因此，不會傳統(tǒng)隱性目標(biāo)基因回交過程中遺傳連鎖累贅。而轉(zhuǎn)入的基因編輯元件也可以通過雜交過程中的分離轉(zhuǎn)移到其它受體材料中，即可分離出不含該元件的育種材料或親本，因此，在bc2代自交即可得到高背景回復(fù)、受體轉(zhuǎn)變成雄性不育的親本，相比傳統(tǒng)育種大大縮短了轉(zhuǎn)育周期、避免了連鎖累贅。

本發(fā)明提供了一種人工高效創(chuàng)制玉米雄性不育的方法。該方法基于雙向?qū)na引導(dǎo)的crispr/cas9系統(tǒng)，在第四內(nèi)含子和3，utr位置上選擇兩個(gè)合適的靶位點(diǎn)，構(gòu)建轉(zhuǎn)化載體，利用高效的基因編輯定點(diǎn)定向基因敲除的方法高效的刪除了該基因的其中一個(gè)外顯子區(qū)域，定向突變了玉米育性基因ms26，并通過測序篩選出純合突變體即為雄性不育突變體。由于玉米育性基因ms26的突變導(dǎo)致該基因蛋白質(zhì)翻譯不出完整功能蛋白行使生物學(xué)功能，花粉粒孢外壁發(fā)育異常，從而獲得核基因隱性突變體，即雄性不育株系，達(dá)到完全不育。本發(fā)明還采用含有基因編輯轉(zhuǎn)化體的植株作為突變的供體與受體進(jìn)行雜交，通過活體內(nèi)定向突變可直接突變受體野生型基因，從而避免回交導(dǎo)入的連鎖累贅，大大提高了回交轉(zhuǎn)育效率。本發(fā)明采用生物技術(shù)方法，獲得非轉(zhuǎn)基因雄性不育株系，可以應(yīng)用于玉米雜交種母本轉(zhuǎn)育成隱性核不育系以應(yīng)用于種業(yè)生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為ms26基因5號外顯子氨基酸序列。

圖2為基因編輯遺傳轉(zhuǎn)化載體圖譜。

圖3為t0代轉(zhuǎn)基因陽性植株pcr鑒定電泳圖。

圖4為t0代轉(zhuǎn)基因植株刪除突變類型pcr鑒定電泳圖。

圖5為to代刪除突變株測序結(jié)果。

圖6為ms26/ms26基因型植株t0-10表型鑒定。

圖7為基因編輯創(chuàng)制的玉米雄性不育系高效的轉(zhuǎn)育方案。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

下述實(shí)施例中的peasy-bluntcloningkit、trans5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、peasy-bluntsimplevector和transt1感受態(tài)細(xì)胞均為北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。

下述實(shí)施例中的玉米自交系ca335在文獻(xiàn)“chuanxiaoxie,shihuangzhang_,minshunli,xinhaili,zhuanfanghao,libai,deguizhang,yehongliang.inferringgenomeancestryandestimatingmolecularrelatednessamong187chinesemaizeinbredlines.journalofgeneticsandgenomics(formerlyactageneticasinica).2007,34(8):738-748”中公開過，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所(即申請人)獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。

實(shí)施例1、基因編輯遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

一、rna聚合酶ⅲ識別的啟動子zmu6-2和zmu6-6的克隆

1、啟動子zmu6-2和zmu6-6的擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)

啟動子zmu6-2擴(kuò)增引物序列如下：

zmu6-2-f：5’-aattggcccttacaaaatag-3’；

zmu6-2-r：5’-ggagcggtggtcgcagctga-3’；

啟動子zmu6-6擴(kuò)增引物序列如下：

zmu6-6-f：5’-aacctcgcttgtatagttcc-3’；

zmu6-6-r：5’-aattcggtgcttgcggctcg-3’。

2、pcr擴(kuò)增

提取玉米自交系鄭58的基因組dna，以玉米自交系鄭58的基因組dna為模板，分別采用步驟1中設(shè)計(jì)的啟動子zmu6-2和zmu6-6的擴(kuò)增引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到zmu6-2和zmu6-6。pcr擴(kuò)增體系如表1所示。pcr擴(kuò)增程序如下：94℃2min；94℃15s，55℃30s，68℃30s，35個(gè)循環(huán)；68℃10min。

表1、pcr反應(yīng)體系

pcr擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(axygen，ap-gx-250)回收，將回收的產(chǎn)物連接亞克隆載體-bluntsimplecloningkit(全式金，cb111-01),轉(zhuǎn)入trans1-t1phageresistantchemicallycompetentcell(全式金，cd501-01)進(jìn)行轉(zhuǎn)化，挑取單克隆搖菌進(jìn)行測序。

測序結(jié)果表明：啟動子zmu6-2的核苷酸序列為序列2，啟動子zmu6-6的核苷酸序列為序列3。

二、載體cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2的構(gòu)建

1、片段zmu6-2、sgrna1、zmu6-6、sgrna2的擴(kuò)增

(1)以步驟一的2中的zmu6-2為模板，采用zmu6-2-f1和zmu6-2-r1引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段zmu6-2；引物序列如下：

zmu6-2-f1：5’-cgacggccagtgccaagctaattggcccttacaaaatagctag-3’；

zmu6-2-r1：5’-cgatgcaacgcatatgtggcggagcggtggtcgcagctgaac-3’。

(2)以步驟一的2中的zmu6-6為模板，采用zmu6-6-f1和zmu6-6-r1引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段zmu6-6；引物序列如下：

zmu6-6-f1：5’-gtcggtgctttttttaagctaacctcgcttgtatagttccttg-3’；

zmu6-6-r1：5’-cttaatccacgacaaataacaattcggtgcttgcggctcgg-3’。

(3)以sgrna(sgrna的序列為序列6)為模板，采用sgrna1-f和sgrna-r為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段sgrna1，引物序列如下：

sgrna1-f：5’-gccacatatgcgttgcatcggttttagagctagaaatagcaag-3’；

sgrna-r：5’-cacgctgcactgcacaagcttaaaaaaagcaccgactcggtgcc-3’。

(4)以sgrna(sgrna的序列為序列6)為模板，采用sgrna2-f和sgrna-r為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到片段sgrna2，引物序列如下：

sgrna2-f：5’-gttatttgtcgtggattaaggttttagagctagaaatagcaag-3’；

sgrna-r：5’-cacgctgcactgcacaagcttaaaaaaagcaccgactcggtgcc-3’。

2、重疊pcr

(1)以步驟1獲得的zmu6-2和sgrna1為模板，采用zmu6-2-f1和sgrna-r引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到重疊pcr產(chǎn)物zmu6-2：sgrna1。

(2)以步驟1獲得的zmu6-6、sgrna2為模板，采用zmu6-6-f1和sgrna-r引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到重疊pcr產(chǎn)物zmu6-6：sgrna2。

上述重疊pcr反應(yīng)體系均如表2所示。

表2、重疊pcr反應(yīng)體系

3、用hindⅲ限制性內(nèi)切酶37℃酶切cpb載體3小時(shí)，得到cpb線性化大片段；將重疊pcr產(chǎn)物zmu6-2：sgrna1與cpb線性化大片段用重組酶(全式金，cu101-01)進(jìn)行重組，50℃重組15min，然后轉(zhuǎn)化測序，將正確的測序載體用hindⅲ限制性內(nèi)切酶酶切，以同樣的方法連接zmu6-6：sgrna2，并測序，將正確的測序載體命名為cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2(載體圖譜如圖2所示)。

載體cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2的核苷酸序列如序列7所示。其中，序列7自5’末端起第115-367位所示的核苷酸為nos終止子，第399-446位所示的核苷酸為核定位序列(nls)，第447-4547位所示的核苷酸序列為cas9蛋白的編碼基因，第4572-4592位所示的核苷酸為核定位信號(sv40nls)，第4599-4664位所示的核苷酸為3×flag標(biāo)簽，第4691-6662位所示的核苷酸序列為玉米u(yù)bi啟動子，第6692-6794位所示的核苷酸序列為sgrna2的編碼基因(sgrna2識別的靶序列為序列5)，第6795-7239位所示的核苷酸序列為啟動子zmu6-6，第7245-7347位所示的核苷酸序列為sgrna1的編碼基因(sgrna1識別的靶序列為序列4)，第7348-7742位所示的核苷酸序列為啟動子zmu6-2，第9377-10006位所示的核苷酸序列為psv1staa，第10435-11508位所示的核苷酸序列為psv1repa，第12438-13029位所示的核苷酸序列為復(fù)制子ori，第14451-15245位所示的核苷酸序列為卡那霉素抗性基因，第15772-15946位所示的核苷酸序列為camvpoly(a)signal，第15953-16504位所示的核苷酸序列為抗草銨膦的bar基因，第16549-17225位所示的核苷酸序列為camv35s增強(qiáng)型啟動子。

實(shí)施例2、ms26雄性不育植株的獲得及鑒定

一、ms26雄性不育植株的獲得

1、農(nóng)桿菌的制備

將實(shí)施例1制備的載體cpb-zmu6-2：sgrna1-zmu6-6：sgrna2轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌bmgv3301(北京博邁德基因技術(shù)有限公司，cc3201)，得到重組菌。挑取重組菌克隆接種于300μl無抗性yep液體培養(yǎng)基(牛肉膏10g、酵母膏10g、nacl5g溶于1l蒸餾水)，220rpm振蕩培養(yǎng)4h，然后接種于含卡那霉素抗性基因的yep固體平板上，28℃培養(yǎng)48h，挑取單克隆進(jìn)行鑒定，將經(jīng)鑒定正確的農(nóng)桿菌-80℃保存，待用于下述農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。

2、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化

(1)受體材料的處理

將玉米自交系ca335種子浸泡水中37℃4h，在28℃平皿中萌發(fā)48h，將發(fā)芽后的種子置于裝營養(yǎng)土的盆中培養(yǎng)，待授粉后10天，選取幼胚做為誘導(dǎo)愈傷組織材料。在操作臺中將幼穗用75％(體積分?jǐn)?shù))乙醇消毒10min，無菌水沖洗干凈后，晾干。用手術(shù)刀切掉籽粒一半，然后用鑷子將胚分離出來，放置無菌水中待用。

(2)愈傷組織誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)

將幼胚放置n6培養(yǎng)基(binder，aa958)，28℃暗培養(yǎng)一周，將生長旺盛，顏色鮮艷的愈傷組織切成小塊，放置在n6培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，每兩周繼代一次，保持愈傷組織的良好狀態(tài)，并選取長勢良好的愈傷組織，待用。

(3)農(nóng)桿菌侵染

取出步驟1中保存的農(nóng)桿菌，接種搖菌，待od600值為0.8左右，5000r/min離心10min，收集菌體，用侵染buffer(1l侵染buffer是將4g含n6vitamin的n6salts，2mg2,4-d，100mg肌醇，0.7gl-脯氨酸，68.4g蔗糖，36g葡萄糖，1mlagno3(10mg/ml)，1mlas(100mol/l)和水混勻得到的，ph5.2)懸浮菌體，使od600值為0.5左右，然后28℃，150r/min振蕩0.5h，得到侵染液。將(2)中選取的長勢良好的愈傷組織浸泡侵染buffer中1h，然后轉(zhuǎn)移至含農(nóng)桿菌的侵染液浸泡15min，晾干，得到侵染后的愈傷組織。

(4)共培養(yǎng)、恢復(fù)培養(yǎng)

將侵染后的愈傷組織放至共培養(yǎng)基(1l共培養(yǎng)基是將4g含n6vitamin的n6salts，2mg2,4-d，30g蔗糖，8g瓊脂，1mlagno3(10mg/ml)，1mlas(100mol/l)，3mll-半胱氨酸(100mg/ml)和水混勻得到的，ph5.8)，20℃培養(yǎng)3天，轉(zhuǎn)至恢復(fù)培養(yǎng)基(1l恢復(fù)培養(yǎng)基是將4g含n6vitamin的n6salts，2mg2,4-d，0.7gl-脯氨酸，30g蔗糖，0.5gmes，4g植物凝膠，1mlagno3(10mg/ml)，1ml頭孢霉素(250mg/ml)和水混勻得到的，ph5.8)培養(yǎng)10天，然后轉(zhuǎn)至加入草銨膦的恢復(fù)培養(yǎng)基篩選陽性愈傷組織。

(5)分化、再分化、生根、煉苗

將上述陽性愈傷組織轉(zhuǎn)至誘導(dǎo)胚狀體培養(yǎng)基(1l誘導(dǎo)胚狀體培養(yǎng)基是將4.43g含msvitamin的mssalts(含肌醇)，0.25mg2,4-d，30g蔗糖，5mg6-ba，4g植物凝膠，1mlcefo(250mg/ml)和水混勻得到的，ph5.8)，暗培養(yǎng)2周，然后轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基(1l分化培養(yǎng)基是將4.43g含msvitamin的mssalts(含肌醇)，30g蔗糖，4g植物凝膠，1mlcefo(250mg/ml)和水混勻得到的，ph5.8)，待長出綠苗后轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基(1l生根培養(yǎng)基是將2.215g1/2ms，30g蔗糖，51.55mgmsvitamin，4g植物凝膠和水混勻得到的，ph5.8)生根，長到一定高度，暴露在空氣中培養(yǎng)3天，移苗。

(6)bar試紙條篩選陽性植株

取植株葉片3厘米左右，放入管中研磨充分，加入500μl的buffer，插入bar試紙條(上海佑隆生物科技有限公司，目錄號：envirologixas03)，出現(xiàn)陽性條帶的植株即為t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株。

二、轉(zhuǎn)基因植株的基因型鑒定及表型驗(yàn)證

1、轉(zhuǎn)基因植株的基因型鑒定

(1)植物基因組提取

提取步驟一獲得的t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的基因組dna。具體步驟如下：取步驟一獲得的t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株新鮮葉片放入干凈研缽中，加入液氮研磨至粉末狀，移至2ml離心管中，加入800μl65℃預(yù)熱的ctab緩沖液(500mlctab緩沖液是將50ml1mtris-7.5，70ml5mnacl、50ml0.5medta(ph8.0)、5.0gctab、5.0ml14mβ-巰基乙醇與ddh2o混勻得到的，ctab提取液現(xiàn)用現(xiàn)配，β-巰基乙醇最后于通風(fēng)櫥下加入)，迅速顛倒混勻，65℃水浴40min，冷卻室溫，加入800μl氯仿：異戊醇(24:1)，混勻后12000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至新管，加入5μlrnase，37℃水浴1h，加入氯仿：異戊醇(24:1)再抽提一遍，離心轉(zhuǎn)移上清至新管，加入0.7倍體積預(yù)冷異丙醇，混勻置于-20℃靜置30min，離心去上清，用70％(體積分?jǐn)?shù))乙醇洗滌兩次，置于超凈臺中晾干，加入50μlddh2o溶解dna。

(2)轉(zhuǎn)基因植株基因型鑒定

1)以18株t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的基因組dna為模板，采用引物bar-f(5’-ccatcgtcaaccactacatcg-3’)和bar-r(5’-agctgccagaaacccacgt-3’)對t0代轉(zhuǎn)基因陽性植株進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖3所示。

結(jié)果表明：18株t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物均得到大小為430bp的目的條帶，而野生型玉米植株ca335(wt)中沒有擴(kuò)增得到目的條帶。

2)以18株t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的基因組dna為模板，采用引物deletion-f(5’-cctcctcacctacgacagcctc-3’)和deletion-r(5’-ccaagccaccaatgaaaccc-3’)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，分別得到pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將pcr擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，pcr擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖4所示。并統(tǒng)計(jì)突變率，突變率＝發(fā)生刪除植株數(shù)/總植株數(shù)。

結(jié)果表明：野生型玉米植株ca335(wt)pcr擴(kuò)增得到大小為711bp的條帶，從t0-1到t0-18的18株t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株中，t0-2、t0-9、t0-13和t0-17pcr擴(kuò)增均得到大小為711bp和207bp的條帶，均為雜合突變型；而t0-10pcr擴(kuò)增僅得到大小為207bp的條帶，為純合突變型，并將該植株命名為ms26雄性不育植株(ms26/ms26)。雜合突變型是指該t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的兩條同源染色體中的一條同源染色體的ms26基因發(fā)生了突變、另一條同源染色體的ms26基因未發(fā)生突變；純合突變型是指該t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株的兩條同源染色體的ms26基因發(fā)生了相同的突變。突變率為27.8％(5/18)。

將t0-2、t0-9、t0-13、t0-10和t0-17的擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳回收試劑盒回收進(jìn)行桑格測序。t0-10測序結(jié)果如圖5所示，紅色箭頭為裂解位點(diǎn)。測序結(jié)果表明：t0代陽性轉(zhuǎn)基因植株t0-10(ms26雄性不育植株)產(chǎn)生了精確刪除，其為將野生型玉米植株ca335的兩條同源染色體的ms26基因第1559-2062位刪除，且保持野生型玉米植株ca335的基因組其他序列不變后得到的植株。ms26基因的核苷酸序列為序列1，ms26基因編碼的ms26蛋白的氨基酸序列為序列8。

2、ms26雄性不育植株表型驗(yàn)證

步驟1獲得的ms26雄性不育植株(ms26/ms26)突變了玉米育性基因ms26，由于ms26基因與花粉粒孢外壁的形成相關(guān)，玉米育性基因ms26的突變導(dǎo)致無法表達(dá)出完整功能蛋白ms26，因此ms26雄性不育植株(ms26/ms26)不會產(chǎn)生正常的花粉。

對ms26雄性不育植株(ms26/ms26)的表型進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看出：ms26雄性不育植株(ms26/ms26)表現(xiàn)為雄穗主軸和側(cè)枝上小穗緊湊，護(hù)穎緊閉，無正?；ǚ坌纬?，花粉粒孢外壁發(fā)育異常。說明本發(fā)明成功獲得了雄性不育株系——ms26雄性不育植株(ms26/ms26)。

實(shí)施例3、玉米雄性不育系的高效轉(zhuǎn)育方法

對玉米雄性不育系進(jìn)行其他材料的轉(zhuǎn)育，轉(zhuǎn)育流程如圖7所示，具體轉(zhuǎn)育步驟如下：

1、以ca335-ms26(實(shí)施例2獲得的ms26雄性不育植株(ms26/ms26))為母本(基因型為cas9/cas9：ms26/ms26)，以受體材料玉米自交系ca335為父本(基因型為-/-：ms26/ms26)進(jìn)行雜交，得到f1代。

2、通過對f1代進(jìn)行表型觀察，選取小穗緊湊、護(hù)穎緊閉的雄性不育植株(基因型為cas9/-：ms26/ms26)為母本，受體材料玉米自交系ca335為父本(基因型為-/-：ms26/ms26)進(jìn)行雜交，得到bc1代。

3、通過對bc1代進(jìn)行表型觀察，選取小穗緊湊，護(hù)穎緊閉為雄性不育植株(基因型為cas9/-：ms26/ms26)為母本，受體材料玉米自交系ca335為父本(-/-：ms26/ms26)進(jìn)行雜交，得到bc2代。

4、通過對bc2代植株進(jìn)行bar試紙條檢測，舍棄出現(xiàn)陽性條帶的含轉(zhuǎn)基因成分的植株(基因型為cas9/-：-/-)，選取沒有出現(xiàn)條帶的不含轉(zhuǎn)基因成分的植株(基因型為-/-：ms26/ms26)。

5、將步驟4獲得的沒有出現(xiàn)條帶的不含轉(zhuǎn)基因成分的植株(基因型為-/-：ms26/ms26)進(jìn)行自交，通過對自交后代的進(jìn)行表型篩選，選取小穗緊湊，護(hù)穎緊閉的植株(基因型為-/-：ms26/ms26)，即為玉米不育系品種。

序列表

<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所

<120>人工創(chuàng)制玉米雄性不育系與高效的轉(zhuǎn)育方法

<160>8

<210>1

<211>2266bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

atggaggaagctcacctcacgccggcgacgccatcgccattcttcccactagcagggcct60

cacaagtacatcgcgctccttctggttgtcctctcatggatcctggtccagaggtggagc120

ctgaggaagcagaaaggcccgagatcatggccagtcatcggcgcaacggtggagcagctg180

aggaactaccaccggatgcacgactggcttgtcgggtacctgtcacggcacaggacagtg240

accgtcgacatgccgttcacttcctacacctacatcgctgacccggtgaatgtcgagcat300

gtcctcaagactaacttcaccaattaccccaaggtaaatgacctgaactcactgatgttc360

agtcttcggaaatcagagctgaaagctgaatcgaatgtgcctgaacaccgtgtagggaat420

cgtgtacagatcctacatggacgtgctcctcggtgacggcatcttcaacgccgacggcga480

gctgtggaggaagcagaggaagacggcgagtttcgagttcgcctccaagaacctgaggga540

tttcagcgccattgtgttcagagagtactccctgaagctgtcgggtatactgagccaggc600

atccaaggcaggcaaagttgtggacatgcaggtgagatatcactggtcccttgccattgc660

caacatgagcatttcaacctgagacacgagagctaccttgccgattcaggaactttacat720

gaggatgacgctggactccatctgcaaggttgggttcggggtcgagatcggcacgctgtc780

gccagatctccccgagaacagcttcgcgcaggcgttcgatgccgccaacatcatcatcac840

gctgcggttcatcgacccgctgtggcgcatcaagaggttcttccacgtcgggtcagaggc900

cctcctagcgcagagcatcaagctcgtggacgagttcacctacagcgtgatccgccggag960

gaaggccgagatcgtcgaggtccgggccagcggcaaacaggagaaggtacgtgcacatga1020

ctgtttcgattcttcagttcatcgtcttggccgggatggacctgatcctgattgattata1080

tatccatgtgacttgtgagggcaaattaaaatgggcagatgaagcacgacatcctgtcac1140

ggttcatcgagctgggcgaggccggcgacgacggcggcggcttcggggacgataagagcc1200

tccgggacgtggtgctcaacttcgtgatcgccgggcgggacacgacggcgacgacgctgt1260

cgtggttcacgcacatggccatgtcccacccggacgtggccgagaagctgcgccgcgagc1320

tgtgcgcgttcgaggcggagcgcgcgcgcgaggagggcgtcacgctcgtgctctgcggcg1380

gcgctgacgccgacgacaaggcgttcgccgcccgcgtggcgcagttcgcgggcctcctca1440

cctacgacagcctcggcaagctggtctacctccacgcctgcgtcaccgagacgctccgcc1500

tgtaccccgccgtccctcaggtgagcgcgcccgtcacgtcacgacctccggtccgcgatg1560

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cgggacgaaggtgagggccggcgggatggtgacgtacgtgccctactcgatggggcggat1740

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tggcgcgttccgcaacgcgtcgccgttcaagttcacggcgttccaggcggggccgaggat1860

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cttctacagcttccggctgctggaggggcacccggtgcagtaccgcatgatgaccatcct1980

ctccatggcgcacggcctcaaggtccgcgtctctagggccgtctgatgtcatggcgattt2040

ggatatggatatcgtcccgcttaatccacgacaaataacgctcgtgttacaaatttgcat2100

gcatgcatgtaagggaaagcgatgggtttcattggtggcttggcttaagccttaaaaact2160

ccgtcgggtcttgcgaaccaccacatcactagtgttttgtactctactcctcagtggaag2220

tgtagtgacagcatacaagttcatcatatatattatcctctttctt2266

<210>2

<211>395bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aattggcccttacaaaatagctagacgtgcaggtggctggatgtgcgctccctgaatatc60

aacttgtgtctcctccgattcagtccgcagatgaaacttggtaataactgcagctgatcc120

gtcgtcattcatgctatgcaggggattcgatcttcagcatgtgcagtgcaggcaacaaca180

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atgggccgcgcctaagcatccagcccacgcgggcgtgcgcgtcgtcgctacggcttgcgg300

gggaagggatcaagggacgaaccgagaactagtaccagaccggccagcgagcattgcaga360

caccggcttataagttcagctgcgaccaccgctcc395

<210>3

<211>444bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>3

aacctcgcttgtatagttccttgtgctctaacacacgatgatgataagtcgtaaaatagt60

ggtgtccaaagaatttccaggcccagttgtaaaagctaaaatgctattcgaatttctact120

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ggcccaatacgaagcaccgcgacgaagcccaaacagcagtccgtaggtggagcaaagcgc360

tgggtaatacgcaaacgttttgtcccaccttgactaatcacaagagtggagcgtacctta420

taaaccgagccgcaagcaccgaat444

<210>4

<211>23bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>4

gccacatatgcgttgcatcgcgg23

<210>5

<211>23bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gttatttgtcgtggattaagcgg23

<210>6

<211>83bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagt60

ggcaccgagtcggtgcttttttt83

<210>7

<211>17432bp

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

ctcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattg60

tgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgacatgattacgaattcccgatcta120

gtaacatagatgacaccgcgcgcgataatttatcctagtttgcgcgctatattttgtttt180

ctatcgcgtattaaatgtataattgcgggactctaatcataaaaacccatctcataaata240

acgtcatgcattacatgttaattattacatgcttaacgtaattcaacagaaattatatga300

taatcatcgcaagaccggcaacaggattcaatcttaagaaactttattgccaaatgtttg360

aacgatcggggaaattcgagctcggtaccgagctcttactttttcttttttgcctggccg420

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