本發(fā)明屬于培育酵母菌株及鑒定方法。
背景技術(shù)：
：在釀酒工藝中亞硫酸鹽的耐受能力是篩選釀酒菌株的重要指標(biāo)之一，貝酵母和釀酒酵母是葡萄酒生產(chǎn)的的姊妹菌種，但貝酵母在耐硫水平上相對較弱，即使近年研究中發(fā)現(xiàn)了個別對硫有一定耐受能力的菌株，耐硫水平仍遠(yuǎn)低于商業(yè)用釀酒酵母的耐硫能力。研究表明，在釀酒酵母中與耐硫相關(guān)的基因fzf1調(diào)節(jié)作為“硫泵”ssu1蛋白，將毒害細(xì)胞的亞硫酸鹽泵出細(xì)胞外，可在釀酒過程中保證細(xì)胞正常生命活動，同時形成酒品的特殊風(fēng)味，提高葡萄酒的品質(zhì)。研究貝酵母的fzf1基因，對于研究貝酵母的耐硫機(jī)制及培育新型耐硫貝酵母均有重要意義。貝酵母與耐硫相關(guān)基因fzf1的研究的相關(guān)文獻(xiàn)有本發(fā)明人此前發(fā)明專利“貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法”（申請?zhí)枺篶n201310738413.5）。該方法中我們利用了耐硫親本與fzf1基因含有一個插入片段而與其它不耐硫的親本在該片段存在長度差異標(biāo)記雜交后代，結(jié)合含硫培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，獲得了6個不同的耐硫貝酵母雜交后代菌株。同時，以dna序列及issr圖譜為鑒定依據(jù)加上耐硫表型篩選。該方法是首次用雜交的方式培育貝酵母耐硫菌株的報道，但所獲得的菌株耐硫水平較低，鑒定方法差異較大，也未涉及轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)化子的鑒定。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在培育耐硫水平更高的貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因的新菌株，并提供可供選擇的篩選鑒定轉(zhuǎn)fzf1基因的耐硫貝酵母轉(zhuǎn)化子的方法。本發(fā)明以上目的通過以下方法實現(xiàn)：一、制備貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的方法該方法包括貝酵母fzf1基因重組dna載體構(gòu)建和復(fù)制，以及克隆的貝酵母耐硫轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)，其中：（1）以耐硫貝酵母a9的fzf1-1序列和acy338的fzf1-2序列作為外源基因，用bamhi和sali酶切，合成并構(gòu)建入pgem–teasy載體中，構(gòu)建貝酵母fzf1基因重組dna載體；（2）以重組dna載體為模板，用bamhi和sali對pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，引物為：fzf1-1-l：gcaggatccatggccaatacaaagaaacct，fzf1-1-r：caggtcgacttagtattcaaataagctcct；fzf1-2-l：5′-gcaggatccatggcaaataaaaagaaactg，fzf1-2-r：5′-caggtcgacttagtattcgaataagctcct；引物下劃線部分分別是酶切位點，其產(chǎn)物與同樣經(jīng)bamhi和sali雙酶切的表達(dá)載體pyip5連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pyip5-fzf1-1和pyip5-fzf1-2，導(dǎo)入受體細(xì)胞克隆。進(jìn)一步，所述克隆的貝酵母耐硫轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)是收集克隆轉(zhuǎn)化子到含40mm亞硫酸鈉和80mm琥珀酸且ph3.5的ypd培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑選生長狀況良好的轉(zhuǎn)化子作為貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子。二、鑒定貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的方法該鑒定方法是至少選擇以下之一種：（1）用貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子，以含ampr基因擴(kuò)增引物：ampr-l：gctgcgccttatccggtaac，ampr–r：tctgcgcgtaatctgctgct；組成pcr反應(yīng)體系鑒定pcr產(chǎn)物，取得轉(zhuǎn)化子316bp特征條帶。（2）提取貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的總rna，反轉(zhuǎn)錄成cdna模板進(jìn)行fzf1基因的rt-pcr定量分析，引物為：fzf1-1-s-lq：atggccaatacaaagaaacct，fzf1-1-s-rq：ttagtattcaaataagctcct；fzf1-2-lq：atggcaaataaaaagaaactg，fzf1-2-rq：ttagtattcgaataagctcct；act1-lq：ctgggaygayatggaraagat，act2-rq:gytcrgccaggatcttcat；鑒定結(jié)果：轉(zhuǎn)化子的fzf1基因表達(dá)量較非轉(zhuǎn)化子明顯上升，差異達(dá)到顯著水平。進(jìn)一步，所述的鑒定方法：提取貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的總rna，分析轉(zhuǎn)錄組顯示：轉(zhuǎn)化子的硫代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因met16與cyc1或met16與met17的表達(dá)量明顯上調(diào)。進(jìn)一步，所述的鑒定方法：將貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子置于液體ypd培養(yǎng)基上，記錄其生長狀況，以測定轉(zhuǎn)化子生長曲線。本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)僅用a9雜交以引入fzf1基因不同，本發(fā)明同時以a9和acy338的fzf1基因作為外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒pyip5-fzf1-1和pyip5-fzf1-2導(dǎo)入受體細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)移這兩種貝酵母菌株轉(zhuǎn)fzf1基因后代到含40mg/l亞硫酸鈉的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所顯示的耐硫能力大幅提高（見表1）。相比之前的發(fā)明，本發(fā)明調(diào)整了增強(qiáng)了基因的表達(dá)水平，而不是僅僅引入一個基因而已，因此硫耐受度有較大的提升。并且，本發(fā)明進(jìn)行的是定量檢測，而之前的發(fā)明是進(jìn)行定性檢測；本發(fā)明涉及了表達(dá)后水平的檢測，而之前發(fā)明僅涉及表達(dá)前水平的檢測（見表1）。本發(fā)明的有益效果是：與現(xiàn)有技術(shù)僅用a9雜交以引入fzf1基因不同，本發(fā)明同時以a9和acy338的fzf1基因作為外源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，構(gòu)建重組質(zhì)粒pyip5-fzf1-1和pyip5-fzf1-2導(dǎo)入受體細(xì)胞克隆，轉(zhuǎn)移這兩種貝酵母菌株轉(zhuǎn)fzf1基因后代到含40mg/l亞硫酸鈉的培養(yǎng)基上培養(yǎng)所顯示的耐硫能力提高約10倍（見表1）。相比之前的發(fā)明，本發(fā)明調(diào)整了增強(qiáng)了基因的表達(dá)水平，而不是僅僅引入一個基因而已，因此硫耐受度有較大的提升。并且，本發(fā)明進(jìn)行的是定量檢測，而之前的發(fā)明是進(jìn)行定性檢測；本發(fā)明涉及了表達(dá)后水平的檢測，而之前發(fā)明僅涉及表達(dá)前水平的檢測（見表1）。表1本發(fā)明與發(fā)明專利“貝酵母耐硫雜交育種后代的鑒定方法”對比注：培養(yǎng)基中所用瓊脂糖品牌不同，每個培養(yǎng)皿中所含培養(yǎng)基為30ml。本發(fā)明鑒定方法包括以含ampr基因擴(kuò)增引物組成pcr反應(yīng)體系鑒定、rt-pcr檢測、轉(zhuǎn)錄組分析以及轉(zhuǎn)化子生長曲線測定共四種方法。通過檢測得到兩種貝酵母菌株轉(zhuǎn)fzf1基因后代所含有的轉(zhuǎn)基因特征帶、轉(zhuǎn)化子的fzf1基因表達(dá)量或轉(zhuǎn)化子的硫代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因met16和cyc1、met17的表達(dá)量變化，以確認(rèn)新的轉(zhuǎn)基因貝酵母菌株的耐硫性。該發(fā)明在分子水平上提供了檢測貝酵母菌株轉(zhuǎn)fzf1基因后代多種方法，這些方法結(jié)合使用，可提高了轉(zhuǎn)化子鑒定的準(zhǔn)確率，并可以了解到菌株在轉(zhuǎn)錄組水平的調(diào)控變化，為選育在釀酒過程中耐硫逆境的酵母以及利用具有生產(chǎn)實踐意義。本發(fā)明屬于云南省林學(xué)一流學(xué)科建設(shè)經(jīng)費(fèi)（項目編號51600625）和云南省高校林木遺傳改良與繁育重點實驗室開放基金（項目編號31360404）資助項目。附圖說明圖1為貝酵母菌株及轉(zhuǎn)化子在含40mm硫的ypd培養(yǎng)基上的生長狀況。其中：1和12為a9；2-11為a9-fzf1-1候選克隆子；13-22為a9-fzf1-2候選克隆子。圖2為貝酵母菌株及質(zhì)粒pyip5-fzf1-1的fzf1基因pcr結(jié)果。其中2為a9；3-12為轉(zhuǎn)化后的候選克隆子；m為m,1kbplusladder,invitrogen。圖3為貝酵母菌株及質(zhì)粒pyip5-fzf1-2的fzf1基因pcr結(jié)果。其中2為a9；3-12為轉(zhuǎn)化后的候選克隆子；m為m,1kbplusladder,invitrogen。圖4為fzf1基因在不同菌株中的表達(dá)水平。其中，**為差異極顯著，ns為差異不顯著。圖5為不同菌株的生長曲線圖。圖6為a9-fzf1-1vsa9轉(zhuǎn)化菌株與a9在通道富集go注釋中的差異表達(dá)基因。圖7為a9-fzf1-2vsa9轉(zhuǎn)化菌株與a9在通道富集go注釋中的差異表達(dá)基因。以下結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，具體實施方式的實例包括但并不限于所指出的內(nèi)容。具體實施方式一、貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的制備實施例1：材料：耐硫貝酵母菌株為a9，菌株引自新西蘭奧克蘭大學(xué)（引入人:張漢堯，2010年），大腸桿菌dh5α，以上菌株均保存于本實驗室。貝酵母菌株可向奧克蘭大學(xué)richardgardner教授索要。聯(lián)系方式如下：winescienceprogramme,schoolofbiologicalsciences,universityofauckland,privatebag92019,auckland,newzealand大腸桿菌dh5α，基因轉(zhuǎn)化時，用于擴(kuò)增目標(biāo)質(zhì)粒的大腸桿菌菌株，是常規(guī)菌株，可向經(jīng)營生物試劑的公司購買。試劑：引物由上海生物工程公司合成；taqdna聚合酶、dntps、rnase購自上海生物工程公司；dnamarker為1kbplusladder，購自invitrogen；酵母基因組dna提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司其他常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。制備:fzf1-1序列與耐硫貝酵母a9的一致，親本起源于貝優(yōu)酵母（s.eubayanus）,fzf1-2序列則來自貝酵母acy338。fzf1-1和fzf1-2基因兩端分別帶有bamhi和sali的酶切位點，均合成并構(gòu)建入pgem–teasy載體中，提供服務(wù)的公司為恒創(chuàng)基因公司。（1）提取和純化貝酵母dna：在ypd培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)非耐硫貝酵母菌株acy338和耐硫貝酵母菌株a9，擴(kuò)增其細(xì)胞。收集細(xì)胞于離心管，使細(xì)胞破碎，釋放內(nèi)含物，使dna與蛋白質(zhì)等分離，收集dna。其中，ypd培養(yǎng)基是含10g/l酵母粉、20g/l蛋白胨、20g/l瓊脂、20g/l葡萄糖的固體培養(yǎng)基。所收集的dna可在agrose膠上電泳，以紫外檢測儀與標(biāo)準(zhǔn)分子量相比較估算被測dna的分子量和濃度。（2）以耐硫貝酵母a9的fzf1-1序列和acy338的fzf1-2序列作為外源基因，用bamhi和sali酶切，合成并構(gòu)建入pgem–teasy載體中，作為貝酵母fzf1基因重組dna載體；（3）構(gòu)建貝酵母fzf1基因表達(dá)載體：以人工合成目的基因并構(gòu)建在pgem–teasy質(zhì)粒上的重組dna載體為模板，用bamhi和sali對貝酵母fzf1基因重組dna載體模板復(fù)制的pcr產(chǎn)物進(jìn)行酶切，引物為：fzf1-1-l：gcaggatccatggccaatacaaagaaacct，fzf1-1-r：caggtcgacttagtattcaaataagctcct；fzf1-2-l：5′-gcaggatccatggcaaataaaaagaaactg，fzf1-2-r：5′-caggtcgacttagtattcgaataagctcct；引物下劃線部分分別是酶切位點，其產(chǎn)物與同樣經(jīng)bamhi和sali雙酶切的表達(dá)載體pyip5連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pyip5-fzf1-1和pyip5-fzf1-2，并通過電擊轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌dh5α中。（4）制備受體細(xì)胞獲得克隆的目的基因：轉(zhuǎn)化實驗前2天，于ypda培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上活化菌株；轉(zhuǎn)化前1天，挑取活化的酵母細(xì)胞（單克隆）于ypda液體培養(yǎng)基中，30°c，200rpm培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)過夜的酵母細(xì)胞液按1：3的比例轉(zhuǎn)接于新的ypda液體培養(yǎng)基中，于30°c搖床內(nèi)，200rpm培養(yǎng)4h；3000g離心5分鐘收集酵母細(xì)胞，用0.5倍體積的無菌水洗酵母細(xì)胞；再次3000g離心5分鐘，用0.01倍體積的無菌水重懸酵母細(xì)胞，并轉(zhuǎn)入新離心管中，20°c，3000g離心5分鐘；用0.01倍體積的無菌細(xì)胞懸浮液(5%v/v甘油，10%v/v二甲基亞砜)重懸酵母細(xì)胞；將重懸的酵母細(xì)胞按50ul分裝到1.5ml離心管中備用。在lb培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)含重組質(zhì)粒pyip5-fzf1-1、pyip5-fzf1-2的大腸桿菌dh5α，提取重組質(zhì)粒；將貝酵母菌株a9與重組質(zhì)粒按體積比（8～10）：1混勻于電擊杯中電擊，室溫靜置后加入少量yep培養(yǎng)液，28℃靜置1h，然后28℃，200rpm培養(yǎng)2h，構(gòu)建作為目的基因的克隆轉(zhuǎn)化子。以上lb培養(yǎng)基是含胰化蛋白胨10g/l酵母提取物5g/lnacl10g/l的液體培養(yǎng)基。yep培養(yǎng)基是含10g/l牛肉浸膏、10g/l酵母粉、5g/lnacl，ph為7.0的液體培養(yǎng)基；（4）收集步驟（3）所克隆的轉(zhuǎn)化子到含40mm亞硫酸鈉和80mm琥珀酸且ph3.5的ypd培養(yǎng)基上培養(yǎng)24小時后，挑選生長狀況良好的轉(zhuǎn)化子作為貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子。二、貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的耐硫性鑒定實施例2：從生長于40mm亞硫酸鈉的培養(yǎng)基上貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子pyip5-fzf1-1、pyip5-fzf1-2中各隨機(jī)挑選5個轉(zhuǎn)化子，共計10個候選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行pcr分析。pcr步驟包括：（1）組成pcr反應(yīng)體系（單位：微升）配方：2.5微升10×pcrbuffer(包含mg2+),1微升的10mm前導(dǎo)鏈引物1微升的10mm后導(dǎo)鏈引物0.5微升的10mm10mmdgtp、datp、dctp和dctp0.2微升的5u/μltaqdna聚合酶2微升模板dna17.8微升dh2o上述pcr反應(yīng)體系的引物為ampr基因的引物ampr-l：gctgcgccttatccggtaac和ampr–r：tctgcgcgtaatctgctgct。（2）pcr反應(yīng)程序：①95℃5分鐘；②95℃解鏈30鈔；③54℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35個循環(huán)；⑥72℃延伸7分鐘。（3）pcr產(chǎn)物用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果：經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，該瓊脂糖凝膠含0.5μg·ml-1的溴化乙錠，電壓為3～5v/cm，照像記錄。（4）pcr分析：貝酵母菌株及轉(zhuǎn)化子的fzf1基因pcr鑒定結(jié)果見圖3：10個候選轉(zhuǎn)化子均含有轉(zhuǎn)基因特征帶，且只有一條大小為316bp的條帶，非轉(zhuǎn)化子不能產(chǎn)生特征帶。實施例3：rt-pcr篩選轉(zhuǎn)基因后耐硫轉(zhuǎn)化子（1）rna提取和cdna合成提取貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子在ypd液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，用于rna提取。rna提取用quaigene試劑盒提供的方法提取，然后將rna用fermentas試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cdna。（2）rt-pcr根據(jù)chen等（2008）年報道的方法操作，rt-pcr引物為：fzf1-1-s-lqatggccaatacaaagaaacct，fzf1-1-s-rqttagtattcaaataagctcct；fzf1-2-lqatggcaaataaaaagaaactg，fzf1-2-rq：ttagtattcgaataagctcct；act1-lqctgggaygayatggaraagat，act2-rqgytcrgccaggatcttcat。實驗重復(fù)3次。t2c–δδ（kennethj.livakandthomasd.schmittgen,2001）則被用于分析數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)導(dǎo)入excel2007進(jìn)行分析。差異顯著性分析，使用單因子的anova方法進(jìn)行分析。kennethj.livakandthomasd.schmittgen.analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe22ddctmethod.methods25,402–408(2001).結(jié)果：轉(zhuǎn)化子的fzf1基因表達(dá)量較非轉(zhuǎn)化子明顯上升，差異達(dá)到顯著水平。實施例4：轉(zhuǎn)錄組分析。提取貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子及非轉(zhuǎn)化子的總rna，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。結(jié)果：轉(zhuǎn)化子的硫代謝網(wǎng)絡(luò)相關(guān)基因的表達(dá)量發(fā)生明顯變化（見表2）。在兩種fzf1基因轉(zhuǎn)化子中，met16的表達(dá)量是上調(diào)的；jlp1在a9-fzf1-2中表達(dá)量上調(diào)，inp54在a9-fzf1-1中表達(dá)量上調(diào)。然而，cyc1和met17下調(diào)。表2轉(zhuǎn)化子與出發(fā)株a9相比在硫代謝相關(guān)基因中上調(diào)和下調(diào)的基因geneidtransformstrainsstartingstraina9log2foldpvalueqvaluediffswiss-prot-annotationunigene1153_all471.1684a1471.0511.1220661.33e-576.19e-57upgn=inp54unigene2317_all16.86287a110.66272.193781.04e-122.30e-12upgn=met16unigene681_all13.88707a0.001-5.316142.01e-053.24e-05downgn=cyc1unigene2136_all13.88707a0.001-5.316142.01e-053.24e-05downgn=met17unigene2317_all30.18016b110.66271.6510767.22e-101.43e-09upgn=met16unigene1552_all19.20556b49.607431.1456120.0017830.002493upgn=jlp1unigene681_all18.29101b0.001-5.416483.77e-066.29e-06downgn=cyc1unigene2136_all8.230953b0.001-4.264480.0028690.003932downgn=met17注：a，a9-fzf1-1；b，a9-fzf1-2。實施例5：測定轉(zhuǎn)化子生長曲線。用1%的出發(fā)菌株a9及貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子接種于0.05l的ypd液體培養(yǎng)基，于30℃、220轉(zhuǎn)/分鐘下培養(yǎng)，每4小時用分光光度計測量一次其在600nm波長下的光吸收值，測定其生長率。用未接種菌株的ypd液體培養(yǎng)基作為對照，以od600值為縱坐標(biāo)以生長時間為橫坐標(biāo)制定菌株的生長曲線。鑒定結(jié)果：轉(zhuǎn)化子的生長較快，而非轉(zhuǎn)化子則生長較慢。sequencelisting<110>西南林業(yè)大學(xué)<120>制備貝酵母轉(zhuǎn)fzf1基因耐硫轉(zhuǎn)化子的方法<130>權(quán)利要求書、說明書<160>16<170>patentinversion3.5<210>1<211>30<212>dna<213>fzf1-1-l<400>1gcaggatccatggccaatacaaagaaacct30<210>2<211>30<212>dna<213>fzf1-1-r<400>2caggtcgacttagtattcaaataagctcct30<210>3<211>30<212>dna<213>fzf1-2-l<400>3gcaggatccatggcaaataaaaagaaactg30<210>4<211>30<212>dna<213>fzf1-2-r<400>4caggtcgacttagtattcgaataagctcct30<210>5<211>20<212>dna<213>ampr-l<400>5gctgcgccttatccggtaac20<210>6<211>20<212>dna<213>ampr-r<400>6tctgcgcgtaatctgctgct20<210>7<211>21<212>dna<213>fzf1-1-s-lq<400>7atggccaatacaaagaaacct21<210>8<211>21<212>dna<213>fzf1-1-s-rq<400>8ttagtattcaaataagctcct21<210>9<211>21<212>dna<213>fzf1-2-l<400>9atggcaaataaaaagaaactg21<210>10<211>18<212>dna<213>fzf1-2-r<400>10gtattcgaataagctcct18<210>11<211>21<212>dna<213>act1-lq<400>11ctgggaygayatggaraagat21<210>12<211>19<212>dna<213>act2-rq<400>12gytcrgccaggatcttcat19<210>13<211>894<212>dna<213>fzf1-1基因序列<400>13atggcaaataaaaagaaactgcactctaggaggtataaatgctcttttgaaggctgtggt60aaggactacaacagaccaagtttgcttgaacagcatgagaactctcatttcaatcaaaag120ccgtatctttgcgatgagccgggatgtggcaagaaattcataagaccatgtcacttgaga180gttcataaatggacgcattcacagattaagcccaagccatgcaccttatgcgagaaaaga240tttgtcacgaaccaacaattaaacagacatttaagcagccatgaaagaaaagacaagctc300aagtctaaaatcattactaagaacgaagaaccgggccccaatatcaaatcagactacgga360ggcaatgaattgaatttaggcacgacattgcctgaccagctgcttccactcgatgacaat420ctgccacaagactatttgctccgggctgatgatatgaacgcggtgcggtgtccgtacgta480ttgtgtcaggtacttactacctttgatgacgatttgatcaatcatatgttacaacaccac540attgcaagtaagcttactttgccacctgaagagctgcatctaaacaatcaggcaccagta600tcgccatgttcaagtagcacggacgacgcctccattccacagctttctgcggccgccagt660agtgacagcagctacagcaccggcaccatagtggaaagcctggacgacccagagagttac720tggtccgaccaccggtgcaagcatatacattgccaagagcttgatcgatttgcctccgtg780tttgacctgatcgaccactacgatcacgcgcacgcatacatccctgaaacgctggtgaag840tacagttacattcatctatacaagcccaacgtcaggagcttattcgaatactaa894<210>14<211>894<212>dna<213>fzf1-2基因序列<400>14atggcaaataaaaagaaactgcactctaggaggtataaatgctcttttgaaggctgtggt60aaggactacaacagaccaagtttgcttgaacagcatgagaactctcatttcaatcaaaag120ccgtatctttgcgatgagccgggatgtggcaagaaattcataagaccatgtcacttgaga180gttcataaatggacgcattcacagattaagcccaagccatgcaccttatgcgagaaaaga240tttgtcacgaaccaacaattaaacagacatttaagcagccatgaaagaaaagacaagctc300aagtctaaaatcattactaagaacgaagaaccgggccccaatatcaaatcagactacgga360ggcaatgaattgaatttaggcacgacattgcctgaccagctgcttccactcgatgacaat420ctgccacaagactatttgctccgggctgatgatatgaacgcggtgcggtgtccgtacgta480ttgtgtcaggtacttactacctttgatgacgatttgatcaatcatatgttacaacaccac540attgcaagtaagcttactttgccacctgaagagctgcatctaaacaatcaggcaccagta600tcgccatgttcaagtagcacggacgacgcctccattccacagctttctgcggccgccagt660agtgacagcagctacagcaccggcaccatagtggaaagcctggacgacccagagagttac720tggtccgaccaccggtgcaagcatatacattgccaagagcttgatcgatttgcctccgtg780tttgacctgatcgaccactacgatcacgcgcacgcatacatccctgaaacgctggtgaag840tacagttacattcatctatacaagcccaacgtcaggagcttattcgaatactaa894<210>15<211>297<212>prt<213>fzf1-1氨基酸序列<400>15metalaasnlyslyslysleuhisserargargtyrlyscysserphe151015gluglycysglylysasptyrasnargproserleuleugluglnhis202530gluasnserhispheasnglnlysprotyrleucysaspgluprogly354045cysglylyslyspheileargprocyshisleuargvalhislystrp505560thrhisserglnilelysprolysprocysthrleucysglulysarg65707580phevalthrasnglnglnleuasnarghisleuserserhisgluarg859095lysasplysleulysserlysileilethrlysasnglugluprogly100105110proasnilelysserasptyrglyglyasngluleuasnleuglythr115120125thrleuproaspglnleuleuproleuaspaspasnleuproglnasp130135140tyrleuleuargalaaspaspmetasnalavalargcysprotyrval145150155160leucysglnvalleuthrthrpheaspaspaspleuileasnhismet165170175leuglnhishisilealaserlysleuthrleuproproglugluleu180185190hisleuasnasnglnalaprovalserprocysserserserthrasp195200205aspalaserileproglnleuseralaalaalaserseraspserser210215220tyrserthrglythrilevalgluserleuaspaspproglusertyr225230235240trpserasphisargcyslyshisilehiscysglngluleuasparg245250255phealaservalpheaspleuileasphistyrasphisalahisala260265270tyrileprogluthrleuvallystyrsertyrilehisleutyrlys275280285proasnvalargserleupheglutyr290295<210>16<211>297<212>prt<213>fzf1-2氨基酸序列<400>16metalaasnlyslyslysleuhisserargargtyrlyscysserphe151015gluglycysglylysasptyrasnargproserleuleugluglnhis202530gluasnserhispheasnglnlysprotyrleucysaspgluprogly354045cysglylyslyspheileargprocyshisleuargvalhislystrp505560thrhisserglnilelysprolysprocysthrleucysglulysarg65707580phevalthrasnglnglnleuasnarghisleuserserhisgluarg859095lysasplysleulysserlysileilethrlysasnglugluprogly100105110proasnilelysserasptyrglyglyasngluleuasnleuglythr115120125thrleuproaspglnleuleuproleuaspaspasnleuproglnasp130135140tyrleuleuargalaaspaspmetasnalavalargcysprotyrval145150155160leucysglnvalleuthrthrpheaspaspaspleuileasnhismet165170175leuglnhishisilealaserlysleuthrleuproproglugluleu180185190hisleuasnasnglnalaprovalserprocysserserserthrasp195200205aspalaserileproglnleuseralaalaalaserseraspserser210215220tyrserthrglythrilevalgluserleuaspaspproglusertyr225230235240trpserasphisargcyslyshisilehiscysglngluleuasparg245250255phealaservalpheaspleuileasphistyrasphisalahisala260265270tyrileprogluthrleuvallystyrsertyrilehisleutyrlys275280285proasnvalargserleupheglutyr290295當(dāng)前第1頁12