本發(fā)明屬于生物基因技術領域，具體涉及一種真核表達體系及其制備方法和應用，特別是涉及il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系及其制備方法和應用。

背景技術：

白細胞介素-2(interleukin-2，il-2)，又名t細胞生長因子(tcellgrowthfactor，tcrf)。il-2是在促有絲分裂素或特異性抗原刺激下，由t淋巴細胞或t淋巴細胞系產生的在機體免疫反應中具有重要調節(jié)作用的一種細胞因子。il-2是人體免疫調節(jié)網絡中的核心物質，與其他免疫相關細胞因子有協(xié)同和拮抗作用，共同完成人體免疫機能的調節(jié)作用；其能夠刺激nk、ctl、lak等細胞的活化和增殖，也能促使t淋巴細胞、nk細胞等產生干擾素、腫瘤壞死因子等，在抗病毒、抗細菌感染和抗腫瘤等過程中發(fā)揮重要作用。在惡性腫瘤的發(fā)病過程中，存在免疫逃避導致的免疫監(jiān)視功能異常。腫瘤患者體內的淋巴細胞，如nk、ctl、lak等，不能正常發(fā)揮對腫瘤細胞的免疫殺傷效果。而前述免疫殺傷細胞的活化和增殖均是以il-2為基礎的[dhupkarp,gordonn.interleukin-2:oldandnewapproachestoenhanceimmune-therapeuticefficacy.advexpmedbiol.2017；995:33-51.]。如果能夠適時提供外源il-2，就有可能協(xié)助患者的免疫系統(tǒng)改善對體內腫瘤細胞的免疫殺傷功能。這就是il-2進行腫瘤免疫治療的免疫學基礎。目前的il-2體內注射免疫治療方法只是非特異地提高患者體內的il-2蛋白水平，其免疫調節(jié)作用和促腫瘤殺傷能力較弱，而且缺乏特異性調節(jié)病灶腫瘤微環(huán)境il-2水平、促進對腫瘤細胞進行特異性免疫治療的作用[humrichjy,riemekasteng.clinicaltrials:theriseofil-2therapy-anovelbiologictreatmentforsle.natrevrheumatol.2016dec；12(12):695-696.]。

γ干擾素(ifnγ)屬于ii型干擾素，是一種分泌型蛋白，分泌進而去除信號肽后其分子由143個氨基酸組成，相對分子量為40kda，以同源二聚體或四聚體的形式存在。ifnγ主要由t細胞和nk細胞產生，其基因位于人的12號染色體上。ifnγ在臨床上常用于抗病毒和抗腫瘤治療[textora,listopadjj,wührmannll,perezc,kruschinskia,chmielewskim,abkenh,blankensteint,charoj.efficacyofcart-celltherapyinlargetumorsreliesuponstromaltargetingbyifnγ.cancerres.2014dec1；74(23):6796-805.]。ifnγ的體內應用可實現對多種病毒感染的抑制，從而在免疫調控方面獲得廣泛的應用。同時，ifnγ在體內具有抑制腫瘤細胞生長，阻礙惡性腫瘤轉移和復發(fā)的功能。臨床研究結果表明，ifnγ對白血病、黑色素瘤、神經膠質瘤、淋巴瘤及骨髓瘤等均可以產生明顯的抑制效果。ifnγ主要通過調節(jié)免疫免疫細胞活性，促進免疫系統(tǒng)對原位腫瘤細胞和轉移病灶中腫瘤細胞的殺傷，也可以通過直接誘導腫瘤細胞凋亡、壞死等方式直接殺傷腫瘤細胞，還可以通過干擾腫瘤細胞生長周期、抑制腫瘤組織的血管生成抑制腫瘤細胞增殖。但是目前的ifnγ體內注射治療方法只能實現患者體內ifnγ蛋白水平的非特異性提高，難以實現對腫瘤微環(huán)境中ifnγ水平的特異性高效靶向調節(jié)[konjevicg,radenkovics,srdict,jurisicv,stamatoviclj,milovicm.associationofdecreasednkcellactivityandifnγexpressionwithpstatdysregulationinbreastcancerpatients.jbuon.2011apr-jun；16(2):219-26.]。

技術實現要素：

針對現有技術的不足，本發(fā)明提供一種il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系，該真核表達體系通過使被轉染靶細胞同時表達il-2蛋白和ifnγ蛋白實現對靶細胞特異性的基因免疫治療，既能在病灶局部微環(huán)境提高細胞因子含量進而高效發(fā)揮免疫調節(jié)作用，又能靶向性直接影響腫瘤細胞進而產生針對靶細胞的特異性治療效果；在實現病灶微環(huán)境及靶細胞中il-2和ifnγ比例可控的前提下，提高il-2和ifnγ表達水平。

為解決上述問題，一方面，本發(fā)明在于提供一種il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系的制備方法，包括以下步驟：

(1)以化學合成的寡核苷酸單鏈混合物為靶標基因，設計特異性引物如下：

上游引物：gacacgctagcatgtacaggatgcaactcctgtcttg(seqidno.2)

下游引物：gacacggatccttactgggatgctcttcgacc(seqidno.3)

在含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通過pcr反應進行擴增，獲得第一輪pcr產物；

以第一輪pcr反應液為模板，在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，進行第二次擴增；進行電泳回收基因片段；

(2)將步驟(1)電泳所得基因片段在限制性內切酶nhei和bamhi存在下進行雙酶切，得到酶切的基因片段；

(3)載體pires2-egfp在限制性內切酶nhei和bamhi存在下進行雙酶切，得到酶切的載體片段，序列如seqidno:6所示；

(4)連接基因片段和載體片段，構建pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系。

進一步地，所述步驟(1)中第一輪pcr反應體系為：寡核苷酸單鏈混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul濃度為25mmol/l；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul5u/ul；ddh2o補足至50ul。擴增時，dntp濃度為25mmol/l，pfu聚合酶為5u/ul。

進一步地，所述步驟(1)中第一輪pcr反應的反應條件為：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反應循環(huán)22次；72℃6min。

進一步地，所述步驟(1)中第二輪pcr反應體系為：第一輪pcr產物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul25mmol/l；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul5u/ul；ddh2o補足至41ul。

進一步地，所述步驟(1)中第二輪pcr反應的反應條件為：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反應循環(huán)22次；72℃6min。

進一步地，所述步驟(2)中雙酶切的酶切條件為：步驟(1)基因片段20ul；限制性內切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer5ul；ddh2o補足至50ul；酶切反應體系在37℃恒溫水浴鍋中反應3h。

進一步地，所述步驟(3)中雙酶切的酶切條件為：pires2-egfp1.5ug；限制性內切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer10ul；ddh2o補足至50ul；酶切反應體系在37℃恒溫水浴鍋中反應3h。

進一步地，所述步驟(4)中連接反應條件為：酶切的基因片段6ul；酶切的載體片段，5ul；10×t4dnaligasebuffer2ul；t4dnaligase1ul，5u/ul；ddh2o補足至20ul；連接混合液于16℃水浴連接2h。

另一方面，本發(fā)明提供一種il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系，所述真核表達體系同時包含il-2基因的核苷酸序列和ifnγ基因的核苷酸序列，其中，所述il-2基因的核苷酸序列如seqidno:4所示；所述ifnγ基因的核苷酸序列如seqidno:5所示。

進一步地，所述真核表達體系同時含有il-2和ifnγ蛋白的編碼基因，其編碼基因的核苷酸序列如seqidno:1所示。

另一方面，本發(fā)明提供含有il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系的重組菌。

所述重組菌是指將真核表達體系導入目的菌得到的重組菌。

本發(fā)明提供一種dna片段，其包括如下三種之一：1)編碼區(qū)為seqidno:1所示的dna分子；2)在嚴格條件下與1)限定的dna序列雜交且具有相同功能的dna分子；3)與1)限定的dna序列至少具有70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且具有相同功能的dna分子。

另一方面，本發(fā)明提供il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系在腫瘤免疫治療中的用途。

本發(fā)明真核表達體系的制備方法具有較高的回收率和較好的保持基因的生物活性，適合大規(guī)模純化和制備，易于產業(yè)化。

本發(fā)明通過將il-2基因、ifnγ基因插入載體構建成新的表達體系，在目的細胞中同時轉染，獲得蛋白表達，得到產量和純度高的il-2蛋白和ifnγ蛋白。并具有目的細胞中兩種蛋白的表達比例可控的特性，控制二者的表達量為1:1。

與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明提供一種共表達il-2和ifnγ蛋白的真核表達體系，采用載體來同時負載il-2基因和ifnγ基因，能夠通過同一真核表達體系調控il-2蛋白和ifnγ蛋白表達水平；并可以減少基因載體的用量，減少非治療相關的外源性基因序列的引入；同時實現il-2蛋白與ifnγ蛋白相對表達量可控，控制表達量接近1:1的比例，便于對靶細胞進行精確的細胞免疫功能誘導。該真核表達體系可用于對包括腫瘤細胞在內的靶細胞的基因調控，及對靶細胞免疫微環(huán)境的誘導，既能靶向性的針對惡性腫瘤細胞等產生特應性抗腫瘤效應，又能發(fā)揮細胞因子的免疫誘導和免疫殺傷作用。其中il-2是發(fā)揮免疫調節(jié)作用的細胞因子，ifnγ是發(fā)揮腫瘤靶向性抑制作用的細胞因子，二者聯(lián)合使用，在腫瘤細胞中表達后，能夠實現對腫瘤免疫微環(huán)境中免疫細胞的數量和功能進行調控，并對多種腫瘤細胞進行靶向性治療，通過克服傳統(tǒng)基因表達載體啟動子之間的相互抑制現象實現對腫瘤細胞的免疫殺傷。本發(fā)明提供的制備方法簡單，易于操作。

附圖說明

圖1步驟一所得的基因片段的電泳圖；

圖2pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系圖譜；

圖3pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系的鑒定電泳結果圖；

圖4肝癌細胞表達目的蛋白結果圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但并不局限于此。

以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術包括pcr擴增、質粒提取、質粒轉化、dna片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見《分子克隆實驗指南》(第三版)(sambrookj,russelldw，janssenk,argentinej.黃培堂等譯，2002，北京：科學出版社)，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1構建質粒

步驟一、獲取含有特異性酶切位點的基因片段

經過dnaworks設計后，以化學合成的寡核苷酸單鏈混合物為模板(化學合成方法采用固相亞磷酰胺三酯法，參考文獻pon,r.t.solid-phasesupportsforoligonucleotidesynthesis.methodsinmolecularbiology(totowa,nj,unitedstates)(1993),20(protocolsforoligonucleotidesandanalogs),465–496)，大小987bp，設計特異性引物如下：

上游引物(如seqidno:2所示)：

gacacgctagcatgtacaggatgcaactcctgtcttg

下游引物(如seqidno:3所示)：

gacacggatccttactgggatgctcttcgacc

在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，采用pfu聚合酶，通過pcr反應進行擴增，獲得第一輪pcr產物，其中，引物濃度為1od溶于400ulddh2o，pcr反應體系如下(50μl)：寡核苷酸單鏈混合物7ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul(25mmol/l)；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul(5u/ul)；ddh2o補足至50ul。

pcr反應程序如下：95℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，反應22次循環(huán)；72℃6min。

以第一輪pcr產物為模板，在上述含有特異性酶切位點的上、下游引物的作用下，進行第二次擴增，其中，引物濃度為1od溶于400ulddh2o，

pcr反應體系如下(50μl)：第一輪pcr產物2ul；上游引物1ul；下游引物1ul；dntp1ul(25mmol/l)；10×pfubuffer5ul；pfu聚合酶0.4ul(5u/ul)；ddh2o補足至41ul。

pcr反應反應條件為：95℃3min；94℃30s，58℃30s，72℃60s，反應22次循環(huán)；72℃6min。

兩次pcr擴增結束之后，進行電泳回收基因片段，電泳檢測大小為987bp，其具有如seqidno:1所示的dna序列，電泳情況具體如圖1所示。第1排為擴增前的寡核苷酸單鏈混合物；第2排為第一次擴增產物；第3排為第二次擴增產物。通過兩次擴增，將化學合成的少量寡核苷酸單鏈的量進行提升，以便進一步的插入質粒載體。

步驟二、含有特異性酶切位點的基因片段的酶切

步驟一電泳所得基因片段在限制性內切酶nhei和bamhi存在下進行雙酶切，酶切條件如下：步驟一電泳所得基因片段20ul；限制性內切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer5ul；ddh2o補足至50ul；酶切反應體系在37℃恒溫水浴鍋中反應3h，電泳回收目的條帶，得到酶切的基因片段。

步驟三、pires2-egfp載體的酶切

載體pires2-egfp在限制性內切酶nhei和bamhi存在下進行雙酶切，酶切條件如下：pires2-egfp1.5ug；限制性內切酶nhei和bamhi，各1ul，10u/ul；fdbuffer10ul；ddh2o補足至50ul；酶切反應體系在37℃恒溫水浴鍋中反應3h，電泳回收目的條帶，得到酶切的載體片段，其具有如seqidno:6所示的dna序列。

步驟四、構建真核表達體系

連接基因片段和載體片段，構建pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系(重組載體)。連接反應體系如下(20μl)：酶切的基因片段6ul；酶切的載體片段，5ul；10×t4dnaligasebuffer2ul；t4dnaligase1ul，5u/ul；ddh2o補足至20ul；上述連接混合液于16℃水浴連接2h，構建得到pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系，具體如圖2所示。

步驟五、pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系的鑒定

在dh5a感受態(tài)細菌中，加入步驟四的連接反應液，取陽性菌菌落液50μl，37℃條件下培養(yǎng)后，進行菌液酶切鑒定，酶切反應體系如下：pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系0.5ug；限制性內切酶nhei和bamhi，各0.3ul，10u/ul；fdbuffer2ul；ddh2o補足至20ul；酶切反應條件：37℃，水浴2小時。

分別取上述酶切反應產物，1％瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定，電泳結果如圖3。

電泳結果顯示：

1)電泳后發(fā)現，片段分別為表達蛋白的序列部分和真核表達體系載體部分，所述表達蛋白的序列部分大小為987bp，其具有如seqidno:1所示的dna序列，所述真核表達體系載體部分大小為5220bp，其具有如seqidno:6所示的dna序列。

2)電泳結果圖顯示：從左到右8個條帶代表的克隆中，1、3、4、5、6、7、8為陽性克隆，2為步驟一的寡核苷酸單鏈，9為marker。

將陽性克隆的重組載體(即真核表達體系)測序，其含有目的蛋白的編碼基因片段，為序列表中seqidno:1所示的dna序列，從5’端至3’端依次包括：

酶切位點：seqidno:1所示的第1～6位；

il-2編碼基因序列：seqidno:1所示的第7～465位；

蛋白連接點：seqidno:1所示的第466～480位；

ifnγ編碼基因序列：seqidno:1所示的第481～981位；

酶切位點：seqidno:1所示的第982～987位。

實施例2肝癌細胞表達目的蛋白：

將hepg2人肝癌細胞用0.05％胰蛋白酶工作液消化5min脫壁后，輕輕吹打，分散為單細胞懸液并計數。以0.5×10⁶/孔的細胞數量，以含有10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5％co2和相對濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中。待細胞融合度達50％時，棄去培養(yǎng)液后，采用pbs液輕柔沖洗細胞3次，準備轉染。

將2μg的pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系和pires2質粒載體分別稀釋在0.1mlopti-medium中，20℃放置10min。同時，將10μl的lipofection2000轉染試劑稀釋在0.1mlopti-medium中，20℃放置10min。分別將稀釋的2種質粒體系與稀釋的lipofection2000轉染試劑充分混勻后，20℃放置30min，形成2種轉染試劑混合物。

分別將2種質粒體系形成的轉染試劑混合物，分組加入如前準備好的細胞培養(yǎng)板中，37℃、5％co2和相對濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5h。棄去培養(yǎng)液，采用pbs液輕柔沖洗細胞3次后，繼續(xù)以含有10％胎牛血清的dmem高糖培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃、5％co2和相對濕度95％的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h、72h，分別檢測pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系和pires2質粒載體轉染后的ifnγ和il-2蛋白表達水平，以未轉染對照組為陰性對照。

westernblot法檢測蛋白表達：

分別收集各時間點的各組細胞，棄去細胞培養(yǎng)液，以pbs洗3次。加入蛋白樣品裂解液，充分裂解所有細胞。將裂解好的細胞粘液刮至培養(yǎng)皿的一側，以移液器轉移至1.5毫升離心管中。進一步使用超聲細胞破碎儀破碎dna，破碎實驗條件：冰上操作，設置超聲130w,20khz,pulse20％；超聲20s/次，共三次。破碎后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

常規(guī)勻漿提取蛋白、蛋白質變性。采用考馬斯亮藍比色法檢測蛋白濃度，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sds-page)電泳。電泳完畢后用去離子水沖洗干凈，使用三明治電轉法，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后置于5％的脫脂奶粉中封閉，4℃過夜。棄去封閉液，用tbst漂洗2-3次，加入1:500稀釋的ifnγ或il-2蛋白一抗，室溫下?lián)u床孵育2h，tbst漂洗后，加入辣根過氧化物酶(hrp)標記的二抗，室溫下?lián)u床孵育1h，tbst漂洗后進行二氨基聯(lián)苯胺(dab)顯色，最后以凝膠成像儀保存圖像，如圖4所示。

結果如圖4可見，第1、4條帶分別為pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系轉染48h、72h的蛋白染色結果；第2、5條帶為pires2質粒載體的蛋白染色結果；第3、6條帶為未轉染對照組的蛋白染色結果。結果顯示，pires2-egfp-il-2-ifnγ真核表達體系轉染后，hepg2肝癌細胞中，ifnγ和il-2蛋白的表達水平明顯升高，且72h時的表達水平均高于48h。pires2質粒載體轉染后的ifnγ和il-2蛋白的表達水平與control組沒有差別。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領域的技術人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>中山大學附屬第一醫(yī)院

<120>il-2和ifnγ蛋白共表達的真核表達體系及其制備方法和應用

<130>2017

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>987

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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atgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatcttcagtgt240

ctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagcaaaaacttt300

cacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaactaaaggga360

tctgaaacaacattcatgtgtgaatatgctgatgagacagcaaccattgtagaatttctg420

aacagatggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaactggcggcggggggagc480

atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggc540

tgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgca600

ggtcattcagatgtagcggataatggaactcttttcttaggcattttgaagaattggaaa660

gaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaaattgtctccttttacttcaaacttttt720

aaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatg780

aatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaat840

tattcggtaactgacttgaatgtccaacgcaaagcaatacatgaactcatccaagtgatg900

gctgaactgtcgccagcagctaaaacagggaagcgaaaaaggagtcagatgctgtttcga960

ggtcgaagagcatcccagtaaggatcc987

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<212>dna

<213>人工序列

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<212>dna

<213>未知

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tggattaccttttgtcaaagcatcatctcaacactaact459

<210>5

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<212>dna

<213>未知

<400>5

atgaaatatacaagttatatcttggcttttcagctctgcatcgttttgggttctcttggc60

tgttactgccaggacccatatgtaaaagaagcagaaaaccttaagaaatattttaatgca120

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gaggagagtgacagaaaaataatgcagagccaaattgtctccttttacttcaaacttttt240

aaaaactttaaagatgaccagagcatccaaaagagtgtggagaccatcaaggaagacatg300

aatgtcaagtttttcaatagcaacaaaaagaaacgagatgacttcgaaaagctgactaat360

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<400>6

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