(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種醛酮還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達(dá)重組菌，并使用醛酮還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達(dá)重組菌不對(duì)稱還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯催化合成阿托伐他汀鈣雙手性側(cè)鏈6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。

(二)

背景技術(shù)：

心血管疾病是當(dāng)今對(duì)人類最具威脅的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均已超過(guò)腫瘤性疾病而躍居第一。血液低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)水平上升是誘發(fā)心血管疾病的一個(gè)重要因素，3-羥基-3-甲基輔酶a(hmg-coa)還原酶是膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶。阿托伐他汀鈣能競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶—hmg-coa還原酶活性，減少膽固醇的合成，控制體內(nèi)ldl-c濃度，是臨床上廣泛使用的降血脂藥。

各國(guó)藥監(jiān)部門對(duì)手性藥物的光學(xué)純度設(shè)置了嚴(yán)苛的限制(e.e.值>99.5％，d.e.值>99％)。阿托伐他汀鈣是重大手性藥物品種，6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯是阿托伐他汀鈣合成的關(guān)鍵手性合成前體，開(kāi)發(fā)綠色、低生產(chǎn)成本6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯合成工藝意義重大。傳統(tǒng)的6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯化學(xué)合成法存在諸多缺陷：安全性差；環(huán)境不友好；雙手性合成控制復(fù)雜，產(chǎn)物手性純度低；產(chǎn)物收率低，生產(chǎn)成本高。生物催化具有反應(yīng)條件溫和、選擇性高等優(yōu)勢(shì)，因此，開(kāi)發(fā)6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯手性生物合成技術(shù)具有重要的研究意義及社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益。

利用醛酮還原酶不對(duì)稱還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯往往需要偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶催化輔酶再生體系。常見(jiàn)的醛酮還原酶與葡萄糖脫氫酶分開(kāi)表達(dá)后再協(xié)同催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯工藝細(xì)胞培養(yǎng)批次多，在不同的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行輔酶氧化和還原需要多次跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，這增加了傳質(zhì)阻力。構(gòu)建醛酮還原酶基因-葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)體系，利用醛酮還原酶基因-葡萄糖脫氫酶雙酶共表達(dá)菌體催化合成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯能夠減少一半的細(xì)胞培養(yǎng)批次，且輔酶的氧化和再生在同一個(gè)宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行，這提高了反應(yīng)效率，增加過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性。

(三)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種活性高、立體選擇性好的醛酮還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達(dá)體重組菌，開(kāi)發(fā)其在不對(duì)稱還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯合成6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯上的應(yīng)用。其中醛酮還原酶來(lái)自乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)及其突變體，葡萄糖脫氫酶來(lái)自西伯利亞微桿菌(exiguobacteriumsibiricum)。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種醛酮還原酶基因重組共表達(dá)載體，所述重組共表達(dá)載體以質(zhì)粒pet-28b、質(zhì)粒petduet-1或質(zhì)粒pcdfduet-1為基礎(chǔ)，包含核苷酸序列為seqidno：1所示醛酮還原酶突變體基因和核苷酸序列為seqidno：3所示葡萄糖脫氫酶基因。

本發(fā)明所述的重組表達(dá)載體可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的突變?nèi)┩€原酶基因與葡萄糖脫氫酶基因連接于各種表達(dá)載體上構(gòu)建而成。所述的載體可以為本領(lǐng)域常規(guī)的各種載體，如petduet-1，pacycduet-1、pcdfduet-1、petduet-1、pcoladuet-1、pgex(all)、pmal(all)等，所述質(zhì)粒僅代表部分質(zhì)粒。本發(fā)明所述重組載體優(yōu)選pet-28b、petduet-1、pcdfduet-1質(zhì)粒。

更優(yōu)選，所述重組共表達(dá)載體以核苷酸序列為seqidno：1所示醛酮還原酶突變體基因和核苷酸序列為seqidno：3所示葡萄糖脫氫酶基因?yàn)槟康幕?，以粒pet-28b(+)和質(zhì)粒petduet-1為基礎(chǔ)構(gòu)建而成。

進(jìn)一步，所述重組共表達(dá)載體為雙質(zhì)粒，所述雙質(zhì)粒分別將seqidno：1所示醛酮還原酶突變體基因?qū)胭|(zhì)粒pet-28b，seqidno：3所示葡萄糖脫氫酶基因?qū)雙etduet-1構(gòu)建而成。通過(guò)下述方法制得本發(fā)明的重組共表達(dá)載體：(1)以含seqidno：1所示醛酮還原酶突變體基因的pet-28b(+)-klakrm為一個(gè)質(zhì)粒。以含seqidno：3所示葡萄糖脫氫酶基因pet-28b(+)-esgdh為模板，通過(guò)上游引物：5’-ccatggggcattggcgaa-3’，下游引物5’-gcggccgctcaaccacggccagc-3’，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得seqidno：3所示葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物；(2)將步驟(1)獲得的葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物與pgem-teasy載體連接，獲得重組載體pgem-teasy-esgdh，并利用限制性核酸內(nèi)切酶ncoi和noti雙酶切，獲得葡萄糖脫氫酶基因粘性末端；(3)將步驟(2)獲得的葡萄糖脫氫酶基因粘性末端與表達(dá)載體petduet(mcs1)經(jīng)相同限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切反應(yīng)形成互補(bǔ)的粘性末端用t4dna連接酶連接，獲得質(zhì)粒petduet-esgdh(mcs1)，進(jìn)而生成含有本發(fā)明的醛酮還原酶突變體基因片段與葡萄糖脫氫酶基因片段的重組共表達(dá)載體petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm。

本發(fā)明提供一種由所述重組共表達(dá)載體(或共表達(dá)體系)轉(zhuǎn)化得到的重組基因工程菌。通過(guò)將本發(fā)明的重組共表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至宿主微生物發(fā)揮應(yīng)用價(jià)值。所述的宿主微生物可為本領(lǐng)域常規(guī)的各種宿主微生物。本發(fā)明優(yōu)選e.colibl21(de3)。將本發(fā)明前述的各共表達(dá)體系(包括單質(zhì)粒、雙質(zhì)粒)表達(dá)載體通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化至e.colibl21(de3)中，即可得本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌株。

本發(fā)明涉及一種共表達(dá)醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶的基因工程菌制備方法為：構(gòu)建含有所述醛酮還原酶基因和葡萄糖脫氫酶基因的共表達(dá)體系，獲得共表達(dá)基因工程菌，并進(jìn)行接種、轉(zhuǎn)接、誘導(dǎo)、菌體回收，獲得醛酮還原酶-葡萄糖脫氫酶共表達(dá)菌體。培養(yǎng)基可為本領(lǐng)域任何可使菌體生長(zhǎng)并產(chǎn)生本發(fā)明的培養(yǎng)基，優(yōu)選lb培養(yǎng)基：蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，蒸餾水溶解，ph7.0。培養(yǎng)方法和培養(yǎng)條件沒(méi)有特殊的限制，培養(yǎng)方法和條件可以根據(jù)宿主類型和培養(yǎng)方法等因素的不同按本領(lǐng)域普通知識(shí)進(jìn)行適當(dāng)?shù)倪x擇，例如本發(fā)明采用：將菌液接種于含50μg/ml的lb培養(yǎng)基中，種子液于37℃培養(yǎng)9小時(shí)，以體積分?jǐn)?shù)5％(v/v)為轉(zhuǎn)接量，當(dāng)od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，以乳糖為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)10小時(shí)，即可獲得雙酶的高效表達(dá)，此條件為篩選優(yōu)勢(shì)共表達(dá)菌株時(shí)所用。

本發(fā)明還提供一種醛酮還原酶基因重組共表達(dá)載體構(gòu)建的重組基因工程菌在催化6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱還原中的應(yīng)用，具體所述的應(yīng)用為：以醛酮還原酶基因重組共表達(dá)載體構(gòu)建的重組基因工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為催化劑，以6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯為底物，以葡萄糖為輔助底物(以葡萄糖為輔助底物時(shí)，在葡萄糖脫氫酶催化作用下將菌體內(nèi)源性氧化型nad(p)⁺還原成nad(p)h，nad(p)h作為氫供體參與還原反應(yīng)，或者添加外源性還原型nadh，從成本上而言，選擇不添加外源性輔酶)，以ph7.0、200mm磷酸鉀緩沖液為反應(yīng)介質(zhì)構(gòu)成反應(yīng)體系，在30℃、450轉(zhuǎn)/分鐘條件下進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，ph控制在7.0，用ph-stat調(diào)控反應(yīng)體系的ph，反應(yīng)結(jié)束后(ph基本不再發(fā)生變化)，獲得含6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯的轉(zhuǎn)化液，轉(zhuǎn)化液分離純化，獲得6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯。

進(jìn)一步，所述反應(yīng)體系中，底物初始濃度為20-100g/l(優(yōu)選60g/l)，輔助底物初始濃度為10-150g/l(優(yōu)選90g/l)，催化劑用量以菌體干重(dcw)計(jì)為10-40g/l(優(yōu)選20g(dcw)/l)。

進(jìn)一步，本發(fā)明所述生物催化劑(共表達(dá)醛酮還原酶與葡萄糖脫氫酶重組細(xì)胞)按如下方法制備：將含醛酮還原酶突變體基因與葡萄糖脫氫酶基因的重組基因工程菌接種至含有終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12小時(shí)，獲得種子液；再將種子液以體積濃度5％的接種量轉(zhuǎn)接到含有終濃度50μg/ml卡那霉素的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至菌體濃度od6000.6～0.8(優(yōu)選0.6)，然后加入終濃度為12g/l乳糖，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)12小時(shí)后，4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，獲得濕菌體用生理鹽水洗滌兩次，4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體細(xì)胞，即為生物催化劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，雙酶共表達(dá)全細(xì)胞催化具有以下優(yōu)勢(shì)：本發(fā)明方法在雙酶分開(kāi)單獨(dú)表達(dá)后組合催化方法的最大底物投料量50g/l(已在專利申請(qǐng)(201610124451.5)中公開(kāi))的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提高到60g/l以上，同時(shí)雙酶共表達(dá)體系有利于全細(xì)胞固定化，更具工業(yè)化應(yīng)用前景。

(四)附圖說(shuō)明

圖1共表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。

圖2不同共表達(dá)體系的蛋白膠圖，a中m：標(biāo)準(zhǔn)品，泳道1:e.colibl21(de3)pet-28b(+)-klakrm，泳道2:e.colibl21(de3)pet-28b(+)-esgdh，泳道3:e.colibl21(de3)pet-28b(+)-klakrm/pet-28b(+)-esgdh，泳道4:e.colibl21(de3)pcdfduet-klakrm(mcs2)/pcdfduet-esgdh(mcs1)，泳道5:e.colibl21(de3)pcdfduet-klakrm(mcs2)/pet-28b(+)-esgdh，泳道6:e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm，泳道7:e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh-klakrm，泳道8:e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm，泳道9:e.colibl21(de3)pcdfduet-klakrm–esgdh。b中m：標(biāo)準(zhǔn)品，泳道1:e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh-klakrm/pet-28b(+)-esgdh，泳道2:e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs2)/pet-28b(+)-klakrm。

圖3誘導(dǎo)劑乳糖濃度對(duì)表觀比酶活及菌體量的影響(a)；誘導(dǎo)溫度對(duì)表觀比酶活及菌體量的影響(b)。

圖4不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)表觀比酶活及菌體量的影響(a)、對(duì)可溶性酶蛋白表達(dá)的影響(b)及對(duì)不可溶性酶蛋白表達(dá)的影響(c)；b中m:標(biāo)準(zhǔn)品；泳道1為8小時(shí)；泳道2為10小時(shí)；泳道3為12小時(shí)；泳道4為14小時(shí)；泳道5為16小時(shí)；c中m:標(biāo)準(zhǔn)品；泳道1為klakrm；泳道2為esgdh；泳道3為8小時(shí)；泳道4為10小時(shí)；泳道5為12小時(shí)；泳道6為14小時(shí)；泳道7為16小時(shí)。

圖5外源性nadh的添加量對(duì)6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱還原的影響。

圖6葡萄糖與底物摩爾濃度之比對(duì)6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱還原的影響。

圖7為6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱還原反應(yīng)進(jìn)程曲線：30℃，ph7.0，450轉(zhuǎn)/分鐘，60g/l6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，90g/l葡萄糖，20gdcw/l菌體。

(五)具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：

實(shí)施例1：醛酮還原酶基因(klakrm)與葡萄糖脫氫酶基因(esgdh)克隆及共表達(dá)重組體系構(gòu)建

乳酸克魯維酵母(kluyveromyceslactis)xp1461(基因序列號(hào)：xm_455342.1)。菌株已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物菌種保藏管理中心，保藏日期為2014年8月14日，保藏編號(hào)為cctccno:m2014380，保藏地址為中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，郵編430072，已在專利申請(qǐng)(201410641987.5)中公開(kāi)。該醛酮還原酶通過(guò)分子改造(295位酪氨酸突變?yōu)樯彼幔?96位色氨酸突變?yōu)榱涟彼?，結(jié)合密碼子優(yōu)化，獲得醛酮還原酶突變體(核苷酸序列為seqidno：1所示，氨基酸序列為seqidno：2所示)，突變體酶活較原始提高了14.2倍，對(duì)6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯表現(xiàn)出嚴(yán)格差向選擇性(d.ep>99％)，已在專利申請(qǐng)(201610124451.5)中公開(kāi)，并已將突變酶基因連于表達(dá)載體pet-28b(+)上，即為pet-28b(+)-klakrm，葡萄糖脫氫酶的基因esgdh(核苷酸序列為seqidno：3所示，氨基酸序列為seqidno：4所示)連于表達(dá)載體pet-28b(+)上，即為pet-28b(+)-esgdh。

以pet-28b(+)-klakrm為模板，通過(guò)上游引物(引物1)：5’-ccatggtgaccacccagaaat-3’，下游引物(引物2)5’-gcggccgcttatttctgagattcagagtcgt-3’進(jìn)行pcr擴(kuò)增得到突變?nèi)┩€原酶基因產(chǎn)物。以pet-28b(+)-esgdh為模板，通過(guò)上游引物(引物3)：5’-catatgggcattggcgaa-3’，下游引物(引物4)5’-ctcgagtcaaccacggccagc-3’，進(jìn)行pcr擴(kuò)增獲得葡萄糖脫氫酶基因產(chǎn)物。

pcr反應(yīng)體系組成(總體積50μl)：10倍pfudna聚合酶緩沖液(含mg²⁺)10μl，10mmol/ldntp混合物(datp、dctp、dgtp、dttp各2.5mmol/l)0.5μl，上游引物、下游引物各0.5μl，模板質(zhì)粒1μl，pfutaqdna聚合酶1μl，無(wú)核酸水86.5μl。采用bio-radpcr儀，pcr反應(yīng)條件為：預(yù)變性98℃，4分鐘；然后進(jìn)入溫度循環(huán)98℃，30秒；58℃，30秒；72℃，1.5分鐘；共35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10分鐘，終止溫度為4℃。

獲得pcr擴(kuò)增產(chǎn)物采用回收試劑盒(購(gòu)自axygen，美國(guó)愛(ài)思進(jìn))回收，純化后的片段分別記為片段klakrm、片段esgdh，分別與pgem-teasy載體連接，獲得重組載體pgem-teasy-klakrm、pgem-teasy-esgdh，并利用限制性核酸內(nèi)切酶ncoi和noti雙酶切，形成的突變?nèi)┩€原酶基因粘性末端與表達(dá)載體pcdfduet(mcs1)經(jīng)相同限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切反應(yīng)形成互補(bǔ)的粘性末端用t4dna連接酶連接，利用限制性核酸內(nèi)切酶ndei和xhoi雙酶切，獲得質(zhì)粒pcdfduet-klakrmt(mcs1)；形成的葡萄糖脫氫酶基因粘性末端與表達(dá)載體pcdfduet(mcs2)經(jīng)相同限制性核酸內(nèi)切酶雙酶切反應(yīng)形成互補(bǔ)的粘性末端用t4dna連接酶連接，獲得質(zhì)粒pcdfduet-esgdh(mcs2)；即生成含有本發(fā)明的突變?nèi)┩€原酶基因片段與葡萄糖脫氫酶基因片段的雙質(zhì)粒重組共表達(dá)載體。將klakrm與esgdh交換多克隆位點(diǎn)的位置，得到pcdfduet-esgdh-klakrm，同時(shí)考慮到esgdh酶活及穩(wěn)定性優(yōu)于klakrm，故利用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒將esgdh插入petduet多克隆位點(diǎn)1，如圖1所示，采用相同策略構(gòu)建得到如下共表達(dá)體系：pet-28b(+)-klakrm/pet-28b(+)-esgdh、pcdfduet-klakrm(mcs2)/pcdfduet-esgdh(mcs1)、pcdfduet-klakrm(mcs2)/pet-28b(+)-esgdh、pcdfduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm、pcdfduet-esgdh-klakrm、petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm、pcdfduet-klakrm–esgdh、pcdfduet-esgdh-klakrm/pet-28b(+)-esgdh、pcdfduet-esgdh(mcs2)/pet-28b(+)-klakrm。其中包括雙質(zhì)粒、單質(zhì)粒的共表達(dá)體系，并導(dǎo)入e.colibl21(de3)。

實(shí)施例2：不同共表達(dá)體系醛酮還原酶和葡萄糖脫氫酶的表達(dá)

將上述實(shí)施例1獲得的不同共表達(dá)菌株，接種于含50μg/ml的lb培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)9小時(shí)，獲得的種子液以5％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含50μg/mllb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2～2.5小時(shí)。當(dāng)od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，以終濃度9g/l乳糖為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)10小時(shí)，誘導(dǎo)獲得的發(fā)酵液進(jìn)行4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，獲得濕菌體用生理鹽水洗滌兩次，4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體細(xì)胞。加入ph7.0，200mm的磷酸緩沖液重懸，并在冰上破碎(超聲破碎條件：功率為400w，破碎1s，暫停1s)8分鐘，即可獲得粗酶液，作為蛋白電泳的初始樣品。不同的共表達(dá)體系蛋白表達(dá)情況示于圖2。由圖2可見(jiàn)，e.colibl21(de3)pet-28b(+)-klakrm/pet-28b(+)-esgdh，e.colibl21(de3)pcdfduet-klakrm(mcs2)/pcdfduet-esgdh(mcs1)，e.colibl21(de3)pcdfduet-klakrm(mcs2)/pet-28b(+)-esgdh以及e.colibl21(de3)pcdfduet-klakrm-esgdh幾乎沒(méi)有表達(dá)klakrm，而e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh-klakrm，e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs2)/pet-28b(+)-klakrm，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh-klakrm(mcs1)/pet-28b(+)-esgdh可以發(fā)現(xiàn)雙酶都得到了表達(dá)，從蛋白圖中可以發(fā)現(xiàn)，這5個(gè)菌株表達(dá)klakrm的量?jī)?yōu)于esgdh的量，這也正是我們期望的，通過(guò)犧牲esgdh的表達(dá)量和過(guò)表達(dá)klakrm來(lái)獲得優(yōu)勢(shì)的共表達(dá)體系，因?yàn)閑sgdh的酶活及穩(wěn)定性都優(yōu)于klakrm。

實(shí)施例3：不同共表達(dá)菌株不對(duì)稱還原的效率及比酶活對(duì)比

酶活定義：在標(biāo)準(zhǔn)條件下，每分鐘每生成1μmol6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯所需的酶量為1單位酶活，表觀比酶活即為每克干菌體所具有的酶活單位數(shù)。樣品檢測(cè)方法：6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯，6-氰基-(3s,5r)-二羥基己酸叔丁酯在高效液相色譜下進(jìn)行檢測(cè)，其中色譜柱為hypersilodsc18柱(250×4.6mm,5μm；thermo,美國(guó))，流動(dòng)相乙腈比水體積之比＝1:3(v/v)，流速1.0ml/min，進(jìn)樣量20μl，檢測(cè)波長(zhǎng)210nm，柱溫40℃。在上述條件下，6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯，6-氰基-(3s,5r)-二羥基己酸叔丁酯的保留時(shí)間分別為8.0分鐘、8.5分鐘和12分鐘。

優(yōu)勢(shì)菌株的篩選：反應(yīng)體系為50.0g/l底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，75.0g/l葡萄糖，20gdcw/l菌體(實(shí)施例2獲得的各個(gè)菌體)，于ph7.0、100mm磷酸緩沖液中構(gòu)成50ml反應(yīng)體系，在30℃、450轉(zhuǎn)/分鐘的條件下催化反應(yīng)4h，使用ph-stat(梅特勒，瑞士)控制反應(yīng)液的ph值在7.0左右。反應(yīng)結(jié)束后，移取1ml反應(yīng)液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，獲得上清液。取500μl上清液與500μl無(wú)水乙醇混合，-20℃靜置過(guò)夜，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，上清液過(guò)0.22μm微濾膜，透過(guò)液用于液相色譜分析。具體測(cè)定結(jié)果示于表1。

成功表達(dá)雙基因且催化效率高的共表達(dá)菌株如下：e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh-klakrm，e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs2)/pet-28b(+)-klakrm，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh-klakrm(mcs1)/pet-28b(+)-esgdh，通過(guò)表觀比酶活及以還原50g/l底物的催化性能來(lái)衡量共表達(dá)菌株的優(yōu)劣。發(fā)現(xiàn)，e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs2)/pet-28b(+)-klakrm與e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm表達(dá)情況及比酶活最佳，分別達(dá)到221.6u/g和210.0u/g；在反應(yīng)4小時(shí)內(nèi)，產(chǎn)物6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯濃度分別達(dá)到148.5mm、142.0mm。但是e.colibl21(de3)pcdfduet-esgdh(mcs2)/pet-28b(+)-klakrm在后期中表達(dá)不穩(wěn)定，因此被舍棄，故選擇e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm為優(yōu)選工程菌用于后續(xù)研究。

表1不同共表達(dá)體系構(gòu)建菌株的催化性能

注：a表示在反應(yīng)體系為50.0g/l底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，75.0g/l葡萄糖，20gdcw/l菌體，于ph7.0、100mm磷酸緩沖液中構(gòu)成50ml反應(yīng)體系，在30℃、450轉(zhuǎn)/分鐘的條件下催化反應(yīng)4h

b表示在標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)得的表觀比酶活

實(shí)施例4：e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm菌株的誘導(dǎo)條件優(yōu)化

標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件為，10ml反應(yīng)體系：10.0gdcw/l菌體，25g/l的底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯及37.5g/l的葡萄糖，ph7.0，100mm磷酸緩沖液，30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)15分鐘。

優(yōu)化e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm產(chǎn)酶條件，選擇表觀比酶活和菌體量為考察指標(biāo)，其中表觀比酶活作為首要考察因素。首先優(yōu)化了誘導(dǎo)劑乳糖的用量。乳糖(在發(fā)酵液od值到0.6-0.8時(shí)才加入到發(fā)酵液中去的，通常是預(yù)培養(yǎng)2小時(shí)左右后添加的)添加量分別為3.0、6.0、9.0、12.0、15.0g/l，誘導(dǎo)溫度30℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)9小時(shí)后，12g/l乳糖的誘導(dǎo)效果最佳(圖3中a)。

進(jìn)一步優(yōu)化了誘導(dǎo)溫度。誘導(dǎo)溫度分別為20、28、30、37℃，誘導(dǎo)劑乳糖濃度12g/l，誘導(dǎo)表達(dá)10小時(shí)后，28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)的誘導(dǎo)效果最佳(圖3中b)。

最后，考察了12g/l乳糖、28℃誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下的產(chǎn)酶和菌體生長(zhǎng)曲線，誘導(dǎo)時(shí)間分別為8、10、12、14、16小時(shí)，圖4數(shù)據(jù)揭示，誘導(dǎo)時(shí)間12小時(shí)的酶活最高(圖4)。獲得優(yōu)化的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件：誘導(dǎo)劑乳糖濃度12g/l，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間12小時(shí)，優(yōu)勢(shì)菌的最大表觀比酶活達(dá)到249.9u/gdcw，菌體密度2.0gdcw/l。

實(shí)施例5：輔助底物對(duì)不對(duì)稱還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的影響

10ml反應(yīng)體系條件：10.0g(dcw)/l菌體，25g/l的底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯，ph7.0，100mm磷酸緩沖液，30℃，200轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)15分鐘。

固定底物濃度在25g/l，比較了輔助底物葡萄糖與底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯比例對(duì)其還原效率的影響。還原型輔酶nadh的添加對(duì)不對(duì)稱還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯的影響，其中葡萄糖的添加量(0.069mol/l、0.138mol/l、0.207mol/l、0.276mol/l、0.345mol/l)，nadh的添加量(0、0.025、0.05、0.075、0.1、0.125mm)。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，葡萄糖添加量為37.5g/l時(shí)，6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯不對(duì)稱還原效率最高(圖6)；nadh的添加對(duì)反應(yīng)有促進(jìn)作用，但并不顯著(圖5)。綜合成本因素，選擇不額外添加外源性輔酶。

實(shí)施例6：利用全細(xì)胞不對(duì)稱還原6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯

將e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm接種于含50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)9小時(shí)，種子液采用5％(v/v)接種量轉(zhuǎn)接到新鮮的含50μg/ml卡那霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)2-2.5小時(shí)，當(dāng)od600達(dá)到0.6～0.8時(shí)，以12g/l乳糖為誘導(dǎo)劑，誘導(dǎo)溫度28℃，誘導(dǎo)12小時(shí)，誘導(dǎo)獲得的發(fā)酵液進(jìn)行4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，棄上清，獲得濕菌體用生理鹽水洗滌兩次，4℃、8000轉(zhuǎn)/分鐘離心10分鐘，收集菌體細(xì)胞，作為生物催化劑。

反應(yīng)體系50ml：底物6-氰基-(5r)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯、葡萄糖、20g(dcw)/l全細(xì)胞，ph7.0、100mm磷酸緩沖液，30℃、450轉(zhuǎn)/分鐘的條件下進(jìn)行催化反應(yīng)，使用ph-stat反應(yīng)液ph值維持在7.0左右。反應(yīng)結(jié)束后，移取1ml反應(yīng)液，12000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，獲得上清液，并取500μl上清加500μl的無(wú)水乙醇稀釋，-20℃過(guò)夜，離心12000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘，過(guò)0.22μm的微濾膜，即可獲得樣品。所述底物的初始濃度分別為50、60、75、100g/l反應(yīng)體系，所述葡萄糖的對(duì)應(yīng)用量為75、90、112.5、150g/l反應(yīng)體系，制備的樣品6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯且d.e.值大于99.5％。如表2所示，在最優(yōu)條件下，最高底物投料量60g/l，4小時(shí)左右反應(yīng)結(jié)束，底物完全轉(zhuǎn)化，產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)到178.2mm，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到244.8g/l·d(圖7)，而底物的初始濃度分別為50、60、75、100g/l對(duì)應(yīng)的產(chǎn)率及產(chǎn)量見(jiàn)表2。

表2不同底物濃度對(duì)e.colibl21(de3)petduet-esgdh(mcs1)/pet-28b(+)-klakrm催化反應(yīng)的產(chǎn)物累積濃度及轉(zhuǎn)化率的影響

sequencelisting

<110>浙江工業(yè)大學(xué)

<120>一種醛酮還原酶基因重組共表達(dá)載體、工程菌及其應(yīng)用

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<160>4

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245