本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種st2抗原的制備及其專用編碼dna分子。

背景技術(shù)：

人的st2基因約40kb，位于人類染色體2q12，可編碼一種可溶性蛋白(sst2)和一種跨膜形式蛋白(st2l)，兩者的轉(zhuǎn)錄分別受到不同的啟動(dòng)子調(diào)控?，F(xiàn)已知st2存在4種亞型：sst2、st2l、st2v和st2lv。st2v和st2lv是st2l的兩個(gè)剪接體，st2l包括一個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域(3個(gè)連續(xù)的的免疫球蛋白模體)、一個(gè)跨膜片段和一個(gè)toll/il-1受體(tir)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域；而sst2則缺失跨膜及胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，只有一個(gè)由9個(gè)氨基酸組成的獨(dú)特的c末端序列。

st2是白細(xì)胞介素1(interleukin-1，il-1)受體超家族成員之一，有跨模型(st2l)和可溶性(sst2)種形式，主要表達(dá)于th2細(xì)胞、肥大細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中，參與多種炎癥過(guò)程并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。據(jù)文獻(xiàn)記載il-33為st2的特異性功能配體，后來(lái)證實(shí)il-33和st2l結(jié)合具有心臟保護(hù)作用。研究表明，心力衰竭患者血清中sst2明顯增高，并能夠競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合il-33，阻斷il-33/st2l信號(hào)通路，參與心肌纖維化和心室重構(gòu)。sst2作為心力衰竭的一種新的標(biāo)志物近年來(lái)受到廣泛的關(guān)注。近年來(lái)眾多研究表明sst2在心力衰竭中的應(yīng)用價(jià)值至少與nt-probn相當(dāng)。

il-33是il-1家族成員，可以與靶細(xì)胞上的膜受體結(jié)合后介導(dǎo)下游信號(hào)通路，或者被運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞的細(xì)胞核作為dna結(jié)合因子行使功能。當(dāng)受到生物應(yīng)力刺激時(shí)，由心臟成纖維細(xì)胞合成的il-33與細(xì)胞膜表面的st2l結(jié)合形成復(fù)合物后，將活化信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)，經(jīng)過(guò)下游的il-1相關(guān)蛋白激酶、髓樣分化因子88和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6等一系列信號(hào)分子，激活核轉(zhuǎn)錄因子kb(nuclearfactorkb，nf-kb)和促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，mapk)，從而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致th2細(xì)胞效應(yīng)分子il-5、il-4和il-13等的釋放。急性心肌梗死發(fā)生后，患者血清中sst2升高，sst2與il-33結(jié)合，抑制nf-kb的活化，阻斷一系列反應(yīng)發(fā)生。

蛋白質(zhì)抗原可以通過(guò)以下方式制備：(1)天然蛋白質(zhì)，天然蛋白結(jié)構(gòu)正確，活性穩(wěn)定，是良好的抗原，但是其來(lái)源于組織和細(xì)胞，成分復(fù)雜，難以分離純化；(2)重組蛋白質(zhì)，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，重組蛋白質(zhì)已經(jīng)成為制備抗原的主旋律。目前，重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)主要有原核表達(dá)系統(tǒng)、酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、哺乳細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。其中大腸桿菌(e.coli)原核表達(dá)系統(tǒng)是應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是遺傳背景相對(duì)清楚，具有使用安全、操作簡(jiǎn)單、生產(chǎn)量大、生產(chǎn)成本低、周期短等特點(diǎn)；(3)人工合成多肽，為了制備特異針對(duì)某一抗原表位(抗原決定簇)的抗體，可以制備人工表位肽用于免疫，但是多肽分子一般8～20個(gè)氨基酸，分子量太小，很難引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，所以合成的多肽需要與一個(gè)載體蛋白連接以增強(qiáng)其免疫原性，常用的載體蛋白有：bsa(牛血清白蛋白)、ova(卵清蛋白)、klh(knoweyholelimpethemocyanin，鑰孔戚血藍(lán)蛋白)、rsa(兔血清白蛋白)、hsa(人血清白蛋白)、gst(谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶)、map(多價(jià)抗原肽，主要指多聚lys)，且這種方法的成本較高且制備出的抗體親和力較低。

現(xiàn)有大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白時(shí)，由于天然st2dna序列存在較多的大腸桿菌稀有密碼子和二硫鍵等原因，表達(dá)量較低，且存在發(fā)卡結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄提前終止等現(xiàn)象。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題之一是通過(guò)優(yōu)化st2dna序列構(gòu)建了一種表達(dá)st2的重組載體，提出了一種st2抗原的制備方法，解決了天然st2基因序列中局部gc含量過(guò)高而出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的問(wèn)題，同時(shí)降低了因局部at含量過(guò)高而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄提前終止的可能性，并且所有氨基酸的密碼子均為大腸桿菌系統(tǒng)中有利于高水平表達(dá)的高頻密碼子。

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種dna分子。

本發(fā)明提供的dna分子，為如下1)或2)或3)的dna分子：

1)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的dna分子；

2)與1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

上述嚴(yán)格條件為上述2)中嚴(yán)格條件是指：0.2×ssc，0.1％sds，60℃雜交。

含有上述dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述重組載體為將上述dna分子插入表達(dá)載體得到的載體。

上述重組載體中，所述表達(dá)載體為pet-28a(+)。

st2天然序列中g(shù)gtacagggcgcac、gtgtgacggcgaccaggtcc、ggctgccgtcctgtggcagc等局部序列的gc含量高于70％，高于50％的gc含量的序列，在dna復(fù)制時(shí)雙鏈打開(kāi)需要更高的能量，所以高gc含量會(huì)導(dǎo)致復(fù)制效率底下。再比如，st2天然序列整體的特點(diǎn)是gc含量為41％，at含量為59％，atatataaaaaacaatcagattgcaatgttccagattatttgatgtattcaacagtatctggatcagaaaaaaattccaaaatttatt的gc含量只有23.9％。

選擇的表達(dá)載體pet-28a(+)中，表達(dá)其實(shí)氨基酸密碼atg的上游的91個(gè)核苷酸序列為aaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc，gc含量為33％，其中tagaaataattttgtttaactttaagaaggagatata序列的gc含量只有18.9％。這91個(gè)核苷酸序列中，有啟動(dòng)子(轉(zhuǎn)錄起始)序列。如果一個(gè)蛋白質(zhì)編碼區(qū)內(nèi)部序列g(shù)c含量偏低，極有可能在編碼區(qū)出現(xiàn)短的不需要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(rna)，造成轉(zhuǎn)錄水平的資源浪費(fèi)。

上述的重組菌中，所述重組菌為將上述dna分子插入表達(dá)載體得到的重組菌。

上述dna分子或上述的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或重組病毒在制備st2蛋白中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種制備st2蛋白的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：誘導(dǎo)表達(dá)上述的重組菌，得到st2蛋白。

上述方法中，所述誘導(dǎo)表達(dá)的誘導(dǎo)物為iptg，所述iptg誘導(dǎo)的濃度為0.2mmol/l。

由上述方法制備的st2蛋白也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述dna分子在制備免疫檢測(cè)試劑盒中抗原st2中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于，本發(fā)明利用基因工程手段得到重組表達(dá)的st2抗原，解決了目前st2重組表達(dá)的空白，并且對(duì)st2天然dna序列進(jìn)行優(yōu)化，解決了天然st2基因序列中局部gc含量過(guò)高而出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的問(wèn)題，同時(shí)降低了因天然st2基因序列中局部at含量過(guò)高而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄提前終止的可能性，并且所有氨基酸的密碼子均為大腸桿菌系統(tǒng)中有利于高水平表達(dá)的高頻密碼子，提高了st2抗原原核表達(dá)量。

附圖說(shuō)明

圖1為pet-28a(+)載體的結(jié)構(gòu)圖；

圖2為陽(yáng)性克隆鑒定結(jié)果的核酸電泳圖；

圖3為包涵體沉淀的sds-page電泳圖；

圖4為純化產(chǎn)物的sds-page電泳圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。

實(shí)施例1、st2編碼基因的優(yōu)化

st2天然序列存在不利于蛋白表達(dá)的幾點(diǎn)缺陷：1、gc含量為41％，at含量偏離50％較多，有較多的at豐富區(qū)域，在所需要表達(dá)蛋白的編碼區(qū)內(nèi)出現(xiàn)潛在的轉(zhuǎn)錄起始、提前終止(轉(zhuǎn)錄起始和提前終止會(huì)導(dǎo)致mrna長(zhǎng)度變短或出現(xiàn)不需要的rna片段，不利于目標(biāo)蛋白的完整表達(dá))的可能性非常大。2、局部gc含量偏高(>70％)，易于形成局部發(fā)卡結(jié)構(gòu)，不利于復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等遺傳信息傳遞過(guò)程的順利進(jìn)行。3、個(gè)別氨基酸的密碼子屬于大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的低頻密碼子，比如r(aga、agg)、p(ccc)、i(ata)、l(cta)、g(gga、ggg)等，不利于蛋白的高效表達(dá)。因此，對(duì)天然st2核苷酸序列進(jìn)行了全面優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)st2基因在大腸桿菌系統(tǒng)中的高效表達(dá)。

根據(jù)ncbi公布st2蛋白的氨基酸序列(序列2)，優(yōu)化出dna序列(序列1)。

在優(yōu)化后的dna序列5’端添加限制性內(nèi)切酶nhei識(shí)別序列，3’端添加限制性內(nèi)切酶xhoi識(shí)別序列，得到優(yōu)化后的st2編碼基因。

人工合成優(yōu)化后st2編碼基因的核苷酸序列序列1，該優(yōu)化后st2編碼基因編碼st2蛋白。

優(yōu)化前st2編碼基因的核苷酸序列為序列3，人工合成。

實(shí)施例2、st2抗原的制備

1、表達(dá)載體的構(gòu)建

將實(shí)施例1中人工合成優(yōu)化后st2編碼基因序列1用xhoi和nhei雙酶切后替換原核表達(dá)載體pet-28a(+)(merckmillipore公司，目錄號(hào)是69864，圖1)的xhoi/nhei之間的片段，得到pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)。

將實(shí)施例1中人工合成優(yōu)化前st2編碼基因?qū)?shí)施例3中人工合成優(yōu)化后st2編碼基因用xhoi和nhei雙酶切后替換原核表達(dá)載體pet-28a(+)的xhoi/nhei之間的片段，得到pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)。

對(duì)重組質(zhì)粒pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)或重組質(zhì)粒pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)分別進(jìn)行xhoi和nhei雙酶切鑒定，結(jié)果如圖2所示，m：dl5000marker；1:優(yōu)化前重組質(zhì)粒雙酶切；2：優(yōu)化后重組質(zhì)粒雙酶切，可以看出，重組質(zhì)粒經(jīng)xhoi和nhei雙酶切后，電泳均可見(jiàn)到兩條與預(yù)期分子量大小一致條帶，與pet-28a(+)和優(yōu)化后st2編碼基因(或優(yōu)化前st2編碼基因)的大小相符。

2、重組菌的構(gòu)建

1)從-80℃低溫冰箱中取出大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞bl-21，迅速冰浴化開(kāi)；

2)分別取10μl上述重組載體pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)和重組質(zhì)粒pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)加入100μl感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，輕輕混勻，冰浴30分鐘；

3)于42℃下熱激90秒；

4)迅速冰浴5分鐘；

5)加入1mllb培養(yǎng)基，混勻，160rpm，37℃下復(fù)蘇培養(yǎng)1h；

6)取100μl震蕩培養(yǎng)物涂布于含卡那霉素的lb平板上，于37℃培養(yǎng)16小時(shí)，挑選單克隆菌落，小樣搖起來(lái)6h左右至對(duì)數(shù)期，iptg誘導(dǎo)過(guò)夜后sds-page電泳，選取表達(dá)目的蛋白量高的菌種進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確，此即為成功轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，命名為bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)和bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)。

4、誘導(dǎo)表達(dá)純化st2抗原

1)將所得陽(yáng)性克隆bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)和bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)分別接種于含有卡那青霉素的lb培養(yǎng)基中，于37℃，150rpm下培養(yǎng)8～12小時(shí)，得到第一菌液；將第一菌液接種于lb培養(yǎng)基中，于37℃，150rpm下培養(yǎng)至od600達(dá)到0.6，得到第二菌液；于第二菌液中添加終濃度為0.2mmol/l的iptg，于37℃，150rpm下培養(yǎng)16小時(shí)，得到第三菌液；

2)將所得第三菌液中的細(xì)胞進(jìn)行破碎，離心后棄上清液，收集包涵體沉淀；

將包涵體沉淀sds-page電泳檢，結(jié)果如圖3所示，m：marker；1:優(yōu)化前包涵體；2：優(yōu)化后包涵體，可以看出，bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)和bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)沉淀中均含有約35kd的目標(biāo)蛋白st2抗原。

3)將上述包涵體沉淀用6m脲(用25mmph8.5tris-hcl緩沖液配制)溶解，過(guò)濾去沉淀取上清液；

4)用鎳樹(shù)脂對(duì)所得上清液進(jìn)行過(guò)博格隆10mlni柱進(jìn)行純化，平衡液為25mmph8.5tris-hcl6m脲，分別收集穿過(guò)峰，30mm咪唑洗脫液(配方25mmph8.5tris-hcl6m脲)進(jìn)洗脫峰，60mm咪唑洗脫液進(jìn)洗脫峰，120mm咪唑洗脫液進(jìn)洗脫峰，240mm咪唑洗脫液進(jìn)洗脫峰，300mm咪唑洗脫液進(jìn)洗脫峰。300mm咪唑洗脫峰含有目的蛋白，25mmph8.5tris-hcl透析后分裝保存(收集原則為紫外檢測(cè)儀數(shù)值上升開(kāi)始收集，數(shù)值出現(xiàn)下降趨勢(shì)停止收集)。

分別取20μl300mm咪唑洗脫液進(jìn)行sds-page電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖4所示，m：marker；1:優(yōu)化前表達(dá)蛋白；2：優(yōu)化后表達(dá)蛋白，bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化前)和bl21/pet-28a(+)-st2(優(yōu)化后)的純化效果均較好，300mmol/l的咪唑洗脫液得到產(chǎn)物為約35kd大小的目的蛋白，即為st2抗原(dna優(yōu)化前)和st2抗原(dna優(yōu)化后)。

5、比較dna分子優(yōu)化前后制備的st2抗原的差異

1)蛋白濃度

采用紫外分光光度法檢測(cè)蛋白濃度，檢測(cè)st2抗原在280nm處的od值，結(jié)合st2蛋白的消光系數(shù)計(jì)算st2的濃度。測(cè)定200mllb培養(yǎng)基中st2蛋白表達(dá)量，其中st2抗原(dna優(yōu)化后)的蛋白濃度為2.1mg/ml，體積為8.2ml，總計(jì)17.22mg；st2抗原(dna優(yōu)化前)的蛋白濃度約為1.5mg/ml，體積為7.1ml，總計(jì)10.65mg?？梢钥闯觯琩na優(yōu)化后st2抗原的蛋白表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于dna優(yōu)化前st2抗原的蛋白表達(dá)量。

2)天然st2基因序列中局部gc含量過(guò)高而出現(xiàn)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的問(wèn)題

st2天然序列中g(shù)gtacagggcgcac、gtgtgacggcgaccaggtcc、ggctgccgtcctgtggcagc等局部序列的gc含量高于70％，高于50％的gc含量的序列，在dna復(fù)制時(shí)雙鏈打開(kāi)需要更高的能量，所以高gc含量會(huì)導(dǎo)致復(fù)制效率底下。而經(jīng)過(guò)修飾后的序列分別為gctatcgtgctcac、gcgtaactgcaactcgttcc、cactgacttcggtgaaccac，降低了局部gc含量，減少發(fā)卡結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)概率。

3)降低了因天然st2基因序列中局部at含量過(guò)高而導(dǎo)致的轉(zhuǎn)錄提前終止的可能性

由圖3可知，優(yōu)化前的dna序列表達(dá)中除了目標(biāo)蛋白外，還存在比目標(biāo)蛋白要小的一種蛋白，而優(yōu)化后的dna序列中這種非目標(biāo)蛋白表達(dá)量就很低，甚至沒(méi)有，同時(shí)天然st2基因序列中局部at含量過(guò)高而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白表達(dá)量要低于優(yōu)化后的dna序列蛋白表達(dá)量，因此通過(guò)優(yōu)化st2基因序列中局部at含量過(guò)高可以減少轉(zhuǎn)錄提前終止的可能性。

以上所述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。任何根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思所做出的各種其他相應(yīng)的改變與變形，均應(yīng)包含在本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

序列表

<110>北京市華信行生物科技有限公司

<120>表達(dá)st2重組載體的構(gòu)建及st2抗原的制備方法

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>975

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

gctagcggtggtggcggtatgtattccacagcagcaaagtttagtaaacaatcatggggc60

ctggaaaatgaggctttaattgtaagatgtcctagacaaggaaaacctagttacaccgtg120

gattggtattactcacaaacaaacaaaagtattcccactcaggaaagaaatcgtgtgttt180

gcctcaggccaacttctgaagtttctaccagctgaagttgctgattctggtatttatacc240

tgtattgtcagaagtcccacattcaataggactggatatgcgaatgtcaccatatataaa300

aaacaatcagattgcaatgttccagattatttgatgtattcaacagtatctggatcagaa360

aaaaattccaaaatttattgtcctaccattgacctctacaactggacagcacctcttgag420

tggtttaagaattgtcaggctcttcaaggatcaaggtacagggcgcacaagtcatttttg480

gtcattgataatgtgatgactgaggacgcaggtgattacacctgtaaatttatacacaat540

gaaaatggagccaattatagtgtgacggcgaccaggtccttcacggtcaaggatgagcaa600

ggcttttctctgtttccagtaatcggagcccctgcacaaaatgaaataaaggaagtggaa660

attggaaaaaacgcaaacctaacttgctctgcttgttttggaaaaggcactcagttcttg720

gctgccgtcctgtggcagcttaatggaacaaaaattacagactttggtgaaccaagaatt780

caacaagaggaagggcaaaatcaaagtttcagcaatgggctggcttgtctagacatggtt840

ttaagaatagctgacgtgaaggaagaggatttattgctgcagtacgactgtctggccctg900

aatttgcatggcttgagaaggcacaccgtaagactaagtaggaaaaatccaagtaaggag960

tgtttctgactcgag975

<210>2

<211>322

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

alaserglyglyglyglymettyrserthralaalalyspheserlys

151015

glnsertrpglyleugluasnglualaleuilevalargcysproarg

202530

glnglylysprosertyrthrvalasptrptyrtyrserglnthrasn

354045

lysserileprothrglngluargasnargvalphealaserglygln

505560

leuleulyspheleuproalagluvalalaaspserglyiletyrthr

65707580

cysilevalargserprothrpheasnargthrglytyralaasnval

859095

thriletyrlyslysglnseraspcysasnvalproasptyrleumet

100105110

tyrserthrvalserglyserglulysasnserlysiletyrcyspro

115120125

thrileaspleutyrasntrpthralaproleuglutrpphelysasn

130135140

cysglnalaleuglnglyserargtyrargalahislysserpheleu

145150155160

valileaspasnvalmetthrgluaspalaglyasptyrthrcyslys

165170175

pheilehisasngluasnglyalaasntyrservalthralathrarg

180185190

serphethrvallysaspgluglnglypheserleupheprovalile

195200205

glyalaproalaglnasngluilelysgluvalgluileglylysasn

210215220

alaasnleuthrcysseralacyspheglylysglythrglnpheleu

225230235240

alaalavalleutrpglnleuasnglythrlysilethraspphegly

245250255

gluproargileglnglnglugluglyglnasnglnserpheserasn

260265270

glyleualacysleuaspmetvalleuargilealaaspvallysglu

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