本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學檢測領域，涉及免疫層析檢測技術，具體涉及一種用于診斷EB病毒感染的EB病毒抗原，制備該抗原的方法，用該抗原檢測EB病毒的快速檢測試劑盒。

背景技術：

EB病毒（Epstein-Barr Virus，EBV）是人類皰疹病毒4型，由Epstein和Barr在1964年研究非洲兒童惡性淋巴瘤時首次發(fā)現(xiàn)的，具有嗜人類B淋巴細胞特性。EBV是一種DNA病毒，呈球形，直徑為180～200nm，在B淋巴細胞中復制。人是EBV感染的宿主，病毒主要通過唾液傳播。無癥狀感染多發(fā)生在幼兒，90%以上的3～5歲幼兒曾感染EBV。細胞免疫在EBV感染中起著關鍵性作用，該功能下降將導致EBV的活化。EBV感染的潛伏期為4～7周，前驅癥狀包括頭疼、乏力等，80%的患者可能出現(xiàn)臨床三聯(lián)征：咽炎，發(fā)熱和淋巴結病。感染可涉及到全身各個器官，一般有發(fā)熱、食欲減退、惡心、嘔吐、腹瀉、全身淋巴結腫大、肝脾腫大、皮疹等。有的還可出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，一般需2～4周的恢復期。EB 病毒急性感染可引起傳染性單核細胞增多癥、噬紅細胞綜合征、X-連鎖淋巴細胞增生綜合征等疾病。

上呼吸道感染是一類病原感染的總稱，引起上感的病原體80%以上為病毒，EB病毒是引起上感的病原體之一。傳染性單核細胞增多癥（Infectious Mononucleosis ，IM）是由EB病毒原發(fā)感染引起的淋巴細胞增生性傳染病，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、咽峽炎、頸淋巴結腫大、肝脾腫大等，和上感癥狀相似。主要由飛沫和唾液經(jīng)呼吸道傳播，因而又稱為“接吻病”。 IM多數(shù)預后良好，少數(shù)可引起嚴重并發(fā)癥， 造成多系統(tǒng)的病變。所以對于確診是否是由EB病毒引起的上感癥狀對于預后和進一步用藥有重要的意義。

原發(fā)性EB病毒感染過程中首先產生針對衣殼抗原（Capsid Antigen, CA） 的IgM和IgG 抗體，在急性感染的晚期，針對早期抗原（Early Antigen, EA）的IgG抗體出現(xiàn)；在恢復期晚期，針對核抗原抗體產生。抗EBV-CA-IgG抗體和抗EBV-NA-IgG抗體可持續(xù)終身。近年來，抗體親合力檢測已用來判斷是否急性期感染。由于 EB病毒感染的血清學反應復雜多樣，有的病例抗EBV-CA-IgM產生延遲，有的持續(xù)缺失或長時間存在，這給EBV-IM的確診帶來一定的難度。

人體感染EB病毒后會產生核抗原、早期抗原、衣殼抗原、膜抗原及淋巴細胞識別抗原等抗原的相應抗體（IgG、IgA、IgM等抗體）。其中，VCA/IgM抗體是出現(xiàn)最早的抗體，90~94%的EB病毒感染者在感染初期能夠被檢測到，是EB病毒急性感染，也是復發(fā)感染的重要標志，是EB病毒感染的早期診斷不可缺少的重要指標。常規(guī)的EB病毒實驗室診斷方法主要有病毒分離、檢測病毒蛋白質及核酸、EBV血清學實驗檢測抗體等幾種方法。病毒分離法一般采用咽漱液直接接種人臍帶血淋巴細胞，根據(jù)轉化淋巴細胞的效率來決定病毒的量。該方法耗時并且需要特殊的組織培養(yǎng)條件，故不適合作為臨床檢測使用；檢測病毒核酸常用的方法有核酸雜交和RT-PCR方法，在病變組織內檢測病毒基因核酸和病毒基因組轉錄產物，在檢測條件和技術等方面要求較高，故臨床常規(guī)檢測中不宜采用；血清學診斷主要通過酶聯(lián)免疫吸附法等方法檢測血清中是否存在CA-IgM/IgG抗體、抗核抗原抗體等特異性抗體，由于其具有靈敏度高、特異性好和易于操作等優(yōu)點，是目前實驗室最常用的辦法之一，對疾病的診斷有一定的參考價值。EB病毒抗體檢測試劑質量取決于抗原的性能，工程表達抗原是制備EB病毒抗原的最佳技術方案。在EB病毒的抗原中，衣殼抗原是一種最佳候選抗原。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一目的是提供一種工程表達EB病毒自身融合衣殼蛋白特異性抗原，該抗原具有高度的特異性和免疫反應性?？乖哂忻庖咴愿?，無特異反應，抗原表位集中等優(yōu)點。

本發(fā)明的第二目的是提供一種制備工程表達EB病毒自身融合衣殼抗原的方法，該方法利用合成融合基因原核表達，通過包涵體復性制備活性高的特異抗原，該方法制備的EB病毒抗原具有特異性和免疫反應性。

本發(fā)明的第三目的是提供一種測定抗EB病毒抗體的試劑盒，該試劑盒為快速“一步檢測法”試劑盒，具有靈敏度高、特異性強，檢測速度快、操作簡便，無需專門設備，適用于臨床檢測、流行病學調查和場地檢疫等多種場合。

本發(fā)明的第四目的是提供一種EB病毒抗體全血快速檢測裝置，它是一種裝有濾膜的可以過濾掉紅細胞的EB病毒全血檢測裝置。

本發(fā)明的第五目的是提供一種EB病毒IgM抗體直接快速檢測裝置，它是一種裝有風濕因子處理墊的可以去掉樣本中風濕因子的EB病毒檢測裝置。

本發(fā)明的主要內容

（1）一種EB病毒抗原，它是一種采用基因工程技術人工合成的抗原。

（2） 一種制備EB病毒抗原的方法，包括人工合成EB病毒融合衣殼抗原基因序列，構建原核表達載體，大腸桿菌表達EB病毒融合衣殼蛋白，采用透析法、梯度稀釋法和凝膠層析法復性包涵體，獲得具有三維結構和免疫活性的重組EB病毒融合衣殼蛋白抗原。

（3） 一種EB病毒抗體快速檢測方法，包括應用上面（1）中的EB病毒抗原。

（4） 上述（3）中EB病毒抗體快速檢測方法，包括（1）中的EB病毒抗原固定到一種硝酸纖維素膜，一種標記抗體（二抗）固定到固相載體上，待測樣品與標記抗體（二抗）接觸，若待測樣品中存在EB病毒抗體，則EB病毒抗體與標記二抗形成抗體-標記二抗復合物，“復合物”在硝酸纖維素膜水平移動，遇到固定到膜上的EB病毒抗原產生反應，帶有標記的“復合物”就被特異地固定到抗原上，固定抗原的位置就會有顯色反應；若待測樣品不含EB病毒抗體，則“復合物”不能固定到抗原的位置上，此處就沒有顯色反應，可依據(jù)硝酸纖維素膜固定抗原位置是否有顯色反應，來判斷檢測結果，即待測樣品中是否有EB病毒抗體。

（5） 上述（4）EB病毒抗體檢測方法，其中待測樣品是人的全血，血漿或血清。

（6） 上述（4）或（5）中測定EB病毒抗體的方法，其中的標記抗體（二抗）是標記的抗人IgM或抗人IgG抗體。

（7）上述（4）-（6）中標記抗體是膠體金屬顆?；蛘卟噬z乳顆粒標記的抗體。

（8） 一種快速檢測EB病毒抗體的試劑盒，它所用抗原為上述（1）中的EB病毒抗原。

（9） 上述（8）中用于快速檢測EB病毒抗體的試劑盒，其中的標記抗體是膠體金屬顆粒標記抗體或者彩色膠乳顆粒標記抗體。

（10） 上述（8）中用于檢測的試劑盒，其中的濾血膜是固定有抗紅細胞單抗或者多抗的無紡布。

（11） 上述（8）中用于檢測的試劑盒，其中的風濕因子處理墊是固定有抗風濕因子單抗或多抗的無紡布。

本發(fā)明試劑盒陰陽性符合率、精密性、靈敏度等均符合質量標準要求，有效期內產品質量穩(wěn)定。類風濕因子、乙型肝炎病毒抗體、梅毒螺旋體、人類免疫缺陷病毒抗體、巨細胞病毒抗體、單純皰疹病毒抗體陽性標本不會對本試劑盒檢測結果造成干擾。

下面對本發(fā)明進行詳細闡述。

本發(fā)明的EB病毒抗原，主要通過將EB病毒衣殼蛋白基因構建到原核表達載體pET30a，pET30a-p18-p23表達載體轉化大腸桿菌，篩選陽性重組菌，IPTG誘導重組菌表達EB病毒自身融合衣殼抗原蛋白，經(jīng)細菌裂解、包涵體溶解和重組蛋白結構復性與純化等步驟獲得。

下面將詳述本發(fā)明制備EB病毒抗原的方法。

從GenBank獲取EB病毒衣殼蛋白基因序列，根據(jù)呼吸道合胞EB病毒衣殼蛋白基因P18和P23人工合成EB病毒自身融合衣殼蛋白基因序列。目的基因經(jīng)雙酶切后與經(jīng)同樣雙酶切過得原核表達載體連接，轉化感受態(tài)細胞（大腸桿菌）、篩選陽性重組菌。陽性克隆菌提取質粒、雙酶切和測序鑒定，證明插入的目的基因正確。重組菌經(jīng)IPTG誘導表達、離心得重組菌沉淀，菌體重懸于緩沖液后超聲裂解，離心獲得包涵體形式的的蛋白沉淀，經(jīng)洗滌后溶于尿素溶液中復性。變性蛋白需要經(jīng)過結構復性與純化才能獲得天然蛋白的免疫反應原性和達到EB病毒抗體檢測的應用標準。

對于EB病毒衣殼抗原重組蛋白包涵體復性方法，可應用透析法、梯度稀釋法、凝膠層析法等，優(yōu)選透析法和梯度稀釋法相結合的方法，因為它們易于控制，蛋白復性率高。

對于包涵體復性后EB病毒融合衣殼蛋白的純化方法，可應用凝膠層析、親和層析等，優(yōu)選凝膠層析法，因為它最易于控制，收率高。

通過基因重組獲得的EB病毒融合衣殼抗原具有較高的特異性和敏感性。

對于快速測定抗體的方法，這里列舉的是優(yōu)選的方法，如應用各種標記抗體的免疫層析測定，應用各種標記抗體的免疫滲濾法等。

下面詳述免疫層析測定方法。

抗EB病毒抗體免疫層析測定方法包括下述步驟：EB病毒自身融合衣殼抗原固定到固相載體1上，標記抗體（二抗）固定到固相載體2上，待測樣品與標記抗體（二抗）接觸，若待測樣品存在EB病毒抗體，則EB病毒抗體與二抗反應形成抗體-標記二抗復合物，該“復合物”在固相1上水平移動，遇到固定到載體1上的EB病毒抗原產生反應，帶有標記的“復合物”就被特異地固定到抗原上，固相載體上固定固定抗原的位置就會有顯色反應；若待測樣品不含EB病毒抗體，則“復合物”不能固定到抗原的位置上，此處就沒有顯色反應，可依據(jù)固相載體上固定抗原位置是否有顯色反應，來判斷檢測結果，即待測樣品中是否有EB病毒抗體。

對于固相載體1，可應用例如硝酸纖維素膜（NC膜）、PVDF膜等。優(yōu)選硝酸纖維素膜。

對于固相載體2，可應用例如玻璃纖維素膜，無紡布等任何一種形式。優(yōu)選無紡布作結合物釋放墊，因為它最易于控制。

對于標記的抗體，這里指的是用不同標記物標記的抗體，這里指的是抗人IgM抗體或抗人IgG抗體，可依據(jù)被檢測抗體的種類適當應用。

本發(fā)明的有益效果

（1） 本發(fā)明包括EB病毒自身融合衣殼抗原的優(yōu)化表達，合成了優(yōu)化的自身融合衣殼蛋白基因序列，這一序列的表達更高，特異性更強。而且本發(fā)明還探索出了一套完整的包涵體抗原純化和復性的方法，制備出的抗原收率高，免疫原性高。

（2） 本發(fā)明還制備出了一種一步法檢測EB病毒抗體的試劑盒。該試劑盒檢測EB病毒的IgG或IgM抗體，利于確證感染的階段，對于EB病毒的治療提示作用明顯。

（3） 本發(fā)明還可以直接檢測全血樣本，在檢測卡上有濾血膜，可以用少量全血樣本檢測。

（4） 本發(fā)明還可以直接檢測無需處理風濕因子的樣本，在檢測卡上有風濕因子處理墊，可以直接檢測樣品而不受樣本中的風濕因子的干擾，

因此，本發(fā)明可以通過一次取樣一步法全血檢測呼吸道EB病毒的感染。適于基層醫(yī)療機構和醫(yī)院門診。

附圖說明

圖1 顯示了發(fā)明試劑—檢測板的外觀結構示意圖

1-檢測板 2-加樣孔 3-檢視窗

圖2顯示了發(fā)明試劑—檢測條的外部結構示意圖

4-加樣端吸水紙層 5-金標抗體層 6-控制線 7-檢測線

8-檢測層 9-吸水端吸水層 10-襯板

具體實施方式

實施例1 重組EB病毒自身融合衣殼蛋白抗原重組表達、結構復性與純化

EB病毒衣殼抗原P23-P18融合基因參考GenBank序列 V01555.2，選取P23編碼基因BLRF2（氨基酸1~162）和P18編碼基因BFRF3的C端基因序列，兩段基因之間通過多肽接頭(Gly₄Ser)₃ DNA序列連接獲得融合基因，進行全基因人工合成，表達載體為pET30a，連接時酶切位點為EcoR I//XhoI，目的基因共750bp（249 aa），轉化到BL21（DE3），表達的重組蛋白共297aa，分子量30.8 kDa，等電點11.03。重組蛋白以包涵體形式表達，可用Ni柱純化。

重組表達載體的構建與鑒定：分別用EcoRI和XhoI對EB病毒融合衣殼蛋白目的基因片段及pET30a質粒進行雙酶切，酶切產物純化回收后，16℃連接過夜，再轉入E.coliDH5α感受態(tài)細胞，挑取轉化菌落提取質粒進行PCR、酶切及測序鑒定。經(jīng)PCR及雙酶切鑒定，均證實有大小約750bp的基因片段插入載體，與預期的結果一致。測序結果表明插入目的基因片段為750bp，核酸序列與提交合成的EB病毒p18-p23融合基因序列完全相同，構建的表達載體開放閱讀框正確，可以表達重組蛋白。

重組蛋白的誘導表達：取50μL pET30a-p18-p23 BL21(DE3)菌液加入到5mL含100 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 rpm培養(yǎng)過夜，次日按1:50接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至吸光值OD600為0.6左右時，加入IPTG至濃度為1mmol/L，進行誘導表達4小時，5000rpm離心30分鐘，收集菌體，用TE緩沖液懸浮，充分混勻，-80 ℃反復凍融3次，超聲破菌，4 ℃、12000 rpm離心15 min，收集上清，沉淀用2 M尿素洗2次，4 ℃、12000 rpm離心15 min，剩余沉淀用8 M尿素溶解，4 ℃保存。沉淀用SDS-PAGE分析蛋白表達量。電泳條件，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。蛋白染色為考馬斯亮藍染色法，考馬斯亮藍R-250染色3h，乙酸-乙醇脫色液脫色至背景無色為止。

重組蛋白的結構復性與純化：室溫條件下用10mmol/L,pH7.2的PBS緩沖液對EB病毒自身融合衣殼蛋白p18-p23重組表達蛋白8M尿素的溶解液進行梯度透析稀釋，按溶液中尿素濃度分別為6mol/L、4mol/L、3 mol/L控制稀釋梯度，每個梯度稀釋的時間分別為3-4h。將完成稀釋復性的含3mol/L尿素的溶解液4℃放置24h。稀釋復性的溶液10000r/min離心除去沉淀物質，上清液通過以S-300為介質的凝膠層析分離法進行純化，從而獲得重組EB病毒自身融合衣殼抗原。所得重組EB病毒衣殼抗原組分進行SDS-PAGE，以確定蛋白質的分子量及蛋白純度。電泳條件，濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為12%。蛋白染色為考馬斯亮藍染色法，考馬斯亮藍R-250染色液染色3h，乙酸-乙醇脫色液脫色至背景無色為止。主蛋白條帶出現(xiàn)在30.3 kDa處，蛋白純度達到95%以上。

實施例2 一種EB病毒抗體IgG/IgM金標快速檢測試劑盒的制備

上述所得到基因重組EB病毒自身融合衣殼蛋白p18-p23作檢測抗原，在硝酸纖維素膜包被檢測線；參照圖2，制備EB病毒抗體金標快速檢測試劑，其組成成分包括：在襯板10上設有加樣端吸水層4、檢測層8和吸水層9，在檢測層和加樣端吸水層4之間設有金標抗EB病毒抗體層5，在檢測層8上包被有檢測線7和質控線6。其中加樣端吸水層4和吸水端吸水層9由多層濾紙制成：檢測層8為硝酸纖維素膜；金標抗體層為玻璃纖維或無紡布浸取膠體金標記抗體。

檢測試劑制備程序包括：制備金標抗體層5和檢測層8的質控線6、檢測線7的包被，然后再在襯板10上組合金標測試條和檢測卡1.在塑料襯板10的兩端分別粘貼加樣端吸水紙層4與吸水端吸水層9；在其中段粘貼包被檢測線和質控線的纖維素層8，在加樣端吸水紙層4與纖維素膜層8的交接部位，夾貼含金標抗體層5的玻璃纖維，玻璃纖維的4/5部分在加樣端吸水紙層4中間，1/5部分在纖維素膜層8上。然后按照4毫米寬、7厘米長規(guī)格切條。再參照圖2，將檢測條組裝于塑料盒內形成檢測卡1。盒蓋上加樣孔2正對測試條的加樣端吸水紙層4，觀察孔3正對纖維素膜的檢測層8。

上述的金標抗體層的制備方法包括下述步驟：ⅰ膠體金的制備，取100mg氯金酸溶于1000mL三蒸水中，加入15mL濃度為1%的檸檬酸三鈉溶液，煮沸15分鐘，可得到直徑為15-50納米的膠體金顆粒溶液；ⅱ膠體金標記抗人IgG或IgM單克隆抗體，取100ml膠體金溶液，用0.2M碳酸鉀溶液調pH為8.4，加入1mg抗人IgG/IgM單克隆抗體，攪拌20分鐘，再加入240mg牛血清白蛋白（BSA）,繼續(xù)攪拌5分鐘，4℃靜置2-4小時；ⅲ將上述膠體金溶液經(jīng)2000轉/分鐘離心10-15分鐘，去沉淀，得到上清；ⅳ 將上清液經(jīng)10000轉/分鐘離心60分鐘得到沉淀；ⅴ將沉淀溶于4mL0.02M pH7.4的Tris-Hcl緩沖液得到膠體金溶液，該溶液中含有0.25%BSA和0.02%疊氮鈉；ⅵ將膠體金溶液浸入玻璃纖維或者無紡布至液體開始滲出為止，37℃干燥2小時形成金標抗體層5。

所述的檢測層8是在硝酸纖維素膜上設有重組EB病毒融合衣殼抗原構成的檢測線7和由羊或兔抗鼠IgM/IgG抗體形成的質控線6。其制備方法是取上述（1）所制備的重組EB病毒衣殼抗原，調濃度為1.5mg/mL，加入2%的甲醇，用噴膜機在纖維素膜中段噴檢測線7；再取羊或兔抗鼠IgM/IgG抗體調濃度為1.5mg/mL，用噴膜機在纖維素膜中段，距檢測線0.5cm處，噴涂質控線6，按2uL/cm設置噴膜量，噴膜后置于37℃干燥2小時，再用0.01mLpH7.0的含10%小牛血清的PBS在37℃下封閉30分鐘，0.01mLpH7.0的PBS漂洗，45℃干燥。

實施例3 EB病毒抗體的測定

取血清或者血漿樣品10μl滴于檢測板1的樣品孔2內，再滴加100μl樣品稀釋液于樣品孔2內，在觀察窗3觀察檢測結果，觀察結果20分鐘內有效。若樣品中含有抗EB病毒抗體，則在觀察窗內看到檢測線和質控線出現(xiàn)兩條紅色線條，檢測結果判為陽性；若血清中不含有抗EB病毒抗體，則在觀察窗質控線位置看到一條紅色線，檢測結果判定為陰性；若觀察窗內一條紅色都看不到，則檢測結果無效。

實施例4 全血樣品的檢測

本發(fā)明實現(xiàn)的EB病毒免疫層析快速檢測試劑盒對抗凝全血樣本可直接檢測，無需血漿或血清分離，其實現(xiàn)的原理在于，在樣品墊增加一層濾血膜，濾血膜中固化有抗人血紅細胞抗體（單抗或多克隆抗體），檢測時，當抗凝血全血進入濾血膜后血液中紅細胞被抗體結合到濾血膜上，血漿滲入樣品墊，完成檢測。

實施例5 分濕因子處理墊的確定

本發(fā)明實現(xiàn)的EB病毒免疫層析快速檢測試劑盒在檢測卡上安裝有分濕因子處理墊，可以去除掉樣品中的分濕因子，無需提前除去血液樣品中的分濕因子。其實現(xiàn)的原理在于，在樣品墊增加一層抗分濕因子處理墊，處理墊上固化有抗人分濕因子抗體（單克隆抗體或多克隆抗體），檢測時，當血液樣品進入樣品墊后血液中的分濕因子被抗體結合到處理墊上，其余樣品滲入樣品墊，完成檢測。

實施例6 對臨床樣品的敏感性和特異性

用本發(fā)明的EB病毒抗原及檢測方法制備EB病毒抗體（IgM）金標檢測試劑，檢測58份EB病毒抗體IgM陽性臨床血清樣品和92份EB病毒抗體IgM陰性臨床血清樣品來進行特異性和敏感性試驗。同時，為了驗證本發(fā)明的效果，對用本發(fā)明的EB病毒抗原進行的金標檢測試劑與歐蒙公司產的試劑盒進行符合率分析，結果見表1、表2。

表1：本發(fā)明的EB病毒抗原的特異性及敏感性檢測結果

表1的結果顯示，本發(fā)明抗原的敏感性達到93.10%，特異性達到95.65% 。本發(fā)明的抗原可以作為進一步研發(fā)EB病毒抗體檢測試劑盒。

表2： 用本發(fā)明抗原進行的檢測試劑與歐蒙公司（EUROIMMUN）試劑的符合率分析

表2結果顯示，本發(fā)明檢測試劑盒與歐蒙公司試劑的陽性符合率為94. 83% ，陰性符合率為97.83%，總符合率為96.67%，說明本發(fā)明試劑盒的檢測結果與歐蒙公司用EB病毒抗體檢測試劑盒具有較好的符合率。因此，本發(fā)明具有較好的臨床應用價值。

需要指出的是，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍內。

<110> 蘭州雅華生物技術有限公司

<120> 一種EB病毒抗原制備方法及利用該抗原制備的檢測EB病毒抗體的快速檢測試

劑盒

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 749

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgtcagctc cacgcaaagt cagattgcct tctgttaagg ctgttgacat gagcatggaa 60

gacatggccg cccgcctggc tcgcctggag tctgagaata aggctctgaa gcaacaggtc 120

ctcagagggg gtgcctgtgc ctcgtctacc tctgttcctt ctgctccagt gcctccgcct 180

gagccgctta cagctcgaca gcgagaggta atgattacgc aggccacggg ccgtttggcg 240

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ccctctgttt cttcatctat tagcagcctc cgggccgcga cttcgggggc gactgccgcc 660

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