本發(fā)明涉及化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，提供了一種凝血酶直接抑制劑多肽鹽及其合成、純化方法。

背景技術(shù)：

凝血酶直接抑制劑的多肽部分已有相關(guān)的報(bào)道(美國專利號(hào)為US5433940A)。中國專利CN102558305A提供了所述多肽的水合鹽，通式為C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·mX·nH₂O；X為醋酸、鹽酸或三氟醋酸，m的取值范圍為1≤m≤4，n的取值范圍為2≤n≤12，所述水合鹽具有良好的水溶性，利于制備多肽藥物臨床使用。然而此品作為一種注射制劑，其等滲、穩(wěn)定性和安全性等性質(zhì)需要嚴(yán)格控制。本發(fā)明預(yù)解決該技術(shù)難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)存在的技術(shù)難題，本發(fā)明的一個(gè)目的是為提供具有足夠滲透性和安全性凝血酶直接抑制劑多肽鹽。

本發(fā)明通過大量實(shí)驗(yàn)提供了一種凝血酶直接抑制劑多肽鹽，其通式為C₉₈H_138-mN₂₄O₃₃·0.5myX；

所述C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃是指以下氨基酸組成的多肽：D-Phe-Pro-Arg-Pro-Gly-Gly-Gly-Gly-Asn-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-OH，

X為鈉離子(Na⁺)、鉀離子(K⁺)、銨離子(NH₄⁺)或者鎂離子(Mg²⁺)、鈣離子(Ca²⁺)，當(dāng)X為鈉離子、鉀離子或銨離子時(shí)，y＝2；X為鎂離子或鈣離子時(shí)，y＝1，m的取值范圍為1≤m≤5，m為自然數(shù)。

本發(fā)明中，多肽的COOH和X通過陰陽離子形式結(jié)合。除特殊制定，與多肽結(jié)合的X均以上述離子形式存在。

本發(fā)明中除了特殊限定，所述多肽鹽中多肽的氨基酸組成詳細(xì)構(gòu)象及順序如下：D-Phenylalanyl(1)-L-Prolyl(2)-L-Arginyl(3)-L-Prolyl(4)-Glycyl(5)-Glycyl(6)-Glycyl(7)-Glycyl(8)-L-Asparagyl(9)-Glycyl(10)-L-Aspartyl(11)-L-Phenylalanyl(12)-L-Glutamyl(13)-L-Glutamyl(14)-L-Isoleucyl(15)-L-Proly(16)L-L-Glutamyl(17)-L-Glutamyl(18)-L-Tyrosyl(19)-L-Leucine(20)。

所述多肽分子中增加為Na⁺、K⁺、NH₄⁺、Mg²⁺或者Ca²⁺的X，形成多肽鹽，特別是鈉鹽、鉀鹽和銨鹽，在保證足夠水溶性的同時(shí)，提高多肽及其制劑的穩(wěn)定性，保證注射使用的效果，降低不良反應(yīng)，提高安全性。

進(jìn)一步地，X優(yōu)選為Na⁺，相對(duì)于K⁺、NH₄⁺、Mg²⁺或者Ca²⁺具有更好的穩(wěn)定性，且易于制備。

所述m的優(yōu)選取值范圍為1≤m≤3，特別是1、2和3，進(jìn)一步保證多肽鹽的水溶性和穩(wěn)定性，具有更優(yōu)異的穩(wěn)定性效果。

本發(fā)明的目的之一在于提供一種所述凝血酶直接抑制劑多肽鹽含有一定水分的水合鹽，通式C₉₈H_138-mN₂₄O₃₃·0.5myX·nH₂O,其中，n優(yōu)選取值范圍為1≤n≤8，n的取值包括1、2、3、4、5、6、7和8等，以及各數(shù)值的中間任意值。

n<1在制備過程中存在一定難度，如采用高溫干燥可能會(huì)造成多肽雜質(zhì)的產(chǎn)生，影響藥物穩(wěn)定性，如采用低溫減壓干燥，將大大增加生產(chǎn)時(shí)間，增加成本。而n>8時(shí)，多肽鹽的穩(wěn)定性明顯變差。

進(jìn)一步優(yōu)選n的優(yōu)選取值范圍為2≤n≤5，保證溶解性，易于產(chǎn)品作為注射制劑制備，同時(shí)，控制水分對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響。

上述凝血酶直接抑制劑多肽鹽分子式為C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·nH₂O時(shí)在紅外衍射圖中以波數(shù)cm^-1表示，其紅外光譜在703、1030、1134、1204、1246、1403、1451、1536、1658、2960(cm^-1)處有特征吸收峰，誤差±2，在3300cm^-1左右有一寬峰(在紅外光譜為寬峰時(shí)，可能誤差較大，所以，所述“左右”可以理解為±10均為該物質(zhì)可能的范圍內(nèi))，應(yīng)注意：特定物質(zhì)的不同樣品具有同樣的主要紅外衍射吸收峰，但可能存在一定操作誤差，當(dāng)由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員，采用相應(yīng)方法得到的同晶型樣品采用相同的儀器和檢測方法進(jìn)行檢測時(shí)，吸收峰誤差通常在±2cm^-1以內(nèi)(同樣地，各吸收峰誤差通常在±2cm^-1以內(nèi)的含義指的是大部分吸收峰，如超過80％以上的吸收峰誤差在此范圍內(nèi)，而偶然有個(gè)別少數(shù)的吸收峰的誤差超出該范圍，均應(yīng)認(rèn)為屬于相同晶型的紅外吸收峰譜圖)。

紅外衍射檢測條件：

測試儀器：美國尼高力公司生產(chǎn)的Avatar 330型紅外分光光度計(jì)，測試方法：KBr壓片法。

本發(fā)明的目的之一在于提供所述的凝血酶直接抑制劑多肽鹽的制備方法，具體地，包括以下制備步驟：

采用固相合成方法制備得到C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2TFA(TFA為三氟乙酸)，將其溶解于水中，加入堿的水溶液至溶液的pH＝3.6，析出沉淀，離心，冷水洗滌，沉淀再與以C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃摩爾數(shù)為1計(jì)的m摩爾的堿的水溶液反應(yīng)，反應(yīng)后水溶液凍干，采用經(jīng)質(zhì)譜測定多肽的分子量，X的含量測定用離子色譜法，利用卡爾-費(fèi)休滴定儀測定水分。

所述堿選自NaOH、Na₂CO₃、NaHCO₃、KOH、K₂CO₃、KHCO₃、氨水、Ca(OH)₂、Mg(OH)₂中的一種。

采用上述方法，不僅可以提高制備收率，同時(shí)，相對(duì)于其他酸堿調(diào)節(jié)制備方案，更有益于保證產(chǎn)品的純度和穩(wěn)定性，最大程度的降低新的雜質(zhì)的產(chǎn)生。

其中，所述C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2TFA的多肽鹽可以通過CN102558305A公開的固相合成方法制備得到。

本發(fā)明的目的之一在于提供一種注射使用藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物中含有所述的凝血酶直接抑制劑多肽鹽和一種以上藥學(xué)上可接受的載體，采用注射用水為溶媒。優(yōu)選載體為甘露醇，由于本發(fā)明性能優(yōu)異的多肽鹽，使得注射安全性效果更為優(yōu)異。且采用甘露醇優(yōu)于與其他注射用載體組合的使用效果。

再者，在對(duì)所述載體進(jìn)行大量優(yōu)選研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)載體為甘露醇，所述凝血酶直接抑制劑多肽鹽以C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃計(jì)，與甘露醇的質(zhì)量比優(yōu)選為2：1。當(dāng)質(zhì)量比大于2：1，可能影響藥物的澄明度效果。小于2：1，則不易控制藥物和載體的濃度，增加控制凝血操作的復(fù)雜程度。且該方案優(yōu)于相同比例與其他注射用載體組合的使用效果。

本發(fā)明的一種優(yōu)選方案為所述藥物組合物以水制成每1ml含有1mg的C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃的溶液，藥物組合物的酸堿度為4-6，不論是酸堿度<4或者>6都影響藥物組合物的長期保存穩(wěn)定性。

采用所述載體比例及藥物酸堿度范圍，所述藥物組合物在近18個(gè)月以上的注射用制劑保存條件下，可控制雜質(zhì)總量小于2％，其中特異性雜質(zhì)Asp9雜質(zhì)和D-Phe雜質(zhì)的限量分別小于0.5％。大大的提高了產(chǎn)品的穩(wěn)定性和安全性。

可以理解的是，在含有本發(fā)明多肽鹽的任何原料或者制劑，只要通過酸堿、等電點(diǎn)測定或者其他測定方法確定所述多肽的COOH部分或全部以COO^-形式存在，且采用離子色譜確定所述確定含有Na、K、Mg或者Ca，即可辨認(rèn)含有本發(fā)明的多肽鹽。而且，所述多肽鹽的確認(rèn)不以制備方法及制備前后順序的不同而進(jìn)行區(qū)分，比如采用多肽的酸鹽，如三氟醋酸鹽、鹽酸鹽等，在制劑或者其他終產(chǎn)品的使用中加入足夠量的堿，而最終形成了本發(fā)明的多肽鹽，也可認(rèn)為也屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的有益效果包括但不限于：

(1)、本發(fā)明的多肽鹽相對(duì)于多肽的酸鹽，如三氟醋酸鹽、鹽酸鹽等，進(jìn)一步提高穩(wěn)定性，保證用藥的有效性和安全性。

(2)、凝血酶直接抑制劑多肽水合鹽，C₉₈H_138-mN₂₄O₃₃·0.5myX·nH₂O，易溶于水，特別是X為鈉，m＝1、2或3，且2≤n≤5，保證良好的溶解性，易于產(chǎn)品作為注射制劑制備，同時(shí)，控制水分對(duì)多肽穩(wěn)定性的影響；臨床應(yīng)用過程中，盡可能降低不良反應(yīng)，是目前為止，該多肽鹽產(chǎn)物最佳存在形式。

(3)、所述凝血酶直接抑制劑多肽鹽以C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃計(jì)，與甘露醇的質(zhì)量比為2：1，以水制成每1ml含有1mg的C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃的溶液時(shí)，藥物組合物的酸堿度為4-6，是該多肽鹽作為制劑研究以來最為穩(wěn)定性好及利于臨床應(yīng)用的制劑形式。

附圖說明

圖1，凝血酶直接抑制劑多肽鹽C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·2H₂O的紅外光譜圖

圖2，凝血酶直接抑制劑多肽鹽C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·4H₂O的紅外光譜圖

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但并不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

注：下述C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2TFA的多肽鹽可以通過CN102558305A公開的固相合成方法制備得到。本發(fā)明中采用經(jīng)質(zhì)譜測定多肽的分子量，確認(rèn)多肽的組成，用HPLC測定多肽含量，X的含量測定用離子色譜法，確定X的組成，利用卡爾-費(fèi)休滴定儀測定水分，確定多肽水合鹽的水分含量。

實(shí)施例1凝血酶直接抑制劑多肽鹽C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na的制備

采用固相合成方法制備得到C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃·2TFA，將其溶解于水中，加入堿的水溶液至溶液的pH＝3.6，析出沉淀，離心，冷水洗滌，沉淀再與C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃等摩爾數(shù)的NaHCO₃的水溶液反應(yīng)，反應(yīng)后水溶液凍干。

采用經(jīng)質(zhì)譜測定結(jié)果為(m/z)：2179.9(M+1)，用HPLC測定多肽含量，離子色譜法測定樣品鈉含量，確定Na為1個(gè)，水分含量約為2％—3％。

實(shí)施例2

在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，在多肽與NaHCO₃的水溶液反應(yīng)的步驟中，分別加入以C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃摩爾數(shù)為1計(jì)時(shí)，分別與2、3、4、5摩爾的NaHCO₃的水溶液反應(yīng)，反應(yīng)后水溶液凍干。

實(shí)施例3

在實(shí)施例1和2的基礎(chǔ)上，反應(yīng)后水溶液凍干步驟，控制水分含量，得到C₉₈H_138-mN₂₄O₃₃·mNa·nH₂O，其中，m＝1、2、3、4或5；n＝1、2、3、4、5、6、7或8。

具體的，如C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·1H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·2H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·3H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·4H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·5H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·6H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·7H₂O，C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·8H₂O；

C₉₈H₁₃₆N₂₄O₃₃·2Na·H₂O，C₉₈H₁₃₆N₂₄O₃₃·2Na·3H₂O，C₉₈H₁₃₆N₂₄O₃₃·2Na·6H₂O；

C₉₈H₁₃₅N₂₄O₃₃·3Na·2H₂O，C₉₈H₁₃₅N₂₄O₃₃·3Na·4H₂O，C₉₈H₁₃₅N₂₄O₃₃·3Na·8H₂O；

以及C₉₈H₁₃₄N₂₄O₃₃·4Na·7H₂O，C₉₈H₁₃₄N₂₄O₃₃·4Na·8H₂O等等。

采用以下紅外衍射檢測條件：測試儀器：美國尼高力公司生產(chǎn)的Avatar 330型紅外分光光度計(jì)，測試方法：KBr壓片法，測試凝血酶直接抑制劑多肽鹽的紅外光譜，測試結(jié)果誤差±2cm^-1。

具體的，所述凝血酶直接抑制劑多肽鹽C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·2H₂O和C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na·4H₂O的紅外光譜分別如圖1和圖2所示。

從上述結(jié)果可以看出，凝血酶直接抑制劑多肽鹽C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na.nH₂O，其中n的變化對(duì)前述特征峰1-10的誤差影響不大，可以理解特征峰1-10可以充分代表C₉₈H₁₃₇N₂₄O₃₃·Na.nH₂O的凝血酶直接抑制劑多肽鹽，n＝1≤n≤8，優(yōu)選2≤n≤5。

實(shí)施例4

在實(shí)施例1和2的基礎(chǔ)上，分別將NaHCO₃用KHCO₃、氨水、Mg(OH)₂、Ca(OH)₂替換，得到對(duì)應(yīng)的鉀鹽、銨鹽、鎂鹽和鈣鹽。其中Mg(OH)₂最好使用新鮮制備的，否則成鹽反應(yīng)時(shí)間較長。

實(shí)施例5

在實(shí)施例3的基礎(chǔ)上，分別將NaHCO₃用KHCO₃、氨水、Mg(OH)₂、Ca(OH)₂替換，得到對(duì)應(yīng)的鉀鹽、銨鹽和鈣鹽的水合鹽。其中Mg(OH)₂最好使用新鮮制備的，否則成鹽反應(yīng)時(shí)間較長。

實(shí)施例6一種注射使用藥物組合物

所述藥物組合物含有實(shí)施例1—5任一種的多肽鹽，所述凝血酶直接抑制劑多肽鹽以C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃計(jì)，與甘露醇的質(zhì)量比為2：1，以水制成每1ml含有1mg的C₉₈H₁₃₈N₂₄O₃₃的溶液時(shí)，藥物組合物的酸堿度為5±0.5。

實(shí)施例7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)比

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，多肽鹽對(duì)高溫較為敏感，高溫60℃下易產(chǎn)生雜質(zhì)。每個(gè)多肽鹽取5個(gè)樣品置于潔凈、干燥的稱量瓶中，開口放于無硅膠的密封干燥器中，分別置于60℃恒溫箱中，于第10天取樣，HPLC法測定總雜的變化情況，分析方法同CN102558305A，結(jié)果如下：

從上面結(jié)果可見，本發(fā)明的多肽Na、K、銨、Ca鹽相對(duì)于多肽三氟醋酸鹽在相同的高熱的影響因素實(shí)驗(yàn)下具有更好的穩(wěn)定性。同時(shí)，鈉鹽優(yōu)于鉀鹽、銨鹽和鈣鹽，鈉鹽的水合形式中(n＝2-5)有更為明顯優(yōu)異的穩(wěn)定性效果。

實(shí)施例8溶解性實(shí)驗(yàn)

根據(jù)《中國藥典》2010版第二部附錄XIXC《原料藥于藥物制劑的穩(wěn)定性試驗(yàn)指導(dǎo)原則》的指導(dǎo)，以實(shí)施例得到多肽鹽采用注射用水為溶媒在同等條件下進(jìn)行水溶性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如下：

上述樣品中，Na、K、NH₄⁺鹽的溶解度又明顯大于Ca、Mg鹽的溶解度。從上面結(jié)果可見，本發(fā)明的多肽Na鹽及其水合鹽，達(dá)到易溶的注射用水溶解效果，更利于注射劑的制備和使用。且對(duì)于鈉鹽，m＝2和3，相對(duì)于m＝1，有著優(yōu)異的溶解性效果，更易溶于注射用水。

備注：

極易溶解：1g溶質(zhì)在不到1ml溶劑中溶解；

易溶：1g溶質(zhì)在1～10ml溶劑中溶解；

溶解：1g溶質(zhì)在10～30ml溶劑中溶解；

略溶：1g溶質(zhì)在30～100ml溶劑中溶解；

微溶：1g溶質(zhì)在100～1000ml溶劑中溶解；

極微溶解：1g溶質(zhì)在1000～10000ml溶劑中溶解；

幾乎不溶或不溶指1g溶質(zhì)在10000ml溶劑中不能完全溶解。

實(shí)施例9藥物組合物穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)對(duì)比

將藥物組合物裝入西林瓶中，壓蓋密封，放入溫度為25℃的恒溫箱中留樣觀察，定期取樣，采用HPLC測定總雜含量的增加值。

從上述結(jié)果可見，采用本發(fā)明多肽鹽，特別是鈉鹽，按照本發(fā)明優(yōu)選的制劑處方方案制劑，是作為制劑研究以來最為穩(wěn)定性好及利于臨床應(yīng)用的制劑形式。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。