本發(fā)明涉及多元環(huán)肽，尤其是涉及一種基于四氟苯二甲腈構建穩(wěn)定三元環(huán)肽的方法。

背景技術：

自然界中廣泛存在著一類通過二硫鍵配對形成的構型復雜多樣、結構比較穩(wěn)定、能特異性結合蛋白的多元環(huán)肽，如芋螺毒素、knottins等(Muttenthaler,M.；B.Akondi,K.；F.Alewood,P.Current Pharmaceutical Design 2011,17,4226)。這類多元環(huán)肽被認為在發(fā)展酶的抑制劑或受體拮抗劑中具有廣闊的應用前景。然而，基于二硫鍵的多元環(huán)肽在強還原環(huán)境中易被還原，使得其在生物還原性環(huán)境中的應用受到了限制。目前，主要通過內酰胺化、烯烴復分解、click反應等實現(xiàn)閉環(huán)(Zou,Y.；Spokoyny,A.M.；Zhang,C.；Simon,M.D.；Yu,H.；Lin,Y.S.；Pentelute,B.L.Org Biomol Chem 2014,12,566)。例如，公告號為US20140113871的美國發(fā)明專利，公開了一種基于全氟芳香化合物與半胱氨酸(Cys)的巰基間芳香族親核取代反應構建一元環(huán)肽或實現(xiàn)裝訂的方法(Pentelute,B.L.；Spokoyny,A.M.；Zou,Y.；Zhang,C.；Massachusetts Institute of Technology(Cambridge,MA)US,2015)，但是該方法一般局限于形成一元或二元環(huán)肽，難以在富含巰基的多肽中有效使用。

另外，對于富含巰基的多肽，目前常采用對稱分布的有機小分子骨架構建三元環(huán)肽，但仍然存在著產(chǎn)物復雜，產(chǎn)率低等問題。例如，Peter Timmerman等(Timmerman,P.；Beld,J.；Puijk,W.C.；Meloen,R.H.Chembiochem 2005,6,821)發(fā)現(xiàn)了芐基溴系列化合物與多肽巰基的快速定量反應。其中，均勻分布的1,3,5-三(溴甲基)苯能夠與含3個巰基的多肽形成單一的二元環(huán)肽。但是，均勻分布的1,3,4,5-四(溴甲基)苯則與含4個巰基的多肽形成構型復雜的多種異構體。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于為了克服基于二硫鍵的三元環(huán)肽合成中不易調控、產(chǎn)物復雜等問題，提供可提高環(huán)肽在細胞內強還原環(huán)境中的穩(wěn)定性，得到耐還原環(huán)境、結構可調控、構型約束的三元環(huán)肽的一種基于四氟苯二甲腈構建穩(wěn)定三元環(huán)肽的方法。

本發(fā)明的具體步驟如下：

將多肽溶于溶劑中得溶液A，將過量化合物1溶解于有機溶劑中得溶液B，將溶液A和B加入硫醇還原劑，再用無機堿或有機堿將溶液調節(jié)至堿性后反應，使用色譜分離并凍干，得到三元環(huán)肽產(chǎn)物。

所述多肽可采用含4個半胱氨酸的多肽，或含2個半胱氨酸和2個青霉胺的多肽；所述溶劑可選自水、乙腈、甲醇等中的一種；所述化合物1為2,3,5,6-四氟對苯二腈，結構式如下：

所述有機溶劑可選自乙腈、N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇等中的一種；所述硫醇還原劑可選自三(2-羧乙基)膦鹽或二硫蘇糖醇等中的一種；所述無機堿可選自磷酸鹽、碳酸鹽等中的一種；所述有機堿可選自三羥甲基氨基甲烷、三乙胺等中的一種；所述反應的條件可在20～60℃下反應4～8h。

本發(fā)明提供一種基于2,3,5,6-四氟對苯二甲腈分子中四個氟與多肽中巰基的反應構建碳硫鍵三元環(huán)肽，并且通過青霉胺替換半胱氨酸限制產(chǎn)物結構的方法，從而得到耐還原環(huán)境、結構可調控、構型約束的三元環(huán)肽。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明提供了一種新的構建三元環(huán)肽的小分子骨架，所得到的三元環(huán)肽能夠在強還原環(huán)境中穩(wěn)定存在。通過青霉胺替換半胱氨酸后的多肽與小分子反應能得到產(chǎn)物較為單一、產(chǎn)率高、結構可精確調控的三元環(huán)肽。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的反應原理圖之一。

圖2是本發(fā)明的反應原理圖之二。

圖3是本發(fā)明實施例1的色譜圖。

圖4是本發(fā)明實施例2的色譜圖。

在圖1和2中，1為2,3,5,6-四氟對苯二腈，2為含4個半胱氨酸的多肽(含修飾后多肽)，4為含2個半胱氨酸和2個青霉胺的多肽(含修飾后多肽)，圖中的箭頭表示反應產(chǎn)物的不同連接方式。

在圖1中，含4個半胱氨酸的多肽2中的C代表半胱氨酸，橫線部分表示其他氨基酸序列，半胱氨酸之間可以直接相連，也可被其他氨基酸隔開，多肽的其他部分可以被修飾，只需保持含有4個半胱氨酸的特征不變。

在圖2中，含2個半胱氨酸和2個青霉胺的多肽4中的C代表半胱氨酸，Pen代表青霉胺，橫線部分表示其他氨基酸序列，半胱氨酸或青霉胺之間可以直接相連，也可被其他氨基酸隔開，多肽的其他部分可以被修飾，只需保持含有2個半胱氨酸和2個青霉胺的特征不變。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明實施例的具體步驟如下：

將多肽溶于溶劑中得溶液A，將過量化合物1溶解于有機溶劑中得溶液B，將溶液A和B加入硫醇還原劑，再用無機堿或有機堿將溶液調節(jié)至堿性后反應，使用色譜分離并凍干，得到三元環(huán)肽產(chǎn)物。所述多肽可采用含4個半胱氨酸的多肽，或含2個半胱氨酸和2個青霉胺的多肽；所述溶劑可選自水、乙腈、甲醇等中的一種；所述化合物1為2,3,5,6-四氟對苯二腈，結構式如下：

所述有機溶劑可選自乙腈、N,N’-二甲基甲酰胺、甲醇等中的一種；所述硫醇還原劑可選自三(2-羧乙基)膦鹽或二硫蘇糖醇等中的一種；所述無機堿可選自磷酸鹽、碳酸鹽等中的一種；所述有機堿可選自三羥甲基氨基甲烷、三乙胺等中的一種；所述反應的條件可在20～60℃下反應4～8h。

本發(fā)明將2,3,5,6-四氟對苯二腈(化合物1)中的四個氟處于較大的共軛體系中，具有相對較強的反應活性。多肽中的半胱氨酸能夠在堿性條件下于水相(或含乙腈、甲醇等有機相)中與化合物1中的氟發(fā)生親核取代反應。含有四個半胱氨酸的多肽(化合物2)與過量的化合物1在堿性體系(如磷酸緩沖溶液)中反應可以得到四取代產(chǎn)物，即通過碳硫鍵與有機小分子相連的三元環(huán)肽。這一反應可以得到6種三元環(huán)肽。另外，一種非天然氨基酸青霉胺(化合物3)中的巰基與化合物1的取代反應速率慢(比半胱氨酸慢40倍)，用其替代多肽中的半胱氨酸，可以鈍化多肽中的兩個巰基的活性。替換2個半胱氨酸為青霉胺的多肽(化合物4)與化合物1的反應分為四步進行(如圖2)：①②化合物2中兩個半胱氨酸的巰基依次與化合物1中對位的兩個氟發(fā)生親核取代反應，剩余的兩個位點則經(jīng)③和④與青霉胺的巰基反應。這一反應順序使得最終的四取代產(chǎn)物僅有2種，并且產(chǎn)率可以達到85％。通過改變兩種含巰基氨基酸的排布可以得到不同連接方式的三元環(huán)肽，實現(xiàn)了產(chǎn)率高、精確可調、抗強還原環(huán)境的三元環(huán)肽的制備，從而克服目前基于小分子構建多元環(huán)肽產(chǎn)物結構復雜，不易調控的缺陷。

化合物1的結構：

化合物3的結構：

以下給出具體實施例：

實施例1

將WGCKCGGKGGCGKGGGCGW(兩端分別酰胺化和氨基化)溶于水中，在室溫下，50μM多肽與200μM化合物1在100mM pH＝7.4磷酸緩沖水溶液中反應4h后，得到6種四取代產(chǎn)物，總產(chǎn)率70％，其色譜圖如圖3。利用高效液相色譜純化分離凍干后得到相應的三元環(huán)肽，所得產(chǎn)物經(jīng)質譜表征m/z:960.0(M²⁺),640.3(M³⁺)。

實施例2

將WGCGGKGGPenGKGGGCGKGGGPenGW(兩端分別酰胺化和氨基化)溶于水中，在室溫下，50μM多肽與200μM化合物1在100mM pH＝7.4磷酸緩沖水溶液中反應8h后，得到2種四取代產(chǎn)物，其色譜圖如圖4(8h后主要得到兩種四取代產(chǎn)物，產(chǎn)率85％)。利用高效液相色譜純化分離凍干后得到相應的兩種三元環(huán)肽。所得產(chǎn)物經(jīng)質譜表征均為m/z:1102.8(M²⁺)。