本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及合成肽及其在制備治療腦損傷藥物中的用途。

背景技術(shù)：

甘氨酸是化學結(jié)構(gòu)最簡單的氨基酸，但具有復雜的功能。甘氨酸在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在控制神經(jīng)元興奮性方面發(fā)揮重要作用。動物實驗發(fā)現(xiàn)甘氨酸具有明顯的神經(jīng)保護作用，并且在一些臨床試驗中也發(fā)現(xiàn)甘氨酸可明顯改善認知功能障礙和癡呆，尤其是可以作為一個常規(guī)的精神安定劑治療精神分裂癥。除此之外，甘氨酸還可以治療心臟損傷和腦卒中。

L-半胱氨酸是一種神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，也是一種具有神經(jīng)保護作用的抗氧化劑。同時，它也是腦內(nèi)谷胱甘肽的重要合成單位，合成的谷胱甘肽對于腦缺血再灌注損傷和帕金森病都有明顯的治療作用。

L-苯丙氨酸是人體必需氨基酸之一，屬芳香族氨基酸。已有研究表明，L-苯丙氨酸可作為抗癌藥物的載體將藥物分子直接導入癌瘤區(qū)，其效果是其他氨基酸的3～5倍。

盡管甘氨酸和半胱氨酸都有明顯的腦保護作用，但是外周給甘氨酸(800mg/kg)和半胱氨酸(500mg/kg)劑量過大，導致副反應嚴重，限制了它們的臨床應用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，提供了一類新的合成肽，它是由甘氨酸，半胱氨酸，苯丙氨酸和脯氨酸四種天然氨基酸為原料脫水縮合而成，在生物學上是有活性的，在診斷學上是有用的并具有治療腦損傷的作用。這些肽類特別穩(wěn)定并易透過血腦屏障，因此通過靜脈途徑給藥仍是有效的。

本發(fā)明的第一方面，提供了一種合成肽，其結(jié)構(gòu)特征，自N端至C端如下式I：

X1-X2-X3-(Gly-L-Cys)n-X4-X5-X6-X7(I)，式中，

X1是無或L-Phe

X2是無或Gly

X3是無或L-Pro

X4是無或Gly

X5是無或L-Pro

X6是無或Gly

X7是無或L-Phe

X3、X5不能同時為無；當X3為無時，X2也為無；當X5為無時，X6也為無；X1和X7不能同時為無；當X3和X5都為L-Pro時，n≤6；當X3或X5為L-Pro時，n≤8，n為Gly-L-Cys的排列在序列中的重復次數(shù)，該類合成肽中存在三種蛋白水解酶切割位點，一個是Gly與L-Cys的連接點,一個是Gly與L-Pro的連接點，一個是肽兩端L-Phe與任意氨基酸的連接點，蛋白水解酶切割后產(chǎn)生游離Gly和L-Cys作為藥物或藥理活性基團，L-Pro是疏水性氨基酸，促進合成肽穿透細胞膜，L-Phe作為穿透細胞膜的載體，可攜帶合成肽分子穿過血腦屏障，進入大腦。

本發(fā)明中氨基酸縮寫簡稱如下：

甘氨酸：Gly，G；L-半胱氨酸：L-Cys，C；L-苯丙氨酸：L-Phe，F(xiàn)；L-脯氨酸：L-Pro,P。

本發(fā)明中提到的Cys、Phe、Pro都是L型的。

在另一優(yōu)選例中，合成肽可以選自以下任意一種：

(a)NH₂-Gly-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Phe-COOH；

(b)NH₂-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-L-Phe-COOH；

(c)NH₂-L-Phe-Gly-L-Pro-Gly-L-Cys-COOH；

(d)NH₂-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-L-Phe-COOH；

(e)NH₂-L-Pro-(Gly-L-Cys)₄-Gly-L-Pro-L-Phe-COOH；

(f)NH₂-L-Phe-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-COOH；

(g)NH₂-L-Phe-Gly-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-Gly-COOH；

(h)NH₂-L-Phe-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-L-Phe-COOH；

(i)NH₂-L-Phe-Gly-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-L-Phe-COOH；

(j)NH₂-L-Phe-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-Gly-L-Phe-COOH；

(k)NH₂-L-Phe-Gly-L-Pro-Gly-L-Cys-Gly-L-Pro-Gly-L-Phe-COOH。

本發(fā)明的另一方面是提供該類合成肽在制備治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物中的應用。

優(yōu)選地，提供該類合成肽在制備治療缺血性腦卒中，出血性腦卒中，腦創(chuàng)傷，阿爾茨海默病，帕金森病及其他神經(jīng)退行性疾病藥物中的應用。

所述藥物為注射劑。

優(yōu)選地，該類合成肽用于治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病時采用靜脈注射的方式給藥。

本發(fā)明在具體實施例中提供通過固相合成制備本發(fā)明各類合成肽的方法。

為了確定本專利其它合成肽是否也有腦保護作用，我們建立了皮層神經(jīng)元離體糖氧剝奪(OGD)模型，神經(jīng)元在OGD損傷情況下，用500μM的各合成肽處理神經(jīng)元，用cck8去評價細胞的活力，從而判斷各合成肽對神經(jīng)元有無保護作用。由圖2可見，各合成肽均有保護作用，其中PGCF,P(GC)₄F,P(GC)₈F,FPGCF,GCGPF,GCGPGF,FGPGC合成肽對損傷神經(jīng)元具有明顯保護作用。

本發(fā)明用SD大鼠作為實驗對象，采用腦中動脈阻斷法(MCAo)制備腦缺血大鼠模型，缺血3小時后靜脈注射藥物，1小時后取腦，腦組織冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察腦片中熒光物質(zhì)強度。

采用靜脈注射FITC(異硫氰酸熒光素,紫外激發(fā)可發(fā)綠色熒光；8μmol/kg)標記大鼠腦神經(jīng)細胞，結(jié)果可見未缺血大鼠腦組織中未見熒光標記的神經(jīng)細胞；缺血大鼠腦組織中鏡下可見極少量FITC標記的綠色熒光神經(jīng)細胞；腦缺血后注射FITC-GC，鏡下也只觀察到極少量熒光細胞；腦缺血后注射FITC-GCF和FITC-PGCF(8μmol/kg),鏡下可見大量熒光標記的神經(jīng)細胞，并且后者比前者鏡下觀察到的熒光細胞數(shù)量更多，熒光信號更強(見附圖3)，表明Phe作為穿透細胞膜的載體，可攜帶GC穿透血腦屏障，進入大腦，并且Pro作為疏水性氨基酸，在大鼠缺血情況下，通過靜脈注射方式，進一步增加GCF透過血腦屏障的能力，使PGCF更高效的進入大腦。

為了說明PGCF通過靜脈注射方式透過血腦屏障進入大腦后，被蛋白水解酶水解為Gly和L-Cys，，使腦內(nèi)的Gly和L-Cys的水平上升，我們建立大鼠腦缺血模型，后隨即分為兩組，一組為對照組，缺血5h后靜脈注射生理鹽水；另一組為實驗組，靜脈注射13mg/kg PGCF,24h后取腦，用HPLC測定大鼠腦缺血損傷區(qū)Gly和L-Cys的含量。結(jié)果表明大鼠腦缺血后，靜脈給PGCF組，大鼠腦缺血區(qū)Gly和Cys的含量均高于缺血后給生理鹽水組，說明靜脈給缺血大鼠PGCF后，PGCF透過血腦屏障，進入大腦，水解生成Gly和L-Cys。(見附圖4)

本發(fā)明用SD大鼠作為實驗對象，靜脈注射給予PGCF(13mg/kg)、依達拉奉(臨床腦卒中治療藥物；6mg/kg)，采用MCAo腦缺血大鼠模型，缺血后5h，靜脈一次性注射上述藥物。24h后，處死動物，取腦，后TTC染色，梗死體積用([(VC－VL)/V C]表示,VC是對照半球體積，,VL是損傷半球非梗死體積)。

結(jié)果可見,注射生理鹽水的腦缺血大鼠，梗死體積0.325±0.021；給予13mg/kg PGCF，梗死體積0.031±0.012；注射6mg/kg依達拉奉，梗死體積為0.1551±0.03；相對于靜脈給生理鹽水和依達拉奉組，給PGCF四肽藥組有更低的梗死體積，并且有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(見表2，附圖5)。

總之，本發(fā)明有如下優(yōu)點：

(1)本發(fā)明提供的合成肽可以通過靜脈注射，以L-Phe為穿透細胞膜的載體，L-Pro是疏水性氨基酸，促進合成肽穿透細胞膜，透過血腦屏障，進入大腦，在腦內(nèi)蛋白水解酶的作用下水解生成游離的甘氨酸和半胱氨酸發(fā)揮神經(jīng)保護作用，減少腦的缺血灌注損傷，起到治療腦卒中的目的。此外，甘氨酸除可用于腦卒中治療外，還可明顯改善認知功能障礙和癡呆，尤其是可以作為一個常規(guī)的精神安定劑治療精神分裂癥。而L-半胱氨酸以及以它為基礎合成的谷胱甘肽作為一種強抗氧化劑，能明顯改善帕金森病患者的氧化應激損傷和腦缺血再灌注損傷。

(2)副作用?。罕景l(fā)明只需要13mg/kg的PGCF靜脈注射劑量，即可達到顯著的治療效果。

(3)安全：該合成肽的氨基酸殘基取自20種組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸，安全無毒。

(4)經(jīng)濟：該合成肽由固相合成而得，成本較低且便于質(zhì)量管理。

附圖說明

圖1為本專利四肽PGCF的HPLC圖譜以及質(zhì)譜圖；

圖2為合成肽對皮層神經(jīng)元存活的影響圖。

圖3為FITC標記的合成肽在大鼠腦缺血情況下，透過血腦屏障，進入大腦的示意圖。

圖4為HPLC色譜圖

A為空白的DNFB，B為Gly和L-Cys標準品，C為大鼠腦缺血側(cè)損傷區(qū)Gly和L-Cys的含量；峰1表示Gly的流出峰，峰2表示L-Cys的流出峰。

圖5為缺血大鼠注射各藥物后對大鼠腦梗死體積改變的示意圖。

具體實施方式

通過以下詳細說明結(jié)合附圖可以進一步理解本發(fā)明的特點和優(yōu)點。所提供的實施例僅是對本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

【實施例1】本專利以L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸三肽(PGCF)為例說明固相合成肽的制備過程如下：

一、復合物I Fmoc-L-Phe-樹脂的合成：

本專利三肽用固相合成的方法，稱取取代度為0.4mmol/g的2-氯三苯甲基氯樹脂(2-Chlorotrityl Chloride Resin)10.7g，將樹脂放入多肽反應管中，加入二氯甲烷(DCM)160.5ml,震蕩30分鐘；通過沙芯抽濾掉DCM溶劑，加入12mmol的Fmoc-L-Phe-OH氨基酸，再加入40mmol的N,N-二異丙基乙胺(DIEA)，最后加入少量二甲基甲酰胺(DMF)溶解，振蕩1h。用DMF和DCM交替清洗6遍。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘后抽掉哌啶溶液，從管中取反應后的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-L-Phe-OH與樹脂聯(lián)接成功，形成復合物I Fmoc-L-Phe-樹脂。

二、復合物II Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂的合成：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次；后在Fmoc-L-Phe-樹脂復合物上聯(lián)接第二個氨基酸，在反應管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Cys(Trt)-OH和12mmol苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸鹽(HBTU)，后立即加入N-甲基嗎啉(NMM)40mmol,反應30min，反應管分別用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘后抽掉哌啶溶液，從管中取反應后的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-Cys(Trt)-OH與Fmoc-L-Phe-樹脂聯(lián)接成功，形成新的復合物II Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂。

三、復合物III Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂的合成：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次；后在Fmoc-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂上聯(lián)接第三個氨基酸，在反應管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-Gly-OH和12mmolHBTU，后立即加入N-甲基嗎啉(NMM)40mmol,反應30min，反應管分別用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘后抽掉哌啶溶液，從管中取反應后的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-Gly-OH與復合物II聯(lián)接成功，形成新的復合物III Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂。

四、復合物IV Fmoc-L-Pro-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂的合成：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次；后在Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂上聯(lián)接第四個氨基酸，在反應管中加入少量用DMF溶解的12mmolFmoc-L-Pro-OH和12mmolHBTU，后立即加入N-甲基嗎啉(NMM)40mmol,反應30min，反應管分別用160.5ml DMF洗一次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次。加160.5ml20％哌啶(哌啶溶解在DMF溶液中)，5分鐘后抽掉哌啶，再次加入160.5ml20％哌啶，等15分鐘后抽掉哌啶溶液，從管中取反應后的樹脂十幾粒，用乙醇洗三次，加入茚三酮，氰化鉀溶液，苯酚溶液各一滴，105℃－110℃加熱5min,變深藍色為陽性反應，說明Fmoc-L-Pro-OH與復合物III Fmoc-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂聯(lián)接成功，形成新的復合物IV Fmoc-L-Pro-Gly-Cys(Trt)-L-Phe-樹脂。

五、得到粗品肽：

多肽反應管分別用160.5ml DMF洗兩次，160.5ml甲醇洗兩次，160.5ml DMF再洗兩次,抽干10min,配制切割液107ml,配方分別是TFA(三氟乙酸)94.5％；水2.5％；EDT(1,2-乙二硫醇)2.5％；TIS(三異丙基硅烷)1％,將樹脂裝入燒瓶或者離心管中，倒入切割液，恒溫震蕩2h,將切割液用氮氣盡量吹干，乙醚層析，再用乙醚洗6次，然后常溫揮干，得到1.2g粗品肽Pro-Gly-Cys-Phe。

五、純化粗品肽Pro-Gly-Cys-Phe

儀器：LC3000型高效液相色譜儀

柱子：Gemini-NX C18 10um 120A 4.6*250mm

流動相A:0.1％TFA in 100％Acetonitrile

流動相B:0.1％TFA in 100％Water

梯度： A B

0.01min 2％ 98％

25min 10％ 90％

30min 100％ 0％

根據(jù)上述純化條件，將粗品肽(1.2g),進入到HPLC內(nèi)(每次進樣100mg),進行分離純化，收集主峰餾分，放凍干機上凍干(48h),最后得到98％以上的純品600mg。

圖1A L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸(簡稱PGCF)四肽的HPLC圖譜以及質(zhì)譜圖，HPLC圖中可見該四肽純度為99.39％；質(zhì)譜圖結(jié)果可見，圖1B,[M+H]⁺423.1，因此該物質(zhì)分子量為422.1，與L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸四肽理論分子量相符。

采用同樣的固相合成的方法，本實驗室合成了本專利實施例中其它合成肽。

【實施例2】本專利合成肽對原代皮層神經(jīng)元的細胞毒性試驗

本實施例用培養(yǎng)10天的原代皮層神經(jīng)元作為實驗對象，建立了皮層神經(jīng)元離體糖氧剝奪(OGD)模型，神經(jīng)元在OGD損傷情況下，用500μM的各合成肽處理神經(jīng)元，用cck8去評價細胞的活力，從而判斷各合成肽對神經(jīng)元有無保護作用。本實施例所用合成肽如下：

一、主要實驗試劑和儀器

實驗中各合成肽均由本實驗室自主合成；Neurobasal,由Gibco公司提供；B27，Gibco公司提供；FBS,由invitrogen公司提供；glutamax,invitrogen公司提供；Glutamic acid,由sigma公司提供；多聚賴氨酸，由sigma公司提供。培養(yǎng)箱，來自于SANYO公司，培養(yǎng)條件是37℃,5％CO2；酶標儀,美國Bio-Tek公司；CCK8試劑盒，日本同仁化學；其余部分試劑全為國藥集團化學試劑有限公司提供的分析純試劑。

二、主要溶液的配制

1、HBSS:Hank，S平衡液：NaCl 8.0g,KCl 0.4g,Glucose 1.0g,KH2PO4 0.06g,Na2HPO4 0.06g,加雙蒸水溶解，用NaHCO3調(diào)PH至7.3，定容到1000ml.

2、分離液：HBSS 500ml,Hepes 1.78g,Sucrose 2.5g,Glucose 10.0g,PH調(diào)至7.4，最后加入200ml雙蒸水，4度保存。

3、ECS溶液：NaCl 8.01g,CaCl₂ 0.222g,KCl 0.4g,MgCl₂ 0.095g,HEPES2.98g,Glucose 3.27g,加雙蒸水溶解，PH7.4，定容至1000ml,用0.22um的濾膜過濾除菌。

無糖ECS溶液：NaCl 8.01g,CaCl₂ 0.222g,KCl 0.4g,MgCl₂ 0.095g,HEPES2.98g,加雙蒸水溶解，PH7.4，定容至1000ml,用0.22um的濾膜過濾除菌。

4、Glutamic acid儲備液(11.8mM):稱0.1736g的谷氨酸用雙蒸水溶解，NaOH調(diào)PH至7.0，定量到100ml,分裝1060μl/tube,貯存在4度。

5、0.5％FBS培養(yǎng)基：B27取1ml,FBS 250ul,glutamax 500ul,glutamic acid106μl,用neurobasal定量到50ml,4度保存。

6、無FBS培養(yǎng)基：B27取1ml,glutamax 500μl,用neurobasal定量到50ml，4度保存。

7、0.15M硼酸鹽緩沖液：稱取28.6g的硼砂，用雙蒸水溶解，攪拌3-5min,用HCl調(diào)PH至8.4，定容到500ml。

8、多聚賴氨酸：把5mg的多聚賴氨酸固體溶解到500ml的硼酸鹽緩沖液中，過濾除菌，-20℃保存。

三、實驗動物

動物SPF級ICR雌性小鼠，體重25-30g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為No.42000500006525，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2014-0004。

四、實驗原理

cck8的原理：該試劑中含有WST-8(化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽)，它在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物(Formazan)。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。

五、實驗方法

神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：培養(yǎng)前一天晚上用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)皿，過夜；第二天早上取出已包被的多聚賴氨酸，接種前用PBS洗2-3遍。取懷孕17-18d的ICR雌性小鼠，頸椎脫臼處死后，取胎鼠大腦，置于分離液中，打開顱腔后取出全腦置于另一盛有分離液的玻璃培養(yǎng)皿中，在解剖鏡下分離剝離腦膜，取大腦皮層置另一盛有分離液的玻璃小皿中；用眼科鑷夾碎皮層組織成1mm³大小，吸管吸取組織置一15ml的離心管中，靜置幾秒，讓組織沉淀下來，棄去分離液，加入1-2ml的0.5％FBS培養(yǎng)基，用吸管吹打20-30次，液體變渾濁停止，然后再靜置10-20秒，使大的組織塊下沉，取上清用濾網(wǎng)過濾，過濾后的液體先數(shù)細胞，以4*10⁵/ml的細胞密度把細胞接種到已包被的皿中。第二天從各皿中棄一半體積的培養(yǎng)基，換成無FBS的培養(yǎng)基，之后，每三天換一次全培養(yǎng)基，換的都是無FBS的培養(yǎng)基。

細胞處理過程：取培養(yǎng)10天的96孔板的原代神經(jīng)元，簡單分為三組，分別是Control,OGD,OGD+各合成肽組，合成肽濃度都為500μM,每組重復5個復孔，每個孔先用PBS洗2-3遍，control組加入ECS,放入含5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)37°C繼續(xù)培養(yǎng)1h,OGD組加入無糖ECS,放入95％N₂/5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)1h，后control組換新的ECS繼續(xù)培養(yǎng)12h,而OGD組換新的ECS后轉(zhuǎn)入含5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)12h，其他OGD+合成肽組加入各合成肽藥物(肽溶解在ECS中)也轉(zhuǎn)入含5％CO₂的培養(yǎng)箱內(nèi)37℃繼續(xù)培養(yǎng)12h，每孔加入CCK8 10μl,2h后在450nm處測吸光值。

六、實驗結(jié)果

結(jié)果見圖2，神經(jīng)元在OGD損傷情況下，用500μM的各合成肽處理神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)各合成肽均有保護作用，其中PGCF,P(GC)₄F,P(GC)₈F,FPGCF,GCGPF,GCGPGF,FGPGC合成肽對損傷神經(jīng)元具有明顯保護作用。

【實施例3】建立大鼠腦缺血模型，靜脈注射熒光標記的合成肽,從整體上觀察合成肽透過血腦屏障的能力

一、實驗主要試劑及儀器

FITC,武漢明皓生物科技股份有限公司；FITC-GC，F(xiàn)ITC-GCF，F(xiàn)ITC-PGCF,武漢明皓生物科技股份有限公司；OCT膠，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；病理組織切片機，德國Leitz,1512型；熒光顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；多聚甲醛，國藥集團化學試劑有限公司。

二、實驗原理

FITC(異硫氰酸熒光素):為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm,最大發(fā)射光波長為520～530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，是目前應用最廣泛的熒光素。

FITC-PGCF:就是PGCF進行熒光標記，F(xiàn)ITC與PGCF四肽結(jié)合，結(jié)合后不影響PGCF四肽的結(jié)構(gòu)和功能，通過在熒光顯微鏡下觀察，具有強烈的黃綠色熒光，可用于PGCF的定位或定量的檢測。

血腦屏障(Blood Brain Barrier)：指腦毛細血管壁與神經(jīng)膠質(zhì)細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止某些物質(zhì)(多半是有害的)由血液進入腦組織，維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常的生理狀態(tài)。但是，由于許多治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物難以透過血腦屏障，限制了它們在臨床上的應用。

三、實驗結(jié)果

結(jié)果可見圖3，Control為正常動物靜脈注射FITC組，切片后鏡下觀察，無熒光標記的神經(jīng)細胞；缺血后靜脈注射FITC 8μmol/kg組，鏡下可觀察到有極少量熒光標記的神經(jīng)細胞；腦缺血后靜脈注射FITC-GC 8μmol/kg的大鼠,鏡下也只觀察到極少量熒光標記的細胞；腦缺血后靜脈注射FITC-GCF和FITC-PGCF8μmol/kg的大鼠,鏡下可觀察到大量綠色熒光的神經(jīng)細胞，并且后者比前者鏡下觀察到的熒光細胞數(shù)量更多，熒光信號更強(見附圖3)，表明Phe作為穿透細胞膜的載體，可攜帶GC穿透血腦屏障，進入大腦，并且Pro作為疏水性氨基酸，在大鼠缺血情況下，通過靜脈注射方式，進一步增加GCF透過血腦屏障的能力，使PGCF更高效的進入大腦。

【實施例4】建立大鼠腦缺血模型，靜脈注射PGCF后檢測腦內(nèi)甘氨酸和半胱氨酸的水平

一、實驗儀器及試劑

美國Agilent1100高效液相色譜儀，UV檢測器及色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Gly,Cys標準品(美國sigma公司)；2,4-二硝基氟苯(成都西亞試劑有限公司)；乙腈，甲醇(色譜級，國藥集團化學試劑有限公司)；超純水；其余試劑均為分析純。

二、實驗方法

氨基酸標準品儲備液的配制精密稱取Gly,Cys標準品各10mg,置于10ml容量瓶中，用甲醇/水(1:1)溶解并稀釋至刻度，使配成濃度為1mg/ml的儲備液。

衍生化試劑的配制DNFB用乙腈配成0.5％的溶液，避光保存。

樣品預處理和衍生化建立大鼠腦缺血模型，后隨即分為兩組，一組為對照組，缺血5h后靜脈注射生理鹽水；另一組為實驗組，靜脈注射13mg/kgPGCF,24h后取腦，在冰上分離大鼠缺血腦損傷區(qū)，用生理鹽水制備組織勻漿，15000rpm，4度離心20min，取上清，一部分測BCA,另一部分再加入兩倍體積甲醇,15000rpm，4度離心10min,除去蛋白，所得上清液即用來測定甘氨酸和半胱氨酸的含量。

色譜條件色譜柱：大連依利特Hypersil BDS C18(4.6×200mm,5μm)；流動相:A為0.05mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH＝6.5),B為乙腈-水(1:1,V/V),梯度洗脫程序B由初始時的16％經(jīng)10min增至45％,25min至85％，30min至16％；流速:1mL/min；檢測波長:360nm；柱溫:30℃，取30μL進樣分析。該色譜條件下，甘氨酸和半胱氨酸在30min內(nèi)得到有效分離，保留時間為：Gly(10.27min),L-Cys(23.77min)所得色譜圖見圖4。

線性關(guān)系精密量取Gly和Cys混合標準儲備液，用甲醇/水(1:1)將儲備液分別稀釋成0.1,1,4,10,40,200ug/ml的對照液。衍生后各取30ul進樣，以上述色譜條件進行測定，以峰面積(Y)與標準品濃度(X)進行線性回歸。結(jié)果表明，Gly和Cys在0.1～200ug/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)Gly為0.9995，Cys為0.9991。

三、實驗結(jié)果

樣品測定大鼠腦缺血損傷區(qū)Gly和Cys的含量測定結(jié)果見表1。

表1大鼠腦缺血損傷區(qū)Gly和Cys的含量

與模型組相比，^**P<0.01，^#P<0.05

大鼠腦缺血后，靜脈給PGCF組，大鼠腦缺血損傷區(qū)Gly和Cys的含量均高于缺血后給生理鹽水組，說明靜脈給缺血大鼠PGCF后，PGCF透過血腦屏障，進入大腦，水解生成Gly和Cys。

【實施例5】建立大鼠腦缺血模型，確定PGCF對腦缺血后的保護作用

一、實驗藥品及試劑

PGCF,由本實驗自主合成；水合氯醛，國藥集團化學試劑有限公司；TTC,武漢科瑞生物技術(shù)有限公司提供；無菌生理鹽水，武漢濱湖雙鶴藥業(yè)有限責任公司；肝素鈉注射液，南京新百藥業(yè)有限公司提供；依達拉奉注射液，國藥集團國瑞藥業(yè)有限公司，30mg/一支。

二、實驗動物

動物SPF級SD雄性大鼠，體重240-260g。武漢大學動物實驗中心提供，動物合格證號為NO.42000500006247，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2014-0004。鼠飼料，購于武漢大學實驗動物中心。

三、實驗方法

240-260g的大鼠隨機分組：假手術(shù)組，缺血組，缺血加藥組，假手術(shù)組和缺血組靜脈都給400μl的生理鹽水，缺血加藥組的藥物濃度分別是PGCF組13mg/kg,依達拉奉組6mg/kg,藥物均溶解在400μl生理鹽水中，缺血5h后靜脈一次性給予。

動物給藥方式的選擇：動物的外周給藥方式主要有三種，分別是口服，腹腔注射和靜脈注射。傳統(tǒng)口服藥物和腹腔注射藥物，藥物都需要先由腸道吸收后進入血液，藥物在吸收過程中需要一定的時間并且會有一定程度的損耗，進入血液中的藥物就少了。而靜脈注射藥物相對于傳統(tǒng)給藥方式，藥物是直接進入血液，血液中藥物濃度100％，并且直接發(fā)揮作用。在藥物的有效濃度范圍內(nèi)，選擇靜脈給藥所需的藥物濃度更低，作用時間更短，副作用小，因此本實驗選擇靜脈給藥。

大腦中動脈栓塞(MCAO)模型的制備：首先采用10％的水合氯醛根據(jù)動物體重(0.035ml/kg)進行腹腔注射麻醉，麻醉成功后用改良的線栓法制備大腦中動脈缺血模型。選擇與SD大鼠體重匹配的線栓，術(shù)前先侵泡在盛有肝素的EP管中。在頸外動脈遠心端剪一小口后，將前端有圓頭的線栓從小口處，調(diào)整方向后插入頸內(nèi)動脈，線栓插入深度為線栓頭端到黑色標記處，長約17-19mm。栓塞90min后，再小心將線栓撥出?？p好皮膚，涂抹絡合碘，術(shù)后放置在電熱毯上，對SD大鼠進行保溫處理。

假手術(shù)建模：進行缺血手術(shù)操作，線栓從頸外動脈插入頸內(nèi)動脈后迅速拔出不留置線栓。

檢測指標采用Zea Longa方法進行神經(jīng)功能缺失評分：

0分，沒有任何神經(jīng)功能缺失；

1分，明顯可見SD大鼠左前肢內(nèi)收，前爪不能外展；

2分，明顯可見SD大鼠向左側(cè)未缺血側(cè)成追尾狀地轉(zhuǎn)圈；

3分，明顯可見SD大鼠向左側(cè)未缺血側(cè)成傾倒狀；

4分，明顯可見SD大鼠的意識障礙，無自主行走。

該檢測指標用于評價SD大鼠MCAO缺血模型是否成功，缺血動物選擇1-2分作為實驗動物。

另一指標為TTC染色：TTC染料參與正常組織中的琥珀酸脫氫反應呈紅色。缺血組織內(nèi)蛋白變性壞死，脫氫酶活性顯著下降，無法發(fā)生琥珀酸脫氫反應，因此不呈現(xiàn)紅色而呈白色。TTC染色可以檢測哺乳動物組織的缺血梗死程度。

染色步驟如下：

1.冰上快速提取完整的腦組織放入一次性細胞培養(yǎng)皿中。

2.將組織放入-20℃冰箱中20min。

3.將組織放在室溫中數(shù)秒，等待腦組織的硬度稍微變軟

4.用刀片在冠狀面截取8等分的腦片，每片2mm。

5.將TTC染料倒入培養(yǎng)皿中，使腦片懸浮在液體中，腦片上表面和下表面都需接觸TTC液體。

6.放入37℃恒溫箱中15min-20min(避光)。

7.取出后傾倒染料，用生理鹽水漂洗后換上4％PFA 4℃固定過夜。

8.第二天取出用掃瞄儀進行數(shù)據(jù)圖像采集并采用ImageJ軟件分析梗死體積(梗死體積＝[(VC－VL)/V C],VC是對照半球體積，,VL是損傷半球非梗死體積)。

四、實驗結(jié)果

結(jié)果可見圖5，未給藥的腦缺血組，梗死體積為0.325±0.021；靜脈注射PGCF 13mg/kg的缺血大鼠，梗死體積是0.031±0.012；靜脈注射6mg/kg依達拉奉，梗死體積為0.1551±0.03；相對于靜脈給生理鹽水，依達拉奉組，給PGCF四肽藥組有更低的梗死體積，并且有統(tǒng)計學意義(p<0.01)。結(jié)果表明PGCF四肽可改善腦卒中，且作用明顯優(yōu)于臨床用藥依達拉奉(見表2，附圖5)。

表2合成肽對缺血大鼠的保護作用及與依達拉奉的比較

與模型組相比，**P<0.01，*P<0.05。

【實施例6】L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸四肽注射液制備

L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸四肽注射液，100g L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸四肽凍干粉分裝到1000個已滅菌的管制凍干瓶中，真空封瓶，儲存于-20或-80℃，每瓶含L-脯氨酸-甘氨酸-L-半胱氨酸-L-苯丙氨酸四肽100mg,用氯化鈉注射液或5％葡萄糖溶解,靜脈緩慢滴注。