本發(fā)明涉及一種帕西瑞肽五肽中間體的液相合成方法，以及該關(guān)鍵中間體在制備帕西瑞肽中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
帕西瑞肽是由諾華公司(Novartis)研制，2012年4月獲得歐洲委員會的上市批準(zhǔn)，同年12月獲得美國FDA的上市批準(zhǔn)，其結(jié)構(gòu)如下(Ⅱ)所示，是一種可注射的環(huán)六肽生長抑素類似物，它通過與生長抑素受體(ssts)結(jié)合發(fā)揮其藥理學(xué)活性，用于無法手術(shù)或手術(shù)治療失敗的成人庫欣病(Cushing’s disease)患者的治療，是首個用于治療庫欣氏病的孤兒藥。
目前帕西瑞肽的合成多采用固相合成方法，例如按標(biāo)準(zhǔn)的Fmoc/tBu策略，以SASRIN Resin為起始樹脂，固相縮合得到{(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)}Pro}-Phg-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Tyr(4-Bzl)-Phe或者Lys(Boc)-D-Trp(Boc)-Phg-{(4-Boc-NH-C2H4-NH-CO-O)Pro}-Phe-Tyr(4-Bzl)，最后液相環(huán)化，TFA裂解得到目標(biāo)產(chǎn)物帕西瑞肽粗肽，再進行HPLC純化得到合格的帕西瑞肽精肽。相似固相合成方法見專利CN103467575A、WO2005014624、US20060258838A1、EP1654280B1等。固相合成方法存在這樣幾個問題：制備量少、設(shè)備復(fù)雜、需要使用大量的樹脂和洗滌溶劑等。Novartis公司報道的液相合成方法采用直線式合成路線，具有效率低，總產(chǎn)率不高等缺點。
本發(fā)明使用液相合成法制備帕西瑞肽五肽中間體(結(jié)構(gòu)Ⅰ)，采用匯聚式合成路線，節(jié)省時間，總產(chǎn)率高。其中使用BSA作為賴氨酸羧基部分的保護基，使得 氨基酸在接肽過程中，產(chǎn)率高，易處理，利于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明解決的技術(shù)問題在于提供一種帕西瑞肽五肽中間體的液相合成方法，進而實現(xiàn)帕西瑞肽的液相合成，解決目前采用固相合成法成本高，反應(yīng)不易檢測，不適宜大規(guī)?；a(chǎn)等問題。
為解決本發(fā)明的技術(shù)問題，提供如下技術(shù)方案：
帕西瑞肽五肽中間體的液相合成方法：
a.以N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸為原料，BSA保護其羧基，再與N端保護的D-色氨酸活性酯連接，得到N-芐氧羰基-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸，再于氫解條件下脫去N端保護基得到D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸；
b.以D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸為原料，使用BSA保護賴氨酸的羧基部分，再與N端保護的苯甘氨酸活性酯連接，制得N-(9-芴甲氧羰基)-苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸；
c.以苯丙氨酸酯為原料，與N端保護的O-芐基酪氨酸的活性酯連接，制得N-叔丁氧羰基-O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯，再于酸性條件下脫去N端保護基得到O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯；
d.以N-(9-芴甲氧羰基)-苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸為原料，與O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯在TBTU作用下縮合得到N-(9-芴甲氧羰基)-苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸-O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯，再于堿性條件下脫去N端保護基得到苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸-O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯；
合成路線如下：
其中，R＝C1-6烷氧基，優(yōu)選OCH3，OC2H5，OC(CH3)3，
R1＝OSu、ONb、OBt、OOBt、OAt。
其中，步驟a、b、c所述的氨基酸活性酯，包括N-羥基琥珀酰亞胺酯、N-羥基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亞胺酯、1-羥基苯駢三氮唑酯、3-羥基-4-氧-3,4-二氫-1,2,3-苯駢三氮唑酯、1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑酯。
其中，步驟c所述的酸性條件，優(yōu)選的酸選自包括三氟乙酸、鹽酸、氫氟酸，所用溶劑包括二氯甲烷、四氫呋喃、1,4-二氧六環(huán)。
其中，步驟d所述的堿性條件，優(yōu)選的堿選自哌啶、濃氨水、乙二胺、乙醇胺、環(huán)己胺、1,4-氮氧六環(huán)、吡咯烷酮、DBU、氫氧化鈉、氫氧化鋰；所用溶劑包括二 氯甲烷、四氫呋喃，1,4-二氧六環(huán)。
本發(fā)明最優(yōu)選的制備方法，其步驟如下：
(1)制備D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸
將BSA和N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸加到無水N，N-二甲基甲酰胺中，10～35℃下攪拌1～2h，滴入N-芐氧羰基-D-色氨酸-(N-羥基)琥珀酰亞胺酯的二氯甲烷溶液，10～35℃下反應(yīng)6-9h，減壓蒸除二氯甲烷，加入乙酸乙酯，水洗除去N,N-二甲基甲酰胺，減壓蒸除乙酸乙酯，加乙醚，用5％的碳酸氫鈉水溶液萃??；合并水相，加入檸檬酸調(diào)至pH5～7，用乙酸乙酯萃取，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，得淡黃色泡沫狀固體；將淡黃色固體加之無水甲醇中，10～35℃下加入10％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的5％鈀碳，通入氫氣，反應(yīng)4～7h，過濾得淡黃色溶液，蒸干溶劑，加入5％的碳酸氫鈉水溶液溶解，檸檬酸調(diào)節(jié)pH＝6-8，有白色固體析出，過濾，干燥得白色固體。
(2)制備N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸
將BSA和D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸加入到無水四氫呋喃中，10～35℃下攪拌1-2h，滴入N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-(N-羥基)琥珀酰亞胺酯的四氫呋喃溶液，10～35℃下反應(yīng)6-9h，減壓蒸除四氫呋喃，加入乙醚，用5％的碳酸氫鈉水溶液萃??；合并水相，加入檸檬酸調(diào)至pH5～7，用乙酸乙酯萃?。缓喜⒂袡C相，用飽和食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，無水甲醇重結(jié)晶，得白色固體。
(3)制備O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯
將苯丙氨酸酯鹽酸鹽溶于無水四氫呋喃中，控溫于5℃，滴入三乙胺，隨后滴入N-叔丁氧羰基-O-芐基酪氨酸-(N-羥基)琥珀酰亞胺酯的四氫呋喃溶液，10～35℃下反應(yīng)4-6h，減壓蒸除四氫呋喃，加入乙酸乙酯，分別經(jīng)5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，5％檸檬酸水溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌；有機相經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，得到白色固體；所得白色固體加至無水二氯甲烷中，0～5℃下攪拌滴加三氟乙酸至VCH2Cl2：VCF3COOH＝1～5:1，10～35℃下攪拌反應(yīng)2～5h，減壓濃縮至干，乙醚重結(jié)晶，得到白色固體。
(4)制備苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸-O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯
將N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸和O-芐基 酪氨酸-苯丙氨酸酯溶于無水四氫呋喃中，0～5℃下加入O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和N-甲基嗎啡啉，10～35℃下反應(yīng)4-8h，減壓蒸除四氫呋喃，加入乙酸乙酯，經(jīng)5％碳酸氫鈉水溶液洗滌，5％檸檬酸水溶液洗滌，飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮至干，甲醇重結(jié)晶；所得白色固體加至四氫呋喃中，0～5℃下滴加哌啶，10～35℃下反應(yīng)2-4h，減壓蒸除溶劑，加入甲醇重結(jié)晶，得到白色固體。
按照本發(fā)明提供的制備方法制備的五肽中間體在制備帕西瑞肽中的應(yīng)用，五肽中間體與(Boc-NHCH2CH2NHCO)Hyp(Fmoc)-OH在縮合劑TBTU作用下進行縮合反應(yīng)，再于HATU，HOBt作用下進行分子內(nèi)縮合，得到的產(chǎn)物經(jīng)酸脫除N端保護基叔丁氧羰基，得到帕西瑞肽。
有益技術(shù)效果：
1、本發(fā)明制備方法中步驟a和b，采用BSA作為賴氨酸羧基的保護基，具有如下優(yōu)點(1)與氨基酸反應(yīng)迅速且完全；(2)由于是中性硅烷化試劑，故不改變反應(yīng)體系中的酸堿性；(3)此保護基易于脫去，加入水即可分解且副產(chǎn)物溶于水，易與主產(chǎn)物進行分離；(4)BSA來源廣泛，價格便宜，常用于工業(yè)生產(chǎn)。
2、本發(fā)明采用3+2匯聚式合成策略，首先分別合成N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸、O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸酯兩個片段，然后3+2匯聚合成目標(biāo)產(chǎn)物帕西瑞肽五肽中間體，總產(chǎn)率高(23.6％)，且可以分頭并進，縮短路線時長。
3、本發(fā)明采用液相合成法，所需設(shè)備簡單，與固相合成法相比，具有很多優(yōu)點：(1)不需要樹脂和大大過量的保護氨基酸及縮合劑；(2)不需要大量的洗滌溶劑；(3)反應(yīng)易于監(jiān)測；(4)易于實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，大大降低生產(chǎn)成本。
術(shù)語和簡稱
Boc：叔丁氧羰基
Cbz：芐氧羰基
Fmoc：9-芴甲氧羰基
BSA：N,O-雙(三甲基硅基)乙酰胺
NMM：N-甲基嗎啉
DCC：N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺
TBTU：O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸
HATU：2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt：1-羥基苯并三唑
HOSu：N-羥基琥珀酰亞胺
HONb：N-羥基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亞胺
HOOBt：3-羥基-4-氧-3,4-二氫-1,2,3-苯駢三氮唑
HOAt：1-羥基-7-偶氮苯并三氮唑
DBU：1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯
TFA：三氟乙酸
THF：四氫呋喃
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
H-N(γ)-Boc-L-Lys-OH：N(γ)-叔丁氧羰基-L-賴氨酸
Cbz-D-Trp-OH：芐氧羰基-D-色氨酸
Boc-L-Tyr(Bzl)-OH：叔丁氧羰基-O-芐基-L-酪氨酸
H-L-Phe-OR：L-苯丙氨酸酯
Fmoc-Hyp-OH：9-芴甲氧羰基-反式-4-羥基-L-脯氨酸
具體實施方式
下面結(jié)合具體的實施例來對本發(fā)明進行闡述。
制備例
制備例1 N-芐氧羰基-D-色氨酸-(N-羥基)琥珀酰亞胺酯(a)
N-芐氧羰基-D-色氨酸(7.0g，20.7mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(2.4g，20.7mmol)加至無水THF(80ml)中，室溫下攪拌。控溫于5℃左右，緩慢滴入DCC(4.3g，20.9mmol)的THF(20ml)溶液。室溫攪拌24h，多次過濾，濾液減壓濃縮至干。所得黃色油狀物，用異丙醇重結(jié)晶，得類白色固體7.6g，收率84.6％。1HNMR(400MHz,DMSO)δ10.94(s,1H),8.14(d,J＝8.2Hz,1H),7.56(d,J＝7.9Hz,1H),7.31(ddd,J＝24.4,17.1,8.5Hz,5H),7.09(t,J＝7.2Hz,1H),7.00(t,J＝7.2Hz,1H),4.99(q,J＝12.6Hz,2H),4.72-4.59(m,1H),3.35(dd,J＝14.6,4.7Hz,1H),3.17(dd,J＝14.6,9.9Hz,1H),2.80(d,J＝31.4Hz,4H)
制備例2 N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-(N-羥基)琥珀酰亞胺酯(b)
N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸(10g，26.8mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(3.1g，26.8mmol)加至無水THF(100ml)中，室溫下攪拌?？販赜?℃左右，緩慢滴入DCC(5.6g，27.1mmol)的THF(20ml)溶液，室溫攪拌24h。多次過濾，濾液減壓濃縮至干，加入乙酸乙酯重結(jié)晶，得到白色固體11.2g，收率89.2％。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ7.76(d,J＝7.3Hz,2H),7.64-7.53(m,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.31(t,J＝7.4Hz,2H),5.79(s,1H),4.54(m,J＝8.1Hz,1H),4.45-4.40(m,1H),4.39-4.23(m,1H),2.81(s,4H)
制備例3 N-叔丁氧羰基-O-芐基-酪氨酸-(N-羥基)琥珀酰亞胺酯(c)
N-叔丁氧羰基-O-芐基-酪氨酸(7.4g，19.9mmol)和N-羥基琥珀酰亞胺(2.3g,19.9mmol)加至無水THF(80ml)中，室溫下攪拌?？販赜?℃左右，緩慢滴入DCC(4.1g，20.1mmol)的THF(20ml)溶液，室溫攪拌5h。多次過濾，濾液減壓濃縮至干，加入乙酸乙酯重結(jié)晶，得到白色固體8.5g，收率91.0％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47-7.29(m,4H),7.20(d,J＝8.1Hz,2H),6.93(d,J＝8.1Hz,2H),5.04(s,2H),4.89(d,J＝12.6Hz,1H),3.31-3.06(m,2H),2.85(s,4H),1.42(s,9H)
實施例
實施例1 帕西瑞肽五肽中間體的液相合成方法
a:D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸(2)的制備
步驟1 N-芐氧羰基-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸(1)
BSA(9.1g，44.9mmol)和N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸(5g，20.3mmol)加到無水DMF(50ml)中，室溫下攪拌4h，滴入化合物a(8.8g，20.3mmol)的二氯甲烷(50ml)溶液，室溫下攪拌，反應(yīng)6h，減壓蒸除二氯甲烷，加入乙酸乙酯(150ml)，水(100ml×3)洗除去DMF，減壓蒸除乙酸乙酯，加乙醚(50ml)，用5％的碳酸氫鈉水溶液(50ml×3)萃取；合并水相，加入檸檬酸調(diào)至pH＝6，用乙酸乙酯(100ml×3)萃取，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，得淡黃色泡沫狀固體6.3g，收率55.2％。ESI-MS(m/z)：566.32[M+H]+； 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.64(s,1H),10.79(s,1H),8.24(d,J＝7.9Hz,1H),7.66(d,J＝7.9Hz,1H),7.40-7.21(m,6H),7.15(s,1H),7.05(t,J＝7.5Hz,1H),6.96(t,J＝7.5Hz,1H),6.74(t,J＝5.7Hz,1H),4.94(s,2H),4.38(td,J＝9.1,5.0Hz,1H),4.15(q,J＝7.6Hz,1H),3.07(dd,J＝14.5,5.0Hz,1H),2.95-2.89(m,1H),2.84(t,J＝6.7Hz,2H),1.70-1.59(m,1H),1.58-1.46(m,1H),1.38-1.33(m,9H),1.16(q,J＝8.3,7.8Hz,2H)
步驟2 D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸(2)
化合物1(5g，8.8mmol)和鈀碳(0.5g，10％)加至無水甲醇(50ml)中，通入氫氣，室溫下攪拌5h，過濾得淡黃色溶液，蒸干溶劑，加入5％的碳酸氫鈉水溶液(30ml)溶解，檸檬酸調(diào)節(jié)pH＝6，有白色固體析出，過濾，干燥得白色固體3.6g，收率93.5％。ESI-MS(m/z)：432.82[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.64(s,1H),10.87(s,1H),8.07(s,1H),7.59(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),7.18(t,J＝7.4Hz,1H),7.06(t,J＝7.1Hz,1H),6.98(t,J＝7.4Hz,1H),6.73(s,1H),4.03(s,1H),3.74(dd,J＝6.9Hz,1H),3.12(dd,J＝14.4,5.9Hz,1H),2.88-2.78(m,3H),1.65-1.52(m,1H),1.52-1.41(m,1H),1.35(s,9H),1.31-1.23(m,2H),1.12-0.97(m,2H)
b:N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)-叔丁氧羰基賴氨酸(3)的制備
BSA(3.7g，18.3mmol)和化合物2(3.6g，8.3mmol)溶于無水THF(30ml)中，室溫攪拌2h，滴入化合物b(3.9g，8.3mmol)的THF(20ml)溶液，室溫下反應(yīng)7h，減壓濃縮至干，加入乙醚(50ml)，用5％的碳酸氫鈉溶液(50ml×3)萃??；合并水相，加入檸檬酸調(diào)節(jié)pH＝6，乙酸乙酯萃取(100ml×3)，合并有機相，用飽和食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，無水甲醇重結(jié)晶，得類白色固體3.7g，收率56.2％。ESI-MS(m/z)：788.27[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ12.53(s,1H),10.68(d,J＝2.4Hz,1H),8.50(d,J＝8.1Hz,1H),8.25(d,J＝7.8Hz,1H),8.02(d,J＝8.5Hz,1H),7.86(d,J＝7.5Hz,2H),7.75(dd,J＝11.3,7.6Hz,2H),7.55(d,J＝7.9Hz,1H),7.39(td,J＝7.4,3.0Hz,2H),7.31-7.17(m,7H),7.01(t,J＝7.4Hz,1H),6.91(s,1H),6.71(t,J＝5.8Hz,1H),5.36(d,J＝8.4Hz,1H),4.57(q,J＝8.1Hz,1H),4.22(dd,J＝13.5,7.1Hz,2H),3.04(dd,J＝14.5,5.2Hz,1H),2.88(d,J＝9.8Hz,1H),2.82(q,J＝6.7,6.1Hz,2H),1.58(s,1H),1.49(t,J＝7.5Hz,1H),1.33(s,9H),1.26(q,J＝7.2Hz,2H),1.09(dt,J＝13.9,7.6Hz,2H).
c:O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸甲酯(5)的制備
步驟1 N-叔丁氧羰基-O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸甲酯(4)
苯丙氨酸甲酯鹽酸鹽(5g，23.2mmol)溶于無水THF(50ml)中，控溫于5℃，滴入三乙胺(2.3g，23.2mmol)，隨后滴入化合物c(10.9g，23.2mmol)的THF(20ml)溶液，室溫下攪拌5h，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(100ml)，用5％的碳酸氫鈉水溶液(100ml×3)洗滌，用5％的檸檬酸水溶液(100ml×3)洗滌，最后用飽和 食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，得到白色固體11.6g，收率93.5％。ESI-MS(m/z)：533.34[M+H]+；1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.36(ddt,J＝23.3,14.4,7.5Hz,5H),7.22(s,3H),7.10(d,J＝8.1Hz,2H),6.98(d,J＝6.9Hz,2H),6.89(d,J＝8.2Hz,2H),6.25(d,J＝7.4Hz,1H),5.03(s,2H),4.78(dd,J＝6.6Hz,1H),4.27(dd,1H),3.66(s,3H),3.01(dd,J＝27.1,6.5Hz,4H),1.40(s,9H)
步驟2 O-芐基酪氨酸-苯丙氨酸甲酯(5)
化合物4(6g，11.6mmol)加至無水二氯甲烷(25ml)中，控溫于5℃左右，攪拌下滴加三氟乙酸(12ml)，室溫攪拌4h，減壓濃縮至干，乙醚重結(jié)晶得到白色固體5.9g，收率98.0％。ESI-MS(m/z)：433.32[M+H-CF3COOH]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.43-7.27(m,5H),7.22-7.08(m,5H),7.01(d,J＝7.0Hz,2H),6.89(d,J＝7.3Hz,1H),6.85(d,J＝8.6Hz,2H),4.96(s,2H),4.62(dd,J＝13.4,6.6Hz,1H),4.20(dd,J＝7.1Hz,1H),3.60(s,3H),3.14(dd,J＝13.9,6.3Hz,1H),3.04(d,J＝8.0Hz,1H),3.01-2.92(m,2H)
d:苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(7)的制備
步驟1 N-(9-芴甲氧羰基)苯甘氨酸-D-色氨酸-N(γ)‐叔丁氧羰基賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(6)
化合物3(3.5g，4.4mmol)和化合物5(1.4g，4.4mmol)溶于無水THF(50ml)中，控溫于5℃左右，緩慢加入O‐苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲四氟硼酸(1.6g，5.1mmol)和N‐甲基嗎啡啉(0.5g，5.1mmol)，室溫下攪拌6h，減壓濃縮至干，加入乙酸乙酯(100ml)，用5％的碳酸氫鈉水溶液(100ml×3)洗滌，用5％的檸 檬酸水溶液(100ml×3)洗滌，最后用飽和食鹽水洗滌經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，甲醇重結(jié)晶，得到白色固體4.7g，收率87.8％。ESI-MS(m/z)：1202.36[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.70(d,J＝18.5Hz,1H),8.64(d,J＝6.7Hz,1H),8.27(d,J＝7.0Hz,1H),8.17(d,J＝7.6Hz,1H),7.97‐7.90(m,1H),7.85(d,J＝7.4Hz,2H),7.71(dd,J＝18.4,7.2Hz,2H),7.53(d,J＝8.0Hz,1H),7.41‐7.33(m,5H),7.31‐7.11(m,17H),7.04‐6.97(m,1H),6.95‐6.88(m,2H),6.84(d,J＝8.6Hz,2H),6.67(s,1H),5.38(d,J＝8.3Hz,1H),4.97(s,2H),4.57‐4.39(m,3H),4.26‐4.12(m,3H),4.09(s,1H),3.60‐3.45(m,3H),3.09‐2.85(m,5H),2.78(s,3H),1.43(s,1H),1.36(s,1H),1.33(s,9H),1.20(s,2H),0.93(d,J＝7.1Hz,2H).
步驟2 苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(7)
化合物6(4g，3.3mmol)溶于無水THF(50ml)中，控溫于5℃左右，滴加25ml哌啶，室溫下反應(yīng)40min。減壓蒸除溶劑，加入乙醚重結(jié)晶，得到白色固體3.0g，收率92.5％。ESI-MS(m/z)：980.78[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.70(s,1H),8.54(d,J＝8.3Hz,1H),8.25(d,J＝6.9Hz,1H),8.10(d,J＝10.7Hz,1H),7.88(d,J＝9.6Hz,1H),7.52(d,J＝10.8Hz,1H),7.41‐6.80(m,24H),5.26(dd,J＝8.7,5.4Hz,1H),4.97(s,2H),4.52‐4.37(m,3H),4.14‐4.01(m,1H),3.50(s,3H),3.07‐2.79(m,7H),2.69(dd,J＝25.9,12.5Hz,1H),1.32(s,9H),1.26‐1.11(m,4H),0.98‐0.82(m,2H).
應(yīng)用例 帕西瑞肽五肽中間體在制備帕西瑞肽中的應(yīng)用
1、反式-4-(N-叔丁氧羰基-乙二氨基)甲酰氧基-N-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸(ⅱ)的制備
步驟1 反式-4-(N-叔丁氧羰基-乙二氨基)甲酰氧基-N-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸甲酯(ⅰ)
三光氣(3.2g，10.6mmol)和反式-4-羥基-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸甲酯(6.5g，17.7mmol)溶于無水THF(50ml)中，室溫下反應(yīng)2h，控溫于5℃，滴加N-叔丁氧羰基乙二胺(14.2g，88.5mmol)的THF(20ml)溶液，加入4-二甲氨基吡啶(2.2g，17.7mmol)，室溫下攪拌6h，減壓濃縮至干，加入乙酸乙酯(100ml)，0.1mol/L鹽酸水溶液(100ml×3)洗滌，用飽和食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸除部分乙酸乙酯后靜置重結(jié)晶，得到白色固體6.7g，收率68.5％。ESI-MS(m/z)：554.6[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.58(dd,J＝15.3,7.3Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),5.26(d,J＝20.9Hz,1H),4.79(s,1H),4.48(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),4.37–4.31(m,1H),4.28(d,J＝7.7Hz,1H),4.16(s,1H),3.82(s,1H),3.76(s,3H),3.66(s,1H),3.27(s,4H),2.45(s,1H),2.22(s,1H),1.44(s,9H)
步驟2 反式-4-(N-叔丁氧羰基-乙二氨基)甲酰氧基-N-(9-芴甲氧羰基)-脯氨酸(ⅱ)
化合物ⅰ(5g，9.0mmol)溶于無水甲醇(30ml)中，加入氫氧化鈉(0.72g，18.0mmol)水溶液(10ml)，室溫下攪拌2h，減壓蒸除甲醇，得到不溶于水的白色固體4.2g，收率85.5％。ESI-MS(m/z)：540.41[M+H]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.77(d,J＝7.6Hz,2H),7.58(dd,J＝15.3,7.3Hz,2H),7.40(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.4Hz,2H),5.26(d,J＝20.9Hz,1H),4.79(s,1H),4.48(s,1H),4.42(d,J＝7.5Hz,1H),4.37–4.31(m,1H),4.28(d,J＝7.7Hz,1H),4.16(s,1H),3.82(s,1H),3.66(s,1H),3.27(s,4H),2.45(s,1H),2.22(s,1H),1.44(s,9H)
2、反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐Boc‐賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸(ⅳ)的制備
步驟1 反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基‐N‐(9‐芴甲氧羰基)脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸甲酯(ⅲ)
化合物7(2.5g，2.55mmol)和化合物ⅱ(1.38g，2.55mmol)溶于無水THF(50ml)中，控溫于5℃左右，緩慢加入O‐苯并三氮唑‐N,N,N',N'‐四甲基脲四氟硼酸(0.94g，2.93mmol)和N‐甲基嗎啡啉(0.30g，2.93mmol)，室溫下反應(yīng)6h，減壓蒸除溶劑，加入乙酸乙酯(100ml)，經(jīng)5％的碳酸氫鈉水溶液洗滌(100ml×3)，經(jīng)5％的檸檬酸水溶液洗滌(100ml×3)，然后用飽和食鹽水洗滌后經(jīng)無水硫酸鈉干燥，過濾，濾液減壓濃縮至干，甲醇重結(jié)晶，得到白色固體2.85g，收率74.5％。ESI-MS(m/z)：1502.58[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ10.69(dd,J＝27.1,6.2Hz,1H),8.54(dd,J＝42.4,12.0Hz,2H),8.36(dd,J＝21.2,8.6Hz,1H),8.08(dd,J＝19.8,9.3Hz,1H),7.96‐7.90(m,1H),7.87(d,J＝5.0Hz,2H),7.59(d,J＝7.8Hz,2H),7.56‐7.51(m,1H),7.42‐7.11(m,26H),6.88(m,2H),5.58(dd,J＝39.8,8.0Hz,1H),4.96(m,2H),4.89‐4.70(m,1H),4.49(s,2H),4.23(d,J＝9.8Hz,2H),4.15(s,1H),4.08‐4.00(m,1H),3.90(s,1H),3.80(t,J＝14.3Hz,1H),3.52(d,J＝4.9Hz,3H),3.29(s,2H),3.07‐2.93(m,9H),2.92‐2.82(m,4H),2.28‐2.14(m,1H),2.02(dd,J＝15.3,9.7Hz,1H),1.55‐1.40(m,2H),1.35(s,18H),1.30‐1.23(m,2H),0.97(m,J＝16.8,10.8Hz,2H).
步驟2 反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸(ⅳ)
化合物ⅲ(2.0g，1.33mmol)溶于THF(40ml)中，控溫于5℃左右，滴加氫氧化鈉(0.16g，3.99mmol)的水溶液(5ml)，室溫反應(yīng)4h，減壓蒸除溶劑，即得 到不溶于水的白色固體，過濾，得白色固體1.54g，收率91.3％。ESI-MS(m/z)：1264.80[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO)δ11.21(s,1H),10.69(dd,J＝27.1,6.2Hz,1H),8.54(dd,J＝42.4,12.0Hz,2H),8.36(dd,J＝21.2,8.6Hz,1H),8.08(dd,J＝19.8,9.3Hz,1H),7.96‐7.90(m,1H),7.56‐7.51(m,1H),7.42‐7.11(m,22H),6.88(m,2H),5.58(dd,J＝39.8,8.0Hz,1H),4.96(m,2H),4.89‐4.70(m,1H),4.23(d,J＝9.8Hz,2H),4.08‐4.00(m,1H),3.90(s,1H),3.80(t,J＝14.3Hz,1H),3.52(d,J＝4.9Hz,3H),3.29(s,2H),3.07‐2.93(m,9H),2.92‐2.82(m,4H),2.28‐2.14(m,1H),2.02(dd,J＝15.3,9.7Hz,1H),1.55‐1.40(m,2H),1.35(s,18H),1.30‐1.23(m,2H),0.97(m,J＝16.8,10.8Hz,2H).
3、帕西瑞肽(ⅵ)的制備
步驟1 環(huán)[反式‐4‐(N‐叔丁氧羰基‐乙二氨基)甲酰氧基脯氨酸‐苯甘氨酸‐D‐色氨酸‐N(γ)‐叔丁氧羰基賴氨酸‐O‐芐基酪氨酸‐苯丙氨酸](ⅴ)
化合物ⅳ(1.5g，1.19mmol)溶于無水DMF(50ml)中，控溫于-5℃左右，緩慢加入HOBt(4.02g，2.98mmol)和TBTU(1.14g，2.98mmol)，-5℃下反應(yīng)2h，加入水(50ml)，即有白色固體析出，過濾，水洗，得淺黃色固體1.3g，收率87.4％。ESI-MS(m/z)：1247.60[M]+
步驟2 帕西瑞肽(ⅵ)
化合物ⅴ(1g，0.8mmol)溶于無水DCM(25ml)中，控溫于5℃左右，滴加 TFA(12ml)，室溫反應(yīng)1h，減壓蒸除溶劑，加入無水乙醚，析出白色固體，過濾，得白色固體0.9g，收率90％。ESI-MS[m/z]：1047.29[M-2CF3COOH]+；1070.28[M+23-2CF3COOH]+；523.85[M/2+1-2CF3COOH]+。