專利名稱：凝血酶抑制劑的制作方法
凝血酶抑制劑本發(fā)明涉及源自食血節(jié)肢動物唾液腺的凝血酶抑制劑，且具體涉及通過與凝血 酶在2或3個不同位點相互作用起作用的二價和三價凝血酶抑制劑。將正文中提及的和該說明書結尾處列出的全部文件通過參考引入本文。血液凝固是針對血管損傷的部分生理響應，其中絲氨酸蛋白酶的循環(huán)酶原繼而 受到有限蛋白水解作用的活化，從而導致血纖蛋白凝塊的形成。在該反應網絡中，凝血 酶在維持止血完全性中起重要作用。凝血酶與大多數酶原及其輔助因子相互作用，這在 血液凝固中起到多種前凝血劑和抗凝血劑作用工’2。作為前凝血劑蛋白酶，在開始階段中 產生的第一凝血酶痕跡活化因子V(FV)和因子VIII(FVIII)，從而提供陽性反饋，導致凝 血酶爆發(fā)。凝血酶還可以活化因子XI，從而觸發(fā)固有途徑。凝血酶將纖維蛋白原裂解為 血纖蛋白，形成不可溶的凝塊。血纖蛋白聚合物通過由凝血酶活化的因子VIII引發(fā)的共 價交聯進一步加強和穩(wěn)定化。凝血酶還促進血小板栓塞的生成，這可能通過兩種機制 (a)其通過與蛋白酶活化的受體(PARs)和糖蛋白V相互作用活化血小板；和(b)其通過 使用血小板反應蛋白1型基序滅活ADAMTS13，解聯蛋白和金屬蛋白酶，防止血小板栓 塞的去穩(wěn)定化，所述血小板反應蛋白1型基序裂解馮維勒布蘭德因子(VWF)。作為抗凝 血劑蛋白酶，凝血酶在存在輔助因子凝血調節(jié)蛋白的條件下活化蛋白C(APC)。APC滅 活因子Va (FVa)和因子Villa (FVIIIa)，從而下調凝血酶的產生。血栓栓塞病癥是死亡率和發(fā)病率的主要原因6?？鼓獎┦穷A防和治療這些病癥 的關鍵。盡管肝素和香豆素衍生物(維生素K拮抗劑)是抗凝固治療法的基礎，但是這 兩類藥物具有充分記載的局限性，諸如窄治療窗(window)和可高度變化的劑量響應。這 些局限性驅使不斷的和強烈的努力來開發(fā)新型抗凝血劑，主要靶向特異性凝固因子7。凝 血酶代表良好的靶標，這歸因于其在凝固級聯中的重要作用6’ 8。數十年來被廣泛用于治療的凝血酶抑制劑諸如肝素及其類似物是間接凝血酶 抑制劑，即它們起部分抗凝血酶復合物的作用并且自身不直接與凝血酶活性位點相互 作用。這意味著它們僅能夠滅活可溶性凝血酶而不能與血纖蛋白-結合的凝血酶反 應。直接凝血酶抑制劑能夠滅活可溶性和血纖蛋白-結合的凝血酶二者。這賦予相當 可觀的治療益處，因為這些試劑可以抑制凝塊本身內正在進行的凝固過程，而不僅是形 成新凝塊(Di Nisio，M.，S.Middeldorp,和 H.R.Buller.2005.直接凝血酶抑制劑(Direct thrombininhibitors.N Engl J Med (新英格蘭醫(yī)學雜志)353 1028-40)。直接凝血酶抑制劑的一些實例包括水蛭素，比伐盧定(hiralog)(或比伐盧定 (bivaliradin))和agratroban7—9。在進化過程中，食血動物產生了豐富儲存的血液凝固蛋白 酶的抑制劑16_2°并且兩種已知的直接凝血酶抑制劑，水蛭素和比伐盧定，源自食血蛋白。 水蛭素是由醫(yī)學水蛭Hiradomedicinalis的唾液腺中分離的65個氨基酸的蛋白7’ 8’ 1(1。其 具有球狀N端結構域和酸性C端尾部，二者均結合凝血酶分子中的位點。該C端尾部與 凝血酶外位點(eX0Site)-I通過靜電和疏水性相互作用而相互作用。N端結構域結合凝血 酶活性位點附近的非極性位點，從而阻斷其可達性"_13。比伐盧定(hirulog)(或比伐盧定 (bivaliradin)), 20-mer多肽，是通過使用4個Gly殘基作為間隔區(qū)將水蛭素C端尾部嫁接到活性位點結合部分D-Phe-Pro-Arg-Pro的合理設計的產物14’ 15。與水蛭素和比伐盧 定，即結合凝血酶的外位點I和活性位點的二價抑制劑不同，argatroban是單價抑制劑且 僅結合活性位點8。然而，關于與凝血酶活性位點相互作用的直接凝血酶抑制劑的問題是它們最終 可以被凝血酶裂解，從而導致失去抑制活性。保持對更有效的直接凝血酶抑制劑，且特 別是較不可能由于凝血酶裂解失去抑制活性的凝血酶抑制劑的需要。

發(fā)明內容
按照本發(fā)明的第一方面，提供通過使凝血酶暴露于與凝血酶上的外位點I和活性 位點相互作用的一種或多種分子來抑制凝血酶活性的方法。優(yōu)選地，所述一種或多種分 子與凝血酶上的外位點I、外位點II和活性位點均相互作用。按照本發(fā)明的第二方面，提供適合于在本發(fā)明第一方面的方法中使用的一種或 多種凝血酶抑制劑分子，其與凝血酶的外位點I和活性位點相互作用。優(yōu)選地，所述一 種或多種凝血酶抑制劑分子與凝血酶的的外位點I、外位點II和活性位點均相互作用。優(yōu)選地，本發(fā)明第一或第二方面的一種或多種分子通過首先與凝血酶的外位點I 和II相互作用和再與凝血酶的活性位點相互作用抑制凝血酶活性。按照本發(fā)明的第三方面，還提供本發(fā)明第二方面的一種或多種分子和凝血酶的 復合物，其中所述凝血酶抑制劑分子與凝血酶的外位點I和活性位點，優(yōu)選與全部凝血酶 的外位點I、外位點II和活性位點相互作用。優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面的方法中使用的分子，本發(fā)明第二方面的或本發(fā)明第 三方面的復合物中存在的凝血酶抑制劑是具有氨基酸序列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDF EAIPEEYLDDES (SEQ ID NO 1)的variegin蛋白或所述variegin蛋白的功能等價物。由蜱彩飾花蜱(Amblyomma variegatum)的唾液中分離具有上述氨基酸序列的 variegin 蛋白記述在 W003/091284 中，其中 variegin 蛋白稱為 EV445。W003/091284 公 開了 variegin蛋白抑制凝血酶刺激的血小板凝集。然而，W003/091284沒提供任何關于 variegin蛋白是否是通過與凝血酶直接相互作用發(fā)揮其作用的直接凝血酶抑制劑的實驗證 據。令人驚訝地，現在發(fā)現variegin蛋白不僅與凝血酶直接相互作用，而且其在3 個分開的位點處進行。本文中所示的結果顯示variegin蛋白的殘基1-7與凝血酶的外位 點II相互作用，variegin蛋白的殘基8-14與凝血酶的活性位點相互作用并與之結合，且 variegin蛋白的殘基15-32與凝血酶的外位點I相互作用并與之結合?，F有的直接凝血酶 抑制劑，天然的和合成的，例如水蛭素和比伐盧定，是二價的。它們與凝血酶上的外位 點和凝血酶活性位點本身相互作用。Variegin蛋白是本發(fā)明人已知的與凝血酶外位點和凝 血酶活性位點二者相互作用的第一個實例。Variegin蛋白的殘基1_7和15-32與凝血酶外 位點II和I的相互作用似乎調整(align)用于與凝血酶活性位點結合的variegin蛋白的殘基 8-14，隨后的殘基15-32與外位點I的結合加強活性位點的結合。與其他凝血酶抑制劑不同，variegin蛋白在本文中顯示不與其他絲氨酸蛋白酶交 叉相互作用，即一種也被認為是歸因于其與凝血酶中多結構域相互作用的能力的特征。天然variegin蛋白，即在位置14處被糖基化，在本文中顯示展現關于凝血酶的高親和性和在上述類型的酰胺分解測定(amidolytic assay)的高抑制活性水平(約10.4pM的 Ki和約0.99nM的IC50)。具有相同序列但在位置14處無糖基化的合成variegin蛋白在 上述類型的酰胺分解測定中展現出約146pM的Ki和約5.40nM的IC5(1。認為凝血酶抑制 作用開始的速度歸因于variegin與凝血酶相互作用的天性且有效用于這樣的臨床情形中， 其中需要迅速有效抗凝作用，諸如急性心肌梗死、血栓形成性中風、肺栓塞或彌散性血 管內血凝固后的急救應用。本文中所示的數據顯示variegin具有0.86小時的血漿半衰期 和117.2小時的終點消除半衰期。本文中所示的放射自顯影法研究顯示variegin通過腎途 徑迅速排泄，這證實其有可能通過有效用于手術過程中的短期抗凝固。已經闡明了凝血酶的晶體結構，并且公知凝血酶的活性位點、外位點I和外位點 II的特征和位置。凝血酶高度同源于其他絲氨酸蛋白酶，諸如胰凝乳蛋白酶，且具有活 性位點袋，其中底物被兩個帶電區(qū)域，外位點I和II環(huán)繞著結合。術語凝血酶的“活性 位點”、“外位點(exositeH”和“外位點II”，用于本文中時，因此意欲指現有技術中 所述的，例如Lane等(Blood(血液)，2005年10月15日；106(8) 2605-12)中所述的 這些位點。簡言之，術語“活性位點”用于描述凝血酶中的袋，其中纖維蛋白原底物結合 且其包含由60環(huán)-和γ -環(huán)加框(framed)的活性絲氨酸殘基(S 195)。60-環(huán)是疏水性 的，其具有由兩個相鄰的Pro殘基(P60b，P60c)提供的結構剛性。其與底物的疏水性殘 基，裂解位點的N端相互作用。Y-環(huán)更易變，是親水性的，且可以使得與裂解位點C 端的殘基相接觸。術語“外位點I”用于本文中時，是與集中在殘基K36，H71, R73， R75，Y76，R77a,和K109/110上的活性位點相鄰的位點。術語“外位點II”用于本文 中時，是與集中在殘基R93，K236，K240, R101,和R233上的活性位點相鄰的位點， 其位于與外位點I相對的凝血酶位點上。本發(fā)明的一種或多種分子可以通過靜電相互作用與凝血酶上的位點相互作用。 所述靜電相互作用可以是短程靜電相互作用和/或遠程靜電相互作用。優(yōu)選地，靜電相 互作用足夠強以在所述分子和凝血酶上的位點之間形成離子鍵。本發(fā)明的分子抑制凝血酶活性的能力可以通過本領域中已知的標準測定確定。 例如，凝血酶酰胺分解活性可以通過在存在S2238的條件下用假定的凝血酶抑制劑溫育 凝血酶后檢測對-硝基苯胺的形成來評估。本發(fā)明的分子可以具有小于30nM，小于 25nM,小于20nM，小于15nM，小于14nM，小于13nM，小于12nM，或小于IlnM的 IC500優(yōu)選地，當以所述凝血酶酰胺分解測定評估時，本發(fā)明的分子具有小于ΙΟηΜ，優(yōu) 選小于9nM，小于8nM，小于7nM，小于6nM，小于5nM，小于4nM，小于3nM，小 于2nM或小于InM的IC5(1。本發(fā)明的分子可以具有小于小于15nM，小于10nM，小于 5nM,小于InM，小于750pM，小于500pM，小于400pM，小于300pM，或小于250pM 的Ki。優(yōu)選地，當以所述凝血酶酰胺分解測定評估時，本發(fā)明的分子具有小于200pM， 優(yōu)選小于150pM,小于ΙΟΟρΜ，小于50pM，小于30pM，小于25pM，小于20pM，小于 15pM的Ki。優(yōu)選地，本發(fā)明的第一或第二方面的一種或多種分子通過阻止纖維蛋白原 接近凝血酶的活性位點抑制凝血酶活性。本發(fā)明分子的纖維蛋白原溶解(fibrinogenolytic) 活性可以通過檢測延長纖維蛋白原凝固時間，例如，通過用纖維蛋白原溫育所述分子和 通過添加凝血酶起始凝固來評估。
本發(fā)明第一和第二方面的一種或多種分子與凝血酶分子上的位點相互作用的能 力可以通過一些方法，諸如本文中實施例中所述的那些確定。例如，在上述測定中具有 酰胺分解活性的分子能夠與凝血酶活性位點相互作用，而纖維蛋白原溶解活性需要纖維 蛋白原與凝血酶的活性位點和外位點I二者的結合。表現出酰胺分解活性和纖維蛋白原 溶解活性的分子可以因此推斷與活性位點和外位點I 二者相互作用。所述分子與外位點II 相互作用的能力可以通過分析反應結合動力學變化評估。與外位點II的相互作用的存在 似乎導致快速結合特征，且與外位點II相互作用的殘基的缺失導致結合特征由快到慢的 變化。缺失突變體可以用于確定與這些不同的位點結合的分子中的結構域的精確位置。優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面的方法中使用的一種或多種分子和本發(fā)明第二方面的 一種或多種分子特異性抑制凝血酶。優(yōu)選地，本發(fā)明的一種或多種分子表現出非常低的 抑制其他絲氨酸蛋白酶的水平，優(yōu)選完全不抑制其他絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明的一種或多 種分子特異性抑制凝血酶的能力可以通過以上述酰胺分解測定評估其抑制多種絲氨酸蛋 白酶的酰胺分解活性測試，所述測定使用關于各種絲氨酸蛋白酶的特異性發(fā)色團底物。 優(yōu)選地，本發(fā)明的一種或多種分子不抑制其他的血纖蛋白溶解絲氨酸蛋白酶(諸如纖維 蛋白溶酶，TPA和尿激酶)，抗凝血劑蛋白酶APC或其他抗凝血劑絲氨酸蛋白酶(諸如 FXIIa, FXIl, FXl, FIXa, FVIIa和激肽釋放酶)，或其它經典絲氨酸蛋白酶(諸如胰凝 乳蛋白酶和胰蛋白酶)。優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面的方法中使用的一種或多種分子和本發(fā)明第二方面的 一種或多種分子具有無規(guī)卷曲結構。本發(fā)明分子的無規(guī)卷曲結構可以通過圓形二色性光 譜法評估。本發(fā)明第一方面的方法中使用的一種或多種分子和本發(fā)明第二方面的一種或多 種分子在體內施用時，可以具有小于1小時的半衰期。如上所公開地，本發(fā)明第一方面的方法中使用的分子和本發(fā)明第二方面的分子 優(yōu)選是variegin蛋白或其功能等價物。Variegin蛋白發(fā)明的“功能等價物”包括這樣的分子，其與variegin蛋白表現出 顯著的結構相似性并保持上述本發(fā)明分子的優(yōu)選特征。具體地，功能等價物保持與凝血 酶上的外位點I和活性位點相互作用和優(yōu)選與凝血酶上的外位點I、外位點II和活性位點 相互作用的能力。Variegin蛋白的功能等價物因此優(yōu)選具有無規(guī)卷曲結構，連同本發(fā)明的 其他分子保持上述優(yōu)選Ki和IC50值，并表現出特異性抑制凝血酶活性的能力。本文中所示的結果顯示variegin蛋白對凝血酶的親和性是這樣的，即與二價 或單價直接凝血酶抑制劑諸如比伐盧定不同，variegin蛋白即使在已被凝血酶裂解時， 不顯示出凝血酶活性的任何顯著缺失。假定variegin蛋白在若干位點處相互作用的 能力導致蛋白質與凝血酶活性位點強親和性，且該強親和性通過即使在被凝血酶裂解 后的variegin裂解產物維持。這些裂解產物因此被共同認為是variegin蛋白的功能等 價物。Variegin蛋白在氨基酸10和11之間被凝血酶裂解。本發(fā)明第一方面的方法 可以因此包括通過使凝血酶暴露于具有氨基酸序列SDQGDVAEPK(SEQ ID NO 2)和 MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (MH22) (SEQ ID NO 3)的 variegin 裂解產物或這些裂解 產物的功能等價物而抑制凝血酶活性。另外，本發(fā)明第三方面的復合物可以包括凝血酶 和具有氨基酸序列 SDQGDVAEPK (SEQ IDNO 2)和 MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (SEQID NO 3)的variegin的裂解產物，或這些裂解產物的功能等價物。Variegin序列或裂解產物的功能等價物還包括變體，其中variegin蛋白序列，或 variegin蛋白裂解產物序列中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10或更多氨基酸被置換為 備選的氨基酸，條件是保持在外位點I和活性位點處，優(yōu)選在外位點II，外位點I和活性 位點處與凝血酶相互作用的能力。優(yōu)選地，變體應該包含與原始variegin蛋白序列相比保 守的氨基酸置換。典型的所述置換在Ala，Val, Leu和Ile之中；在Ser和Thr之中；酸 性殘基Asp和Glu之中；在Asn和Gln之中；在堿性殘基Lys和Arg之中；或在芳香族 殘基Phe和Tyr之中。本文中所示的結果證明variegin蛋白變體的存在，所述變體在variegin蛋白序列 的位置4，5，6，8，11，12，13，14，17，18，25和31中一些或全部處具有氨基酸置 換。本文中所示的結果還證明在位置10和22處具有氨基酸置換的variegin蛋白序列突 變體保持凝血酶抑制活性。Variegin蛋白的優(yōu)選功能等價物因此包括在這些位置中的一處 或多處具有氨基酸置換的變體。優(yōu)選的功能等價物包括這樣的變體，其中位置4的Gly 被Ala或Ser替換，位置5處的Asp被Gly替換，位置6處的Val被Arg替換，位置8處 的Glu被Gln替換，位置10處的Lys被Arg替換，位置11處的Met被Leu替換，位置 12處的His被Pro替換，位置13處的Lys被Arg替換，位置14處的Thr被Asn替換， 位置17處的Pro被Gln替換，位置18處的Phe被Gly替換，位置22處的Ala被Glu替 換，位置25處的Glu被Asp替換，或位置31處的Glu被His替換。功能等價物包括包 含這些變化中的1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13或全部14種的變體。優(yōu) 選的變體是這樣的變體，其中位置31處的Glu被His替換，所述變體具有氨基酸序列S DQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDHS (SEQ ID NO 4)。該變體可以另外包括位 于以上提及的位置處和分子中其他位置處的置換。本發(fā)明另一種變體是裂解產物之一 的變體，其在variegin序列的位置22處具有Glu到Ala的氨基酸置換，其由此具有序列 MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (MH22A22E) (SEQ ID NO 7)。優(yōu)選地，所述variegin蛋白或裂解產物的變體表現出改善的抑制凝血酶活性的能 力。所述改善的抑制凝血酶活性的能力可以歸因于與凝血酶上的外位點I、外位點II和/ 或活性位點中的一種或多種改善的相互作用。改善的凝血酶活性抑制可以通過利用本文 中所述的測定確定所述變體的IC5tl和Ki值來評估。所述變體還可以表現出與variegin蛋 白類似的體內半衰期。術語“功能等價物”還包括variegin蛋白的片段或其變體的片段，條件是這些片 段保持與凝血酶上的外位點I和活性位點，優(yōu)選與凝血酶上的外位點I、外位點II和活性 位點相互作用的能力。所述片段典型地與variegin蛋白序列或其變體相一致，區(qū)別僅在于 由variegin蛋白序列N端缺失1，2，3，4，5，6，7，8，9或10個氨基酸和由C端缺失 1，2，3或4個氨基酸。所述片段還可以在上述位置中的一處或多處包含氨基酸置換。 所述片段的實例包括具有選自以下各項的氨基酸序列的片段EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (EP25) (SEQ ID NO 6)EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (EP25A22E) (SEQ ID NO 7)EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (EP21) (SEQ ID NO 8)MHKTAPPFDFEAIPEEYL (MH 18) (SEQ ID NO 20)
DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24) (SEQ ID NO 9)DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24K10R) (SEQ ID NO 10)SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (SEQ IDNO 11)SDQADRAQPKLHRNAPQGDFEAIPDEYL (SEQ ID NO 12)SDQSGRAQPKLPRNAPQGDFEAIPDEYL (SEQ IDNO 13)
SDQGDVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD (SEQ ID NO 14)SDQADVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD (SEQ ID NO 15)功能等價物還包括variegin蛋白及其變體和片段的修飾形式，其通過將糖基團或 聚合物基團添加到variegin蛋白或其變體內的氨基酸中修飾。具體地，功能等價物包括 variegin蛋白的糖基化形式。在variegin的天然形式中，全長序列的位置14處的Thr被己 糖部分修飾。功能等價物因此包括在對應于variegin蛋白序列的位置14的位置處被糖基 化修飾的variegin蛋白，和上述variegin蛋白的變體和片段。功能等價物還包括在其他位 置處被糖基化修飾的variegin蛋白及其變體和片段。優(yōu)選地，糖基化包括引入己糖殘基。 功能等價物還包括variegin蛋白及其變體和片段的PEG化形式。所述PEG化形式可能特 別有效用于延長這些分子在某些醫(yī)學應用中的半衰期。按照本發(fā)明使用的功能等價物還可以是融合蛋白，其例如通過將框內編碼 variegin蛋白或其變體或片段多核苷酸克隆到異源蛋白序列的編碼序列獲得。術語“異 源”，當用于本文中時，意指除variegin蛋白或其功能等價物以外的任何多肽。在N或C 端包含所述融合蛋白的異源序列的實例如下膜結合蛋白的胞外結構域，免疫球蛋白恒 定區(qū)(Fe區(qū))，多聚化結構域，胞外蛋白的結構域，信號序列，輸出序列，或容許通過親 合層析法純化的序列。這些異源序列中的許多可在商業(yè)上在表達質粒中獲得，因為這些 序列普遍包含在融合蛋白中，從而在不顯著削弱該蛋白與其融合的特異性生物學活性的 條件下提供另外的特性(Terpe K，Appl MicrobiolBiotechnol (應用微生物學和生物技術)， 60 523-33，2003)。所述另外的特性的實例是在體液中較長久的半衰期，胞外定位，或 通過標記物諸如組氨酸或HA標記物容許的較容易的純化程序。融合蛋白還應該具有醫(yī)學應用。例如，由于variegin蛋白及其功能等價物能夠結 合凝血酶，所以它們可以用作將治療分子運送到血纖蛋白或血小板血栓位點的工具。異 源蛋白可以因此是有效用于治療血纖蛋白或血小板血栓的治療分子。優(yōu)選地，所述治療 分子是抗炎試劑或溶血栓試劑。異源蛋白還可以是標記結構域。優(yōu)選地，標記結構域是熒光標記物，容許通過 親和性結合純化的表位標記物，容許組織化學或熒光標記的酶標記物，或放射化學標記 物。在優(yōu)選的實施方案中，標記結構域是放射化學標記物。所述融合蛋白應該用作診斷 工具。例如，由于variegin蛋白能夠結合凝血酶，所以其在與合適的標記結構域，諸如合 適的放射化學標記物相連接時，可以用作成像血纖蛋白或血小板血栓的工具。用于生成融合蛋白的方法是本領域中的標準，且應該是技術人員讀者已知的。 例如，最普通的分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學技術可以參見Sambrook 等(2000)或Ausubel等(1991)。一般地，融合蛋白可以最方便地由核酸分子通過重組方 式生成，在所述核酸分子中，兩個核酸序列在框內融合在一起。這些融合蛋白應該由包 含所討論的融合蛋白的相關編碼序列的核酸分子編碼。
功能等價物還包括上述variegin蛋白、變體、片段、修飾的變體或片段、或融合 蛋白的多聚體。這些多聚體組成本發(fā)明的另一方面，以及有效用于本發(fā)明第一方面的方 法。認為所述variegin蛋白的多聚體可以特別有效用于結合和抑制大量凝血酶。這些多 聚體中的variegin蛋白可以都通過它們的C端與中間連接體部分相連。備選地，variegin 蛋白可以以長串N端與C端相連。優(yōu)選地，所述多聚體包括variegin蛋白或其變體、片 段功能等價物的2，3，4，5或更多個拷貝。所述多聚體中的variegin蛋白或其功能等價 物可以都彼此相同，或它們可以不同。例如，多聚體可以包括variegin的若干不同變體。本發(fā)明第一方面的方法可以在體外或體內進行。當所述方法在體外進行時，其可以在無細胞系統中或在包含編碼與凝血酶相互 作用的一種或多種分子的核苷酸序列的細胞中進行。本發(fā)明因此還提供核酸分子，其包 含編碼按照本發(fā)明第二方面的凝血酶抑制劑的核苷酸序列，其應該有效用于本發(fā)明第一 方面的方法中。所述分子包括單鏈或雙鏈DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸種類。 優(yōu)選地，所述核酸序列包括DNA。當本發(fā)明的方法如下所述在體內執(zhí)行時，也可以使用 這些核酸序列。本發(fā)明還包括克隆和表達載體，其包含本發(fā)明這個方面的核酸分子。所述表達 載體可以將適當的轉錄和翻譯控制序列，例如，增強子元件、啟動子-操縱子區(qū)，終止 終止序列，mRNA穩(wěn)定性序列，起始和終止密碼子或核糖體結合位點，與本發(fā)明的核酸 分子框內合并相連。另外地，可以方便地引起由某些宿主分泌一種或多種重組凝血酶抑 制劑分子。因此，所述載體的其他成分可以包括編碼分泌物的核酸序列，信號傳導和處 理序列。按照本發(fā)明的載體包括質粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)，以及其他線性或 環(huán)狀DNA載體，諸如使用轉座因子或同源重組技術的那些。在本領域中已知并記載了許 多這樣的載體和表達系統(Fernandez & Hoeffler，1998)。特別合適的病毒載體包括基于 桿狀病毒_，腺病毒_和牛痘病毒的載體。用于重組表達的合適宿主包括普遍使用的原核物種，諸如大腸桿菌(E.coli)，或 可以用于表達高水平重組蛋白和可以容易地大量生長的真核酵母。體外生長的哺乳動物 細胞系也是合適的，特別是當使用病毒引發(fā)的表達系統時。另一種合適的表達系統是桿 狀病毒表達系統，其包括使用昆蟲細胞作為宿主。表達系統還可以組成具有引入它們的 基因組中的DNA的宿主細胞。蛋白，或蛋白片段還可以體內，例如在昆蟲幼蟲或在哺乳 動物組織中表達?？梢允褂枚喾N技術將載體引入到原核或真核細胞中。合適的轉化或轉染技術充 分記述在文獻(Sambrook 等，1989; Ausubel 等，1991; Spector, Goldman & Leinwald，
1998)中。在真核細胞中，表達系統根據系統需要，可以是瞬時的(例如，游離型的)或 永久的(染色體整合)。本發(fā)明還提供反義核酸分子，其在高度嚴格雜交條件下與編碼按照本發(fā)明第二 方面的凝血酶抑制劑的核酸分子雜交。高度嚴格雜交條件在本文中定義為在包含50%甲 酰胺，5XSSC(150mM NaCl，15mM 檸檬酸三鈉)，50mM 磷酸鈉(pH7.6)，5x Denhardt
雜交溶液，10%葡聚糖硫酸酯，和20微克/ml變性、剪切鮭魚精子DNA的溶液中在42°C 過夜溫育，隨后在約65°C，在0.1XSSC中清洗濾器。在優(yōu)選的實施方案中，能夠被檢測的標記物附著于這些反義核酸分子。優(yōu)選地，所述標記物選自由放射性同位素、熒光化 合物和酶組成的組。本發(fā)明還包括轉化或轉染的原核或真核宿主細胞，其包含核酸分子，反義核酸 分子或如上定義的載體。優(yōu)選地，所述宿主細胞是原核細胞，優(yōu)選大腸桿菌細胞。當本 發(fā)明的方法在體外執(zhí)行時，其可以在所述細胞中執(zhí)行。本發(fā)明的另一方面提供用于制備按照本發(fā)明第二方面的凝血酶抑制劑分子的方 法，其包括在這樣的條件下培養(yǎng)含有按照本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞，通過所述條件 表達蛋白并回收由此產生的蛋白。由此產生的凝血酶抑制劑可以用在本發(fā)明第一方面的 方法中。當本發(fā)明第一方面的方法在體內執(zhí)行時，其可以用于治療。具體地，體內執(zhí)行 的方法可以用于治療或預防血液凝固病癥。按照本發(fā)明第一方面的優(yōu)選實施方案，由此提供治療患有凝血病的患者或預防 患者發(fā)展為凝血病的方法，其包括抑制凝血酶與外位點II和凝血酶分子上活性位點處的 纖維蛋白原的相互作用。優(yōu)選地，本發(fā)明第一方面的這個實施方案的方法包括抑制凝血 酶與凝血酶的全部外位點I、外位點II和活性位點處的纖維蛋白原的相互作用。優(yōu)選地，本發(fā)明這個方面的方法包括向患者供應本發(fā)明第二方面的一種或多種 分子，其通過與外位點I和活性位點相互作用，優(yōu)選通過與外位點I、位點II和活性位 點相互作用的一種或多種分子相互作用抑制凝血酶。優(yōu)選地，所述一種或多種分子是 variegin蛋白或其功能等價物，如上所述。備選地，所述方法可以包括供應編碼所述本發(fā) 明第二方面的一種或多種分子的核酸，如上所述。通過“凝血病”意指任何血液凝固病癥。術語“治療有效量”意指治療或改 善靶向的疾病或病癥所需的化合物的量。術語“預防有效量”用于本文中時，意指預 防靶向的疾病或病癥所需的化合物的量。準確的劑量通常應該取決于施藥時患者的狀 態(tài)。當確定劑量時可能考慮的因素包括患者中疾病狀態(tài)的嚴重性，患者的一般健康狀 態(tài)，年齡，體重，性別，飲食，施藥的時間和頻率，藥物組合，反應靈敏性和患者對治 療的耐受性或響應。精確的量可以通過常規(guī)實驗確定，但是可能最終依賴于臨床醫(yī)生的 判斷。一般地，有效劑量應該是O.Olmg/kg (藥物質量與患者質量相比)-50mg/kg，優(yōu)選 O. O 5mg/kg-1 Omg/kg。當本發(fā)明的方法在體內執(zhí)行時，與凝血酶相互作用的一種或多種分子，或編碼 它們的核酸分子，優(yōu)選以與藥用載體聯合的藥物組合物的形式提供。術語“藥用載體”，用于本文中時，包括基因、多肽、抗體、脂質體、多 糖、聚乳酸、聚乙醇酸和失活病毒粒子或實際上任何其他試劑，條件是該賦形劑本身 不誘導毒性作用或導致產生對接受藥物組合物的個體有害的抗體。藥用載體可以另外 包含液體，諸如水、鹽水、甘油、乙醇或輔助性物質諸如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖 物質等。賦形劑可以容許所述藥物組合物被配制為片劑、丸劑、糖衣丸劑、膠囊、 液體、凝膠、糖漿、漿料、混懸液，以協助患者攝取。藥用載體的徹底討論可見于 Remington ‘ sPharmaceutical Sciences (雷明頓藥物科學)(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。抗凝血劑和凝血酶抑制劑，特別地，在治療和預防廣泛疾病和病癥中具有應 用。上述分子和組合物可以用在任何這樣的情形中，其中需要誘導抗凝固作用，以預防或治療凝血病。當需要抗凝固作用時，治療包括為了診斷或治療原因涉及經皮、經血管或經器 官導管插入術的程序。所述程序可以包括但不僅限于冠狀血管成形術；血管內支架程 序；通過動脈或靜脈導管直接施用溶血栓試劑，諸如中風或冠狀動脈血栓癥后；電復律 (electrical cardioversion)；放置心臟起搏器導程；血管內和心臟內監(jiān)測壓力、氣體飽和度 或其他診斷參數；放射學或涉及經皮或經器官導管插入術的其他程序；以確保長期植入 血管內母體營養(yǎng)導管的開放性；從而確保血管進入端口無論長期或短期的開放性。已經證明了二價直接凝血酶抑制劑諸如比伐盧定比肝素及其類似物優(yōu)越地用在 所述程序中(Lehman，S.J.,和 D.P.Chew.2006，Vasc Health RiskManag(血管健康分析 管理)2 357-63 ； Maclean, A.A.等，2006.Tech VascInterv Radiol (相關和干涉放射學 技術)9 80-3 ； Lewis，B.E.,和 M.J.Hursting.2007.，Expert Rev Cardiovasc Ther(心血 管治療專家綜述)5: 57-68. ； Watson, K.等，2007，Pharmacotherapy(藥物療法)27 647-56.)。具體地，手術前后出血的發(fā)生頻率基本下降，且在患有急性冠狀綜合征 (ACS)的患者中，隨后的MI發(fā)生頻率下降(Stone，G.W.等，2006，NEngl JMed(新英 格蘭醫(yī)學雜志)355: 2203-16. ； Manoukian, S.V.等，2007.J Am CollCardiol (美國心臟病 學學院雜志)49: 1362-8. ； Stone, G.W.等，2007，Lancet369 907-19)。因此預期， 上述凝血酶抑制劑也應該比肝素及其類似物優(yōu)越地用在所述程序中。本發(fā)明第一方面的方法的另外體內應用包括在血栓栓塞事件后的緊急抗凝固作 用，包括但不僅限于急性心肌梗死；血栓形成性中風；深度靜脈血栓癥；血栓性靜脈 炎；肺栓塞；栓塞和微栓塞發(fā)作，其中來源可以是心臟，動脈粥樣硬化斑，瓣膜或血管 修復物或未知來源；彌散性血管內凝固(DIC)。本發(fā)明的方法還可以用于在器官灌注程序過程中，諸如在心肺分流術，肝分流 術和作為器官移植附件過程中預防凝固。由CPB促成的大量血栓形成反應不能被間接 凝血酶抑制劑諸如肝素及其類似物完全拮抗(Edmunds，和Colman.2006，Ann Thorac Surg (胸部手術記錄)82 2315-22.)。當需要抗凝固作用時的其他實例包括在血液透析、血液過濾或血漿交換程序 中?？鼓套饔迷谏婕敖徊鎶A緊血管的手術程序過程中也可能是需要，從而最小化末梢 循環(huán)中的凝固風險。這樣的程序可以包括但不僅限于動脈內膜切除術、插入血管支架、 修補大動脈和其他動脈動脈瘤。另外地，本發(fā)明的方法和凝血酶抑制劑可以有效用于在肝素抗性患者中誘導抗 凝固作用。所述方法和凝血酶抑制劑還可以有效用于治療或預防肝素誘導的血小板減少 癥。所述治療可以施用于患有或處于HIT風險和患有或不患有活性血栓癥的患者， 且可以施用直到血小板計數恢復到正常范圍內或直到血栓癥風險已經度過(Girolami和 Girolami 2006，Semin Thromb Hemost (血栓癥和止血法研究會)32 803-9 ； Lewis， B.E.,和 M.J.Hursting.2007.ExpertRev Cardiovasc Ther(心血管治療專家綜述)5 57-68.)。按照本發(fā)明的具體方面，所述體內方法涉及向患有由凝血酶累積引起的病癥的 患者供應融合蛋白，所述融合蛋白包含處于治療有效量的本發(fā)明第二方面的凝血酶抑制劑，其遺傳地或化學地與治療分子融合。本發(fā)明的方法涉及與凝血酶的直接相互作用。 該特征意味著它們可以用于將治療分子運送到凝血酶累積位點。優(yōu)選地，所述治療分子 是抗炎試劑或溶血栓試劑。優(yōu)選地，所述病癥是血纖蛋白或血小板血栓。凝血酶抑制劑可以通過任何合適的途徑施用。優(yōu)選施藥途徑包括靜脈內、肌肉 內或皮下注射和口服施用。治療可以通過靜脈內灌輸或作為單一或重復推注連續(xù)施用。 凝血酶抑制劑可以單獨施用于患者或可以與其他試劑、藥物或激素組合施用。例如，本 發(fā)明的凝血酶抑制劑可以與口服抗凝血劑諸如香豆素衍生物一起施用，直到患者變得穩(wěn) 定化的時刻，其后，可以用香豆素衍生物單獨處理患者。本發(fā)明還提供本發(fā)明第一方面的方法可以用于診斷。由于這些方法涉及通過與 凝血酶相互作用特異性抑制凝血酶活性，所以它們可以用于檢測凝血酶的存在并由此用 于診斷由凝血酶累積導致的病癥，諸如血纖蛋白或血小板血栓。本發(fā)明因此提供本發(fā)明 第一方面的方法可以涉及診斷由凝血酶累積引起的病癥，其通過將如上所述的本發(fā)明第 二方面的凝血酶抑制劑施用于患者或由患者分離的組織，和檢測所述凝血酶抑制劑或其 功能等價物的存在實現，其中所述凝血酶抑制劑或與凝血酶結合的功能等價物的檢測指 示所述疾病或病癥。優(yōu)選地，凝血酶抑制劑或功能等價物采用融合蛋白的形式，其包含 如上更詳細描述的用于促進檢測的標記結構域。優(yōu)選地，所述標記結構域是放射化學標 記物，由此檢測可以利用已知的成像方法進行。優(yōu)選地，所述疾病或病癥是血纖蛋白或 血小板血栓。按照本發(fā)明第一方面的另一方面，本發(fā)明第一方面的體內方法可以用于治療惡 性腫瘤疾病或與惡性腫瘤疾病有關的病癥。數十年來，已經公認惡性腫瘤疾病通常與增加的血栓栓塞發(fā)作傾向有關。例 如，Trousseau綜合征的特征在于短暫的血栓性靜脈炎和潛在的惡性腫瘤，且凝血酶抑制 齊U諸如肝素已經用在其處理中(Varki A.Trousseau ‘ sSyndrome multiple definitions and multiple mechanisms (Trousseau綜合征多重定義和多種機制).Blood (血液)2007)。更 近期，變得清楚的是，前凝血劑因子諸如凝血酶的產生可能是惡性腫瘤疾病某些方面的 原因而__結果(Nierodzik ML, Karpatkin S.Thrombin induces tumor growth, metastasis, and angiogenesis Evidence for a thrombin-regulated dormant tumor phenotype (凝血酶誘導 腫瘤生長、轉移和血管發(fā)生關于凝血酶調節(jié)的休眠腫瘤表型的證據).Cancer Cell(癌細 胞)2006 ； 10(5) 355-62.)。凝血酶，VEGF和IGFII已經顯示出促進癌細胞的存活和侵入(GieselerF， Luhr I， Kunze T, 等 Activated coagulation factors in human malignanteffusions and their contribution to cancer cell metastasis and therapy(人惡性腫瘤滲出物中的活化的凝固因子
及其對癌細胞轉移和治療的貢獻).Thromb Haemost(血栓癥和止血法)2007 ； 97(6) 1023-30.)。骨橋蛋白COOH端的凝血酶裂解已經顯示出在小鼠中促進乳腺癌(Mi Z, Oliver T, Guo H, Gao C， Kuo PC.Thrombin-cleaved COOH (-) terminal osteopontin peptidebinds with cyclophilin C to CD 147 in murine breast cancer cells (凝血酶裂角軍的 COOH (-)端骨橋蛋白肽在鼠科乳腺癌細胞中結合親環(huán)蛋白C-CD147) .Cancer Res (癌 癥研究)2007; 67(9) 4088-97.)。凝血酶似乎在前列腺癌轉移中通過減少細胞與胞 外基質的粘附和將惡性腫瘤細胞定位在用于遷移的“就緒狀態(tài)”起作用(Loberg RD，Tantivejkul K, Craig M, Neeley CK, PientaKJ.PARl-mediated RhoA activation facilitates CCL2-induced chemotaxis inPC_3cells(PARI-誘導的 RhoA 活性在 PC-3 細胞中促進 CCL2
誘導的趨化性)J Cell Biochem(細胞生物化學雜志)2007)。因此，在手術諸如基本前列 腺切除術或前列腺活組織檢查過程中使用有效的凝血酶抑制劑可以減少將惡性腫瘤細胞 釋放到系統循環(huán)中并減少釋放的那些細胞的存活。本發(fā)明第一方面的方法和本發(fā)明第二方面的分子可以因此有效用于治療 Trousseau綜合征，特別是當禁忌肝素及其類似物(例如，在肝素誘導的血小板減少癥 中)；用作抗癌試劑；和在程序諸如手術切除、惡性腫瘤操作或活組織檢查過程中使 用，以減小轉移的風險。當本發(fā)明的這個方面中使用的分子是variegin蛋白或其功能等價 物時，其優(yōu)選采用已經被糖基化或PEG化的修飾形式，從而增長分子的半衰期。本文中所示的結果提供variegin蛋白的功能結構域的首次公開，以及variegin分 子的裂解產物的首次公開。具體地，本文中所示的結果公開了 variegin蛋白的殘基1-7與 凝血酶外位點II相互作用，variegin蛋白的殘基8_14與凝血酶的活性位點相互作用，且殘 基15-32與凝血酶外位點I結合位點相互作用。認為這些區(qū)域以全長variegin蛋白共同起 作用，以抑制凝血酶活性。然而，如在導言中討論地，許多現有的凝血酶抑制劑是單價 或二價結合體。因此預期僅與凝血酶上的這些區(qū)域之一相互作用的variegin蛋白或其變體 片段也應該是凝血酶抑制劑。事實上，本文中所示的結果顯示含有關于凝血酶活性位點 的結合位點和關于外位點I(EP25)的結合位點的片段具有與全長合成variegin蛋白類似的 IC50和Ki值。僅與凝血酶內的一個或兩個位點相互作用的variegin蛋白片段可以具有全 長variegin蛋白關于醫(yī)學應用的優(yōu)勢，原因在于它們更迅速地從循環(huán)中清除。這使得它 們理想地用于短程序諸如心臟導管插入術中，其中不需要抗凝固作用持續(xù)到該程序結束 后。按照本發(fā)明的另一方面，因此提供凝血酶抑制劑，其中所述凝血酶抑制劑包含 variegin序列的片段且包含選自以下各項的氨基酸序列 EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (EP25-與活性位點和外位點I相互作用) (SEQ ID NO 6)APPFDFEAIPEEYLDDES (AP18-與外位點 I 相互作用)(SEQ ID NO16)SDQGDVAEPKMHKT (與外位點II和活性位點相互作用)(SEQ IDNO 17)SDQGDVA (與外位點 II 相互作用)(SEQ ID NO 18)EPKMHKT (與活性位點相互作用)(SEQ ID NO 19)APPFDFEAIPEEYLDDES (與外位點 I 相互作用)(SEQ ID NO 16)SDQGDVAEPK (裂解產物 1) (SEQ ID NO 2)MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (裂解產物 2 ； MH22) (SEQ ID NO 3)EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (EP21) (SEQ ID NO 8)MHKTAPPFDFEAIPEEYL (MH18) (SEQ ID NO 20) DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24) (SEQ ID NO 9)或其功能等價物。本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑是variegin蛋白的片段且因此不包含具有氨基酸 序列 SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (SEQ IDNO 1)的 variegin 蛋白的完整序列。然而，本發(fā)明的這個方面的凝血酶抑制劑可以在上述特異性片段序列的N或C端 包含來自variegin蛋白序列的另外的氨基酸序列，條件是該凝血酶不包含variegin蛋白的
所有氨基酸。本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑還包括含有多于一種上述特異性片段的分子。 例如，凝血酶抑制劑可以包含SDQGDVA (SEQ ID NO 18)與外位點II相互作用)和 APPFDFEAIPEEYLDDES (與外位點I相互作用)(SEQID NO 16)。優(yōu)選地，這些外位點 II和外位點I相互作用位點通過連接體分子相連接，所述連接體分子大約與全長variegin 蛋白中存在的凝血酶活性結合位點等長。本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑可以由上述序列之一或其功能等價物組成。按照本發(fā)明第四方面的凝血酶抑制劑優(yōu)選表現出上述本發(fā)明第二方面的凝血酶 抑制劑特征，諸如優(yōu)選的Ki和IC50值和特異性抑制凝血酶而不抑制其他絲氨酸蛋白酶的 能力。本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑的功能等價物包括這樣的分子，所述分子對本 發(fā)明第四方面的凝血酶抑制劑表現出顯著的結構相似性并與其來源的凝血酶抑制劑保持 與凝血酶相同區(qū)域相互作用的能力。按照本發(fā)明這個方面的功能等價物包括上述特異性 凝血酶抑制劑的變體，其包含一個或多個氨基酸置換，所述氨基酸置換基本不改變凝血 酶抑制劑與凝血酶的相互作用。優(yōu)選地，所述氨基酸置換是保守的氨基酸置換，諸如關 于以上本發(fā)明第一和第二方面的分子所述的那些。優(yōu)選的置換是以上關于全長variegin蛋 白的變體討論的氨基酸位置處發(fā)生那些。所述功能等價物的實例包括具有選自以下各項的氨基酸序列的變體EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (EP25A22E) (SEQ ID NO 7)DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24K10R) (SEQ ID NO 10)
MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (MH22A22E) (SEQ ID NO 5)本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑的功能等價物還包括凝血酶抑制劑的片段，條 件是這些片段保持抑制凝血酶活性的能力。功能等價物還包括通過另外的基團，諸如糖基團或聚合物基團共價附著修飾的 凝血酶抑制劑及其片段的修飾形式。以上關于在本發(fā)明第一方面方法中使用的功能等價 物variegin蛋白提供的所述修飾的實例同等地適用于本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑。本發(fā)明第一方面的功能等價物還包括凝血酶抑制劑的融合蛋白。對于包含在所 述融合蛋白中合適的配偶體連同含有全長variegin序列的融合蛋白一起在上文中討論。本發(fā)明還提供按照本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑和凝血酶的復合物。本發(fā)明還提供核酸分子，所述核酸分子包括編碼按照本發(fā)明這個方面的凝血酶 抑制劑的核苷酸序列。所述分子包括單鏈或雙鏈DNA、cDNA和RNA，以及合成的核酸 種類。優(yōu)選地，所述核酸序列包括DNA。本發(fā)明還包括包含這些核酸分子的克隆和表達載體。所述載體可以包含另外的 控制序列，諸如關于連同本發(fā)明這個方面的方法一起使用的表達載體所述的那些和如上 所述的本發(fā)明第二方面的凝血酶抑制劑。本發(fā)明還包括反義分子，其在高度嚴格條件下與編碼按照本發(fā)明這個方面的凝 血酶抑制劑分子的核酸分子雜交。高度嚴格條件的實例連同本發(fā)明第一和第二方面的分子一起記述在上文中。本發(fā)明還包括轉化或轉染的原核或真核宿主細胞，其包含核酸分子、反義核酸 分子或編碼本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑分子的載體。合適的宿主細胞和用于制備所 述宿主細胞的方法連同本發(fā)明的第一和第二方面記述在上文中。本發(fā)明還包括制備按照本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑分子的方法，其包括在 由此表達蛋白的條件下培養(yǎng)包含按照本發(fā)明的核酸分子的宿主細胞和回收由此生成的蛋白。本發(fā)明還包括按照本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑在治療中的用途。按照本發(fā) 明這個方面的凝血酶抑制劑可以采用藥物組合物的形式，所述藥物組合物另外包含藥物 有效載體，如上文中討論的。按照本發(fā)明這個方面的凝血酶抑制劑可以用于治療或預防 可以利用上述本發(fā)明第一和第二方面的方法或分子治療的任何病癥。本發(fā)明這個方面的 凝血酶抑制劑還可以用于關于以上本發(fā)明第一和第二方面的方法和分子所討論的任何診 斷方法中。現在將通過實施例的方式更詳細地描述本發(fā)明的不同方面和實施方案。應該理 解，在不偏離本發(fā)明范圍的條件下可以對詳細信息進行改進。附1.純化凝血酶抑制劑variegin同種型。(A)在第一步中，用10-100 %乙 腈的梯度分餾SGE 90分鐘。匯集的AV-I-AV-VIII餾分中的蛋白質濃度的范圍是 0.08 (AV-I)-1.39 μ g/μ 1 (AV-IV)。對于 TT 測定(對照凝固時間=19s) NC-添加 < 0.01 μ g蛋白/50 μ 1血漿后無凝固；"'添加< 0.01 μ g蛋白/50 μ 1血漿后延長凝固> 1分鐘；η添加< 0.01 μ g蛋白/50 μ 1血漿后延長凝固> 40s ； *與對照相比的任何凝固延 遲。對于APTT測定(對照凝固時間=40s) NC-添加< 0.01 μ g蛋白/50 μ 1血漿后無 凝固；· 添加< 0.01 μ g蛋白/50 μ 1血漿后延長凝固> 1分鐘； 添加<0.1 μ g 蛋白/50 μ 1血漿后延長凝固> 1分鐘； 與對照相比的任何凝固延遲。對PT測定(對 照凝固時間=15s)〇〇添加0.5 μ g蛋白/50 μ 1血漿后延長凝固> 1分鐘；〇與對照相 比的任何凝固延遲。(B)用10-40%乙腈梯度對餾分AV-III進行第二純化步驟60分鐘。 餾分中的蛋白濃度的范圍是0.05-0.17μ§/μ1。用S2238對具有抗凝固活性(虛線，用 PT, APTT和TT測定)的餾分的范圍進行測試，以獲得抗凝血酶活性。用星號表示的 餾分抑制凝血酶酰胺分解活性。具有最強活性的兩個餾分(保留時間23.083和28.933分 鐘，由箭頭表示)進一步利用第三純化步驟(10-40%乙腈梯度，60分鐘)純化(η = 2)。 (C)將具有保留時間23.083分鐘的餾分分成兩個主峰，表示為AV 3/5和AV5/5。(D)具 有保留時間28.933的餾分具有一個主峰和具有一個小“肩峰”，且表示為AV 6/5。圖2.variegin的氨基酸序列及其凝血酶抑制活性。(A)餾分AV 6/5 (variegin)， AV 3/5和AV 5/5中的肽序列高度類似。(B)利用S2238 (100 μ M)作為底物，由 variegin引起的凝血酶抑制的線性進程曲線的實例(■ 0.020nM，□ 0.039nM, · 0.078nM， O 0.156nM, ▲ 0.313ηΜ, Δ 0.625ηΜ, Τ 1.25ηΜ, ▽ : 2.5ηΜ， 5ηΜ, IOnM),其顯示在混合時獲得的穩(wěn)態(tài)平衡。(C)利用活性位點定向的底物 S2238(100y Μ)測定 variegin(0.00InM，0.003nM, O.OlnM, 0.03nM, O.lnM, 0.3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM和IOOnM)抑制凝血酶(3.33nM)酰胺分解活性的能力。由variegin( ■)引起的凝血酶抑制的劑量響應曲線顯示凝血酶和variegin(3.33nM)等摩爾濃 度的顯著抑制( 80% )。該抑制的IC5tl是 0.99士0.02nM(n = 3)。 (D)由于variegin 表現為緊密結合抑制劑，由處于類似濃度(0.020nM，0.039nM, 0.078nM, 0.156nM, 0.313nM, 0.625nM, 1.25nM, 2.5nM, 5nM, IOnM)的 variegin 引起的凝血酶(1.8nM)抑 制利用S2238(100yM)作為底物來檢查。將獲得的數據適用于方程式(1)和(2)，以獲 得 Ki 10.4士 1.4pM(n = 3)。圖3.由variegin引起的抑制的特異性。針對13種絲氨酸蛋白酶篩選S_Variegin 血纖蛋白溶解絲氨酸蛋白酶(纖維蛋白溶酶，TPA和尿激酶)，抗凝血絲氨酸蛋白酶 APC,前凝血劑絲氨酸蛋白酶(FXIIa，FXIa, FXa, FIXa, FVIIa,激肽釋放酶和凝血 酶)和經典絲氨酸蛋白酶(胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶)。在圓括號中分別以nM和mM給 出蛋白酶和底物的最終濃度纖維蛋白溶酶(3.61)/S2251 (1.2)，TPA(36.9)/S2288 (1)， 尿激酶(40U/ml)/S2444(0.3)，APC (2.14)/S2366 (0.67)，FXIIa (20)/S2302 (1)， FXIa(0.125)/S2366 (l)，FXa (0.43)/S2765 (0.65)，FIXa(333)/ Spectrozyme FIXa (0.4), FVIIa (460)/S2288(l),激肽釋放酶(0.93)/S2302 (1.1)，α-凝血酶(3.33)/ S2238(0.1),胰凝乳蛋白酶(1.2)/S2586 (0.67)和胰蛋白酶(0.87)/S2222 (0.1)。針對三種 s-variegin濃度測試凝血酶(■)代表0.01 μ M, ( S )代表0.1 μ M和(圍)代表1 μ Μ。 對于其他蛋白酶，使用更高得多的s-variegin濃度(■)代表1 μ M，( ■)代表10 μ M 和(□)代表 100 μ M (η = 3)。圖4.由s-variegin、EP25和AP18引起的凝血酶抑制。(A)利用活性位點定向的 底物S2238 (100 μ Μ)測定s-variegin、EP25和AP18抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。由 s-variegin (0.InM，0.3nM, InM, 3nM, IOnM, 30nM, IOOnM, 300nM, IOOOnM)引起 的凝血酶(3.33nM)抑制的劑量響應曲線顯示凝血酶和variegin(3.33nM)等摩爾濃度的顯 著抑制( 30% )。該抑制的劑量-響應曲線和IC5tl與溫育時間無關(■)代表IOmin 溫育(IC50 5.40士0.95nM)和(〇)代表 IOmin 溫育(IC50 5.49士0.42ηΜ) (η = 3)。 (B)由 EP25(0.1nM，0.3nM, InM, 3ηΜ, IOnM, 30ηΜ, IOOnM, 300ηΜ, IOOOnM)引 起的凝血酶(3.33ηΜ)抑制的劑量-響應曲線顯示依賴溫育時間的移動。IC5tl在無溫育條 件下是 139.30 士 7.02ηΜ(·)，在1分鐘溫育條件下是 22.55 士 2.52ηΜ (〇)，在2分鐘 溫育條件下是 10.39 士 1.53ηΜ(Α)，在5分鐘溫育條件下是 6.42 士 0.50ηΜ( ▽)，在10 分鐘溫育條件下是 6.80 士0.57ηΜ( )和在20分鐘溫育條件下是 5.63 士0.45ηΜ(+) (η =3)。(C)AP18(3y Μ, 10 μ Μ, 30 μ Μ, 100 μ Μ, 300 μ Μ)不能抑制 S2238 (100 μ Μ) 上凝血酶(3.33ηΜ)酰胺分解活性；而是在高濃度ΑΡ18時，S2238的水解略微提高(η =3)。 (D)全部三種肽，s_variegin( ■ ； 0.3nM，InM, 3nM, IOnM, 30nM IOOnM， 300nM), ΕΡ25( O ； 3ηΜ, IOnM, 30ηΜ, IOOnM, 300ηΜ, IOOOnM, 3000ηΜ)和 ΑΡ18( ▲； 0.1 μ Μ, 0.3 μ Μ, 1 μ Μ, 3μ Μ, 10 μ Μ, 30 μ Μ, 100 μ Μ, 300 μ Μ)延長 的纖維蛋白原凝固時間(η = 3)。沒有用凝血酶預溫育肽。ΑΡ18抑制的凝血酶纖維蛋白 原溶解活性而非酰胺分解活性，這提示結合于外位點I。圖5.s_variegin和EP25的抑制常數Ki。(A) S-variegin是凝血酶的快速和緊密結 合抑制劑。S-variegin(O.313ηΜ，0.625nM, 1.25nM, 2.5nM, 5nM, IOnM)與不同濃度 S2238 混合12.5μΜ(·)，25μΜ(〇)，50μΜ( A ), 80 μ M ( ▽ )，100 μ M ( )，150μΜ(+)，200μΜ(Χ)和300μΜ(*)，以確定K1'。反應以添加凝血酶(1.8ηΜ)開 始。將數據適用于方程式(I)Cn = 3)。 (B)K1'針對底物濃度的圖顯示線性曲線，這 說明s-variegin競爭性抑制S2238上的凝血酶酰胺分解活性。通過將數據適用于方程式 (2)，顯示抑制常數K1是 146.4士 13.6pM。 (C)盡管如果用凝血酶預溫育，EP25也抑 制等摩爾濃度的凝血酶，但是在無預溫育條件下的起始抑制很弱。EP25的&在無預溫 育條件下以凝血酶至少8倍的濃度來確定。在這些測定條件下，EP25與凝血酶的結合 不引起自由EP25濃度的顯著減少，因此“緊密結合”條件不被認為用于數據適用。利 用32238(100μΜ)作為底物，由不同濃度的ΕΡ25引起的凝血酶(0.9ηΜ)抑制的進程曲 線7.8ηΜ(·)，12.5ηΜ( □ ), 15.6ηΜ(·), 25ηΜ(〇)，31.3ηΜ( A), 50ηΜ ( V ), 62.5ηΜ(Τ), IOOnM (O )和125ηΜ( )。該進程曲線是非線性的，且顯示兩相均衡的典 型緩慢結合抑制。將數據適用于方程式(3)，以獲得所用的各種ΕΡ25濃度的k(n = 3)。 (D)表觀一級速度常數k針對EP25濃度的圖是由方程式(4)所述的雙曲線，且因此適用 于該方程式以獲得K1' 529.7士76.7pM，這代表最初碰撞復合物(initial collision complex) EI的解離常數。總抑制常數K1由方程式(5)計算，并發(fā)現是 149.8士30.5pM。圖6.由凝血酶引起的s-variegin和EP25的裂解。(A)在37 °C由凝血酶裂 解的s-variegin的HPLC分析的典型色譜圖。(i)在溫育=0分鐘，單峰對應于未 裂解的s-variegin。 (ii) 30分鐘溫育后，2個新的峰似乎對應于團塊(mass) 1045 (代 表N端片段SDQGDVAEPK (SEQ ID NO 2))和團塊2582 (代表C端片段 MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (SEQ ID NO 3))的裂解產物，而未裂解的 s-variegin 的 量減少。Gii)裂解在180分鐘溫育后幾乎完成。(B)在室溫下，用凝血酶(5 μ Μ)溫育 s-variegin(150 μ Μ)不同的時間(η = 2)。s-variegin以凝血酶的30倍過量存在。由凝 血酶引起的s-variegin裂解使用RP-HPLC分析。未裂解的s-variegin (轉、團塊1045 (代 表N端片段SDQGDVAEPK) (SEQ ID NO 2)的裂解產物(S )和團塊2582 (代表C端片 段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES) (SEQ ID NO 3)的裂解產物(國)的相對百分比由峰 下面積計算。(C)在室溫下用凝血酶(3.33nM)溫育s-variegin至多24hr，并在不同的時 間點測定抑制S2238(100yM)上凝血酶酰胺分解活性的能力。(D)進行類似的實驗， 將 s-variegin 替換為 EP25。s-variegin 或 EP25 的濃度IOnM ( ■ )，IOOnM (圓)和 IOOOnM ( □ ) (η = 2)。在IOOnM s-variegin或EP25時，抑制劑也以凝血酶的30倍過量 存在，且因此主要用于與來自HPLC分析的裂解數據進行比較。圖7.比較 variegin 和其他凝血酶抑制劑。(A)n-variegin，s-variegin, EP25, AP18,比伐盧定-1和水蛭素的氨基酸序列比對顯示高度類似的C端序列。N-variegin在 Thr(T)處葡糖基化，比伐盧定-1含有D-Phe(F)且水蛭素在Tyr(Y)處硫酸化。TTI的 序列與variegin明顯不同，且沒有比對。(B)顯示不同類型的凝血酶抑制劑及其結構特征 的示意圖。G)水蛭素致密N端結合活性位點，酸性和延長的C端結合外位點I ； (ii) rhodniin 以頭-尾排列的2個Kazal類型結構域，其N端結構域結合活性位點且C端結構 域結合外位點I ； (iii) ornithodorin 以尾-尾排列的2個Kunitz類型結構域，其N端結構 域結合活性位點且C端結構域結合外位點I ； (iv) haemadin 致密N端結構域結合活性位 點，酸性和延長的C端結合外位點II; (v)triabin 單β _桶狀結構域結合外位點I ； (vi) bothrojaracin C型凝集素結構域的2個不同的鏈分別結合外位點I和外位點II。沒有描述其他原型凝血酶抑制劑諸如theromin和TTI，因為缺乏詳細的結構信息。(C)提議的關 于EP25與凝血酶的結合機制(i)C端上的靜電電荷將EP25指引到凝血酶并隨后提供特 定范圍的相互作用，(ii)在無N端殘基(SDQGDVA(SEQIDNO 18))的指引作用的條件 下，活性位點結合部分不適當定向以適合凝血酶活性位點，因為最初碰撞復合物(EI)具 有較高的K1,且(iii)在緩慢的步驟中，活性位點結合部分(EPKMHKT(SEQIDN019)) 采用對于最適結合和形成穩(wěn)定復合物的正確構象。(D)提議的關于variegin與凝血酶的結 合機制(i) variegin N端和凝血酶外位點II之間以及variegin C端和凝血酶外位點I之間 的互補靜電電荷將variegin指引到凝血酶，(ii)所有的靜電相互作用迅速發(fā)生并預定向處 于正確構象的活性位點結合部分(EPKMHKT(SEQ ID NO 19))，以快速結合凝血酶活性 位點。圖8.遵從Michaelis-Menton方程式，作為底物(S2238)濃度函數的反應速度
(Vmax)的圖。確定用Michaelis-Menton方程式計算的Km為3.25士0.56 μ Μ,這與報告值
33,圖9.溶解在 IOmM 磷酸鈉緩沖液(pH7.4)中的 n-variegin，s-variegin，EP25 和 AP18的遠-UV光譜(260-190nm)。所有光譜均是典型的無規(guī)卷曲蛋白。

圖10.RP-HPLC分析顯示s_variegin在37°C和室溫下被凝血酶裂解。(A)在37°C 用凝血酶(5 μ Μ)溫育s-variegin (150 μ Μ)不同的時間(η = 2)。 (B)在室溫下用凝血 酶(5 μ Μ)溫育S-variegin (150 μ Μ)不同的時間(η = 2)。未裂解的s-variegin (□)、團塊 1045 (代表N端片段SDQGDVAEPK) (SEQID NO 2)的裂解產物(S )和團塊2582 (代 表C端片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES) (SEQ ID NO 3)的裂解產物(圓)的相對百 分比由色譜圖中的峰下面積計算。圖 11 .variegin 的 C 端片段 MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (MH22) (SEQ ID NO
3)的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的MH22在室溫下用凝血酶溫育Omin( ■), IOmin( · )，20min( ▲ )，30min (▼)，120min( )，1080min(+)或 1680min(X)后， 利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。圖12.MH22的酰胺分解活性減小的逆轉。在使用凝血酶的延長溫育(1680min預 溫育，IC5tl = 479.7士 16.1nM)后MH22的酰胺分解活性的減小可以通過在測定設置中包 括增加濃度的 BSA(lmg/ml( ■ )，5mg/ml( · )，10mg/ml) ( ▲)來逆轉。圖13.MH22的Ki。MH22在不同濃度的底物(S2238)的K1'通過描述快速和 緊密結合的方程式確定。K1'在所用的濃度范圍(12.5nM-200nM)始終沒有顯著改變， 這說明MH22是凝血酶酰胺分解活性的非競爭性抑制劑。K1' =K1且發(fā)現平均K1是 13.2 士 0.91nM。圖14.variegin突變片段EP25A22E的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的具有序 列 EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (SEQ ID NO 7)的 EP25A22E 在室溫下用凝血酶溫 育Omin ( ■ )，20min( ·)或30min( ▲)后，利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血 酶酰胺分解活性的能力。在EP25A22E中，s-variegin中的丙氨酸22 (EP25中的丙氨酸 15)被替換為谷氨酸，因為谷氨酸存在于水蛭素的相同位置。圖15.EP25A22E的Ki。EP25A22E的K1利用緩慢結合抑制劑方程式確定并發(fā)現 是 0.311 士0.070nM。
圖16.variegin突變片段MH22A22E的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的具有序 列 MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (SEQ ID NO 5)的 MH22A22E 在室溫下用凝血酶溫育 Omin( ■)或20min( ·)后，利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性 的能力。MH22A22E是EP25A22E的C端裂解片段。圖 17.MH22A22E 的 Ki。當用 100 μ M 底物(S2238)檢測時，ΜΗ22Α22Ε 具有 15.1 士 1.04ηΜ 的 K1'。圖18.variegin片段EP21的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的 EP21EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 8)在室溫下用凝血酶溫育 Omin( ■)， 20min( ·)或30min( ▲)后，利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性 的能力。EP21對應于EP25，只是其在C端缺少4個殘基圖19.EP21的Ki。 發(fā)現通過緩慢結合方程式確定的EP21的Ki是 0.315 士 0.024nM。圖20.variegin片段MH18的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的 MH18MHKTAPPFDFEAIPEEYL(SEQ ID NO 20)在室溫下用凝血酶溫育 Omin( ■)或
20min(·)后，利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。MH18 對應于MH22，只是其在C端缺少4個殘基。圖21.MH18的Ki。利用快速和緊密結合方程式，在100 μ M底物(S2238)時， ΜΗ18的Ki，= 14.9士3.50nM。假設在C端除去4個殘基不改變抑制機制，則MH18也 是具有K1= 14.9 士 3.50nM的非競爭性抑制劑。圖22.variegin片段DV24的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的DV24DVAEPKM HKTAPPFDFEAIPEEYL (SEQ ID NO 9)在室溫下用凝血酶溫育 Omin ( ■)或 20min( ·)
后，利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。DV24對應于 EP21,只是其在N端含有另外3個殘基。圖 23.DV24 的 Ki。DV24 的 Ki，在 100 μ M 底物(S2238)時=9.74士0.91ηΜ， 且確定 DV24 的 K1 是 0.306 士0.029ηΜ。圖24.variegin突變片段DV24K10R的凝血酶抑制活性。評估不同濃度的DV24K IOR DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL (SEQ ID NO 10)在室溫下用凝血酶溫育 Omin ( ■) 或20min( ·)后，利用活性位點定向的底物S2238抑制凝血酶酰胺分解活性的能力。 DV24K10R對應于DV24，只是其在位置6處含有精氨酸而非賴氨酸(氨基酸10是 variegin)。圖 25.DV24K10R 的 Ki。確定 DV24K10R 的 K1 是 0.259士0.015nM。圖26.用于顯示[3H]_Variegin劑量溶液的HPLC放射色譜圖。圖27.在將[3H]-Variegin單一靜脈內施用于雄性白化病大鼠(0.4mg/kg)后30分 鐘時組織內的放射性分布。水平1-5表示穿過大鼠身體的連續(xù)Icm的縱切面。 圖28.在將[3HhVariegin單一靜脈內施用于雄性白化病大鼠(0.4mg/kg)后1小 時時組織內的放射性分布。水平1-5表示穿過大鼠身體的連續(xù)Icm的縱切面。圖29.在將[3HhVariegin單一靜脈內施用于雄性白化病大鼠(0.4mg/kg)后30分 鐘時腎內的放射性分布。實施例
實施例1 分析 variegin 和 EP25材料和方法材料人檸檬酸鹽血漿由斯洛伐克心血管病研究所(Slovak Institute ofCardiovascular Diseases)的血液學禾口輸血學部(Department of Hematologyand Transfusiology)提供。 Thromboclotin 試劑來自 Dade AG (Dudingen,瑞士)。促凝血酶原激酶(Thromboplastin) IS
試劑和肌動蛋白FS活化PTT試劑來自Dade國際公司(邁阿密，佛羅里達)。9-芴基甲 氧羰基(Fmoc)-L-氨基酸、Fmoc-PEG-PS支持樹脂、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、處 于DMF中的20% ν/ν哌啶、0-(7_氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，-3-四甲基uranium 六氟磷酸酯(HATU)和N，N-二異丙基乙胺(DIPEA)來自AppliedBiosystems(應用生物 系統)(Foster City，加利福尼亞)。三氟乙酸(TFA)、1，2-乙烷二硫醇、苯硫基甲烷、 牛胰凝乳蛋白酶和牛血清清蛋白(BSA)來自Sigma Aldrich (西格瑪奧德里奇)(St.Lauis， 密蘇里州)。人纖維蛋白原，FXIIa，組織纖維蛋白溶酶原活化劑(TPA)，尿激酶，激 肽釋放酶和牛胰蛋白酶來自MerckChemicals Ltd.(默克化學制品公司)(Nottingham，英 國)。人類因子IXa(FIXa)，因子Xa(FXa)，因子XIa(FXIa)，APC和纖維蛋白溶酶來 自 Hematologic Technologies, Inc.(血液學技術公司)(Essex Junction,佛蒙特州)。人類 因子 VIIa(FVIIa)和重組 α-凝血酶是來自 Chemo-Sero-TherapeuticResearchInstituteUt 學-血清學-治療研究所)(KAKETSUKEN，日本)21，22的禮物。發(fā)色底物S2222， S2238, S2251, S2288, S2302, S2366, S2444, S2586 和 S2765 來自 Chromogenix(米 蘭，意大利)。Spectrozyme FIXa 來自 American Diagnostica Inc.(美國診斷公司)(斯 坦福，康涅狄格州)。使用的所有其他化學制品和試劑均是分析等級的。唾液腺提取和蛋白質濃度評估先前描述了彩飾花蜱(A.variegatUm)SGE提取程序和分餾過程中蛋白質濃度的評
估23。variegin同種型的純化Variegin 通過使用 Beckman Instruments(貝克曼儀器)126/168 DADHPLC 系統 (Fullerton,加利福尼亞)的三步反相HPLC程序純化。在第一步中(圖1A)，將SGE加 載到 Vydac C-4(5ym ； 250x4.6mm)柱(Grace Vydac，Hesperia,加利福尼亞)上。利 用Beckman Ultrasphere (貝克曼超球)Ol8 (5 μ m ； 250x4.6mm)柱，對匯集的含有最強 抗凝血劑活性的餾分(圖1A，餾分AV-III)進行第二步(圖1B)。最后，利用Vydac C-18(5ym； 250x4.6mm)柱進一步純化各種餾分，以獲得三種有效抗凝血酶活性的餾 分AV 6/5，AV3/5和AV 5/5 (圖1C-D)。AV 6/5餾分中的主要成分稱為variegin。凝固測定凝血酶時間(TT)，凝血酶原時間(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶時間 (APTT)測定用于SGE和餾分中抗凝固活性的最初篩選。檸檬酸鹽人血漿(50 μ 1)用最 多5 μ 1 SGE或相同體積的150mM NaCl (對照)在37°C預溫育1分鐘。加入相應的試劑 (TT 50 μ 1 Thromboclotin 試齊[J ； PT 100 μ 1 促凝血酶原激酶 IS 試齊[J ； APTT 50 μ 1 肌 動蛋白FS活化PTT加入3min并開始與50 μ 1 20mM CaCl2反應)后，形成血纖蛋白凝塊 所需要的時間利用秒表視覺確定。
在Oxford Hemophilia Centre of Churchill Hospital (丘吉爾醫(yī)院牛津血友病中心)
(牛津，英國)中，檢驗粗SGE和三種餾分(AV 6/5，AV3/5*AV5/5)的活性。TT， PT 和 APTT 利用 MDA-180 分析儀(Organon Teknika Ltd.,劍橋，英國)進行。將 10 μ 1 SGE或含有AV 6/5，AV 3/5和AV 5/5的稀釋餾分加入到290 μ 1血小板不足的血漿中， 混合并在37 °C溫育5分鐘。還利用凝血彈性描記圖分析儀(Thromboelastograph Analyzer) (Haemoscope Inc., Skokie,伊利諾斯州)來驗證活性。將5 μ 1樣品加入到335 μ 1檸檬 酸鹽全血中，溫育5分鐘并在重新石灰化(recalcification)后在TEG上運行樣品。蛋白序列分析AV 6/5, AV 3/5 和 AV 5/5 中存在的蛋白的分子量由 Eurosequence(Groningen，
荷蘭)使用裝備有氮激光(337nm)和無柵延時提取離子源的BIFLEX(Braker-Franzen， Bremen, Germany)基質輔助激光解吸附/離子化反射時間飛行(MALDI-TOF)質譜儀來 確定。部分氨基酸序列通過使用自動化測序儀(494型，Applied Biosystems (應用化學系 統))的N端Edman-降解來確定。AV 6/5的完整序列通過MALDI-MS分析確定。肽合成和純化在應用生物系統先鋒433A 型肽合成儀(Applied Biosystems PioneerModel 433A Peptide Synthesizer)上，利用固相肽合成法合成三種肽(s_variegin，EP25和AP18)。氨 基酸的Fmoc基團通過DMF中的20% ν/ν哌啶去除并利用HATU/DIPEA原位中和化學偶 聯。所有的肽在預加載的PEG-PS樹脂上合成。由TFA/1，2-乙烷二硫醇/苯硫基甲烷/ 水的混合物引起的裂解釋放肽酸(-COOH)。合成的肽通過在使用SunFire C18 (5 μ m ；
250mmxl0mm) (Waters, Milford,馬薩諸塞州)柱的AkTAtm 純化儀(GEHealthcare (GE
衛(wèi)生保健)，Uppsala,瑞典)上RP-HPLC純化。所有肽的純度和質量均通過利用 Perkin-Elmer Sciex API 300LC/MS/MS 系統(Perkin-Elmer Sciex, Selton,康涅狄格)的 電噴離子化質譜法(ESI-MS)確定。圓形二色性(CD)光譜法利用Jasco J-810偏振分光計(Easton，馬里蘭)記錄溶解在IOmM磷酸鈉緩沖液 (pH 7.4)中的 variegin，s-variegin，EP25 和 AP18 的遠-UV CD 光譜(260_190nm)。所有 的測量在室溫下利用0.1cm徑長的小管，以50nm/min掃描速度，0.2nm的分辨率和2nm 的帶寬進行。抑制凝血酶酰胺分解活性關于S2238上的凝血酶酰胺分解活性的所有測定均在96-孔微滴定板中，含有 IOOmM NaCl和lmg/ml BSA的50mM Tris緩沖液(pH 7.4)中，室溫下進行。典型地， 在添加100 μ 1 S2238前，對100 μ 1肽和100 μ 1凝血酶預溫育不同的期間。使用ELISA 板讀數器，在405nm觀察形成有色產物對-硝基苯胺的速度10分鐘。百分比抑制通過 將缺乏抑制劑條件下吸光度的增加率作為0%來計算。利用Origin software(原點軟件) (MicroCal, Northampton,馬薩諸塞州)擬合劑量-響應曲線，從而計算IC5tl值。確定抑制常數K1利用S2238作為底物確定抑制常數&。當酶受到等摩爾濃度的抑制劑抑制時， 抑制劑與酶的結合導致自由抑制劑濃度的顯著減小。該緊密結合抑制通過以下方程式24 描述
權利要求
1.抑制凝血酶活性的方法，其通過使凝血酶暴露于與凝血酶上的外位點I和活性位點 相互作用的一種或多種分子進行。
2.按照權利要求1的方法，其中所述一種或多種分子與凝血酶上的全部外位點I、外 位點II和活性位點相互作用。
3.按照權利要求2的方法，其中所述一種或多種分子在凝血酶活性位點前與外位點I 和外位點II相互作用。
4.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述一種或多種分子在以酰胺分解測定評估 時，具有小于ΙΟηΜ，優(yōu)選小于9nM，小于8nM，小于7nM，小于6nM，小于5nM，小 于4nM，小于3nM，小于2nM或小于InM的IC5tl。
5.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述一種或多種分子在以酰胺分解測定評估 時，具有小于200pM，優(yōu)選小于150pM，小于ΙΟΟρΜ，小于50pM，小于30pM，小于 25pM,小于 20pM,小于 15pM 的 Ki。
6.按照權利要求1-5中任一項的方法，其中所述一種或多種分子特異性抑制凝血酶。
7.按照權利要求1-6中任一項的方法，其中所述一種或多種分子具有無規(guī)卷曲結構。
8.按照權利要求1-7中任一項的方法，其中所述分子是具有氨基酸序列SDQGDVAE PKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (SEQ ID NO 1)的 variegin 蛋白或所述 variegin 蛋白的 功能等價物。
9.按照權利要求8的方法，其中所述variegin蛋白的功能等價物是具有氨基酸序列S DQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDHS (SEQ IDNO 4)的變體。
10.按照權利要求9的任一項的方法，其中所述variegin蛋白的功能等價物是具有選自 以下的氨基酸序列的所述variegin蛋白的片段或所述variegin蛋白變體的片段MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (MH22) (SEQ ID NO 3)； MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (MH22A22E) (SEQ ID NO 5)； EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (EP25) (SEQ ID NO 6)； EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (EP25A22E) (SEQ ID NO 7)； EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (EP21) (SEQ ID NO 8)； MHKTAPPFDFEAIPEEYL (MH18) (SEQ ID NO 20)； DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24) (SEQ ID NO 9)； DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24K10R) (SEQ ID NO 10)； SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (SEQ ID NO 11)； SDQADRAQPKLHRNAPQGDFEAIPDEYL (SEQ ID NO 12)； SDQSGRAQPKLPRNAPQGDFEAIPDEYL (SEQ ID NO 13)； SDQGDVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD (SEQ ID NO 14)； 禾口SDQADVAEPKMHKTAPPGDFEAIPEEYLD (SEQ ID NO 15)。
11.按照權利要求1-10的任一項的方法，其中所述方法在體外執(zhí)行。
12.按照權利要求1-10的任一項的方法，其中所述方法在體內執(zhí)行。
13.按照權利要求12的方法，其中執(zhí)行所述方法以治療患有凝血病的患者或預防患者 發(fā)展為凝血病。
14.按照權利要求11或權利要求12的方法，其中執(zhí)行所述方法以診斷與異常凝血酶 累積有關的疾病。
15.按照權利要求12的方法，其中執(zhí)行所述方法以治療患有惡性腫瘤疾病或與惡性腫 瘤疾病有關的病癥的患者。
16.具有氨基酸序列SDQGDVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (SEQ ID NO 1)的 variegin蛋白或其功能等價物與凝血酶的復合物。
17.a)具有氨基酸序列SDQGDVAEPK (SEQ ID NO 2)和 MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (SEQ ID NO 3)的 variegin 蛋白的裂解產物或所述 variegin 蛋白的功能等價物的裂解產物；和b)凝血酶的復合物。
18.凝血酶抑制劑，其中所述凝血酶抑制劑包含所述variegin序列的片段并包含選自 以下的氨基酸序列EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (EP25-活性位點和外位點 I) (SEQ ID NO 6)APPFDFEAIPEEYLDDES (AP18-外位點 I) (SEQ ID NO 16)SDQGDVAEPKMHKT (外位點II結合和活性位點)(SEQ ID NO 17)SDQGDVA (夕卜位點 II) (SEQ ID NO 18)EPKMHKT (活性位點)(SEQ ID NO 19)APPFDFEAIPEEYLDDES (外位點 I) (SEQ ID NO 16)SDQGDVAEPK (裂解產物 1) (SEQ ID NO 2)MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (裂解產物 2 ； MH22) (SEQ ID NO 3) EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (EP21) (SEQ ID NO 8) MHKTAPPFDFEAIPEEYL (MH18) (SEQ ID NO 20) DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24) (SEQ ID NO 9)或其功能等價物。
19.按照權利要求18的凝血酶抑制劑，其由選自以下的氨基酸序列組成 EPKMHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (EP25) (SEQ ID NO 6) APPFDFEAIPEEYLDDES (AP18) (SEQ ID NO 16)SDQGDVA (夕卜位點 II) (SEQ ID NO 18) EPKMHKT (活性位點)(SEQ ID NO 19) APPFDFEAIPEEYLDDES (外位點 I) (SEQ ID NO 16) SDQGDVAEPK (裂解產物 1) (SEQ ID NO 2) MHKTAPPFDFEAIPEEYLDDES (裂解產物 2) (SEQ ID NO 3) MHKTAPPFDFEAIPEEYL (MH18) (SEQ ID NO 20) DVAEPKMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24) (SEQ ID NO 9) 或其功能等價物。
20.按照權利要求18或19的凝血酶抑制劑，其是功能等價物且包含或由選自以下的 氨基酸序列組成EPKMHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (EP25A22E) (SEQ ID NO 7) DVAEPRMHKTAPPFDFEAIPEEYL (DV24K10R) (SEQ ID NO 10)或 MHKTAPPFDFEEIPEEYLDDES (MH22A22E) (SEQ ID NO 5)。
21.凝血酶與按照權利要求18-20中任一項的凝血酶抑制劑的復合物。
22.編碼按照權利要求18-20中任一項的凝血酶抑制劑的核酸分子。
23.包含按照權利要求22的核酸分子的載體。
24.包含按照權利要求22或權利要求23的核酸分子或載體的宿主細胞。
25.制備按照權利要求18-20中任一項的凝血酶抑制劑的方法，其包括在這樣的條件 下培養(yǎng)按照權利要求24的宿主細胞以使得表達蛋白質并回收由此生成的蛋白質。
26.藥物組合物，其包含按照權利要求18-20中任一項的凝血酶抑制劑或按照權利要 求22的核酸分子和藥用載體。
27.治療患有凝血病的患者或預防患者發(fā)展為凝血病的方法，其包括向所述患者施用 治療或預防有效量的按照權利要求18-20中任一項的凝血酶抑制劑。
28.診斷由凝血酶累積引起的疾病或病癥的方法，其包括將按照權利要求18-20中任 一項的凝血酶抑制劑施用于患者或由所述患者分離的組織，和檢測所述與凝血酶結合的 凝血酶抑制劑的存在，其中檢測到所述與凝血酶結合的凝血酶抑制劑是所述疾病或病癥 的指示。
29.按照權利要求28的方法，其中所述疾病或病癥是血纖蛋白或血小板血栓。
30.治療惡性腫瘤疾病或與惡性腫瘤疾病有關的病癥的方法，其包括向有此需要的患 者施用治療有效量的按照權利要求18-20中任一項的凝血酶抑制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及源自食血節(jié)肢動物唾液腺的凝血酶抑制劑，且具體涉及通過與凝血酶在2或3個不同位點相互作用起作用的二價和三價凝血酶抑制劑。
文檔編號A61P7/02GK102026652SQ200880102585
公開日2011年4月20日 申請日期2008年6月18日 優(yōu)先權日2007年6月18日
發(fā)明者R·曼朱納塔·基尼, 瑪麗亞·卡濟米羅娃, 許祖堯 申請人:自然環(huán)境研究會