本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種半抗原化合物及其多克隆抗體、試劑盒與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

烏頭類藥材烏頭堿類化合物為二萜型生物堿，依據(jù)其結(jié)構(gòu)母核上取代基的不同劃分為三類：?jiǎn)熙バ停p酯型和無酯型。單酯型生物堿包括苯甲酰烏頭堿，苯甲酰中烏頭堿，苯甲酰次烏頭堿等，為烏頭類藥材的主要藥效成分之一，其藥理作用主要有抗炎鎮(zhèn)痛，抗心律不齊及抗癲癇等。

烏頭類藥材在臨床應(yīng)用及其廣泛，用于祛風(fēng)散寒、化瘀止血、止痛消腫、溫補(bǔ)腎陽等，是多種復(fù)方藥如云南白藥、小活絡(luò)丸，萬通筋骨片、附子理中丸、附桂地黃丸等的主要成分。為確保用藥安全，臨床上多采用烏頭類藥材的炮制品。但由于炮制方式和程度的不同會(huì)使藥材中單酯型烏頭堿含量有較大的差距，且單酯型烏頭堿在藥材中的含量極低，以至于其質(zhì)量控制較難掌控。同時(shí)作為主要的藥效成分，單酯型烏頭堿的藥代動(dòng)力學(xué)的研究對(duì)于其體內(nèi)毒性和藥效的評(píng)價(jià)也很必要。因此一種能夠簡(jiǎn)單快速檢測(cè)單酯型烏頭堿的方法對(duì)人工在線檢測(cè)藥材質(zhì)量或藥效評(píng)價(jià)是至關(guān)重要的。

據(jù)報(bào)道，現(xiàn)在主要能夠檢測(cè)烏頭堿的方法有HPLC，GC和LC-MS。其中，HPLC無法檢測(cè)含量極低的單酯型烏頭堿，而GC，LC-MS需要及其復(fù)雜的預(yù)處理過程，無法做到簡(jiǎn)單快速的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。基于以上原因，本發(fā)明人曾開發(fā)了一種檢測(cè)雙酯型烏頭堿的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，能夠簡(jiǎn)單快速的測(cè)定不同樣品中雙酯型烏頭堿的含量，與HPLC的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比后發(fā)現(xiàn):檢測(cè)結(jié)果相似度極高，而且酶聯(lián)免疫法的檢測(cè)限更低，靈敏度更好，說明此種方法的可行性極高。

酶聯(lián)免疫法具有無法比擬的技術(shù)優(yōu)勢(shì)：樣品的預(yù)處理簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度極高、靈敏度高，檢測(cè)限度可達(dá)ng甚至pg級(jí)，適合大批量樣品的快速分析。此方法不僅可以開展對(duì)微量痕量中藥成分的定性定量分析，而且能夠?yàn)橹兴幊煞值捏w內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究提供簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)方法。此種方法開發(fā)的基礎(chǔ)是特異性抗體的制備，此種抗體研發(fā)先期投入較大技術(shù)要求較高，但一旦研發(fā)成功，可形成特征性抗體的工程菌株，可成為專有技術(shù)，不僅尋求專利保護(hù)，而且還可以由此開發(fā)出如酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒等市場(chǎng)應(yīng)用型的產(chǎn)品，因而具有良好的應(yīng)用前景和市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的旨在提供一種能夠特異性識(shí)別單酯型烏頭堿的多克隆抗體及其試劑盒與應(yīng)用。

具體地說，本發(fā)明的第一方面是提供了一種半抗原化合物3-戊二?；郊柞Ｐ聻躅^堿，其特征在于，它具有如下結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)：

本發(fā)明的第二方面是提供了一種單酯型烏頭堿的多克隆抗體，由半抗原與牛血清白蛋白的偶聯(lián)物免疫新西蘭兔后獲得，其特征在于，所述半抗原為具有如下結(jié)構(gòu)式(Ⅰ)的3-戊二?；郊柞Ｐ聻躅^堿：

在一優(yōu)選例中，所述3-戊二酰基新烏頭堿可經(jīng)由以下方法制得：

(1)取苯甲酰新烏頭原堿76.8mg與戊二酸酐135.0mg(摩爾比為1:9.1)，吡啶2mL室溫反應(yīng)10h，6ml冰水終止反應(yīng)后，用24ml乙酸乙酯萃取3次，減壓蒸干。取水層60℃旋干，得77.7mg無色膜狀產(chǎn)物。

本發(fā)明的第二方面是提供了上述多克隆抗體在檢測(cè)單酯型烏頭堿中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種試劑盒，所述試劑盒包含上述單酯型烏頭堿的多克隆抗體。

本發(fā)明的單酯型烏頭堿多克隆抗體，具有如下優(yōu)點(diǎn)：

1.本發(fā)明的單酯型烏頭堿多抗可以稀釋320000倍使用，從而降低了成本；

2.本發(fā)明的單酯型烏頭堿多抗的檢測(cè)限為1.15ng，靈敏度較高；

3.本發(fā)明的單酯型烏頭堿多抗特異性強(qiáng)，與雙酯型烏頭堿的交叉反應(yīng)均小于2％，而與烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿無交叉反應(yīng)。

本發(fā)明各個(gè)方面的細(xì)節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求的描述，本發(fā)明的特點(diǎn)、目的和優(yōu)勢(shì)將更為明顯。

附圖說明

圖1為半抗原(AC-GS)的ESI-MS圖譜。

圖2為半抗原(AC-GS)的¹H-NMR圖譜。

圖3為半抗原(AC-GS)的HMBC二維譜。

圖4為半抗原(AC-GS)的HSQC二維譜。

圖5為半抗原(AC-GS)的¹³C-NMR圖譜。

圖6牛血清白蛋白的MALDI-TOFMS圖譜(分子量66431.1Da)。

圖7烏頭堿免疫抗原的MALDI-TOFMS圖譜(分子量79724.3Da)。

圖8單酯型烏頭堿檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件(其中，烏頭堿對(duì)照品購自成都曼斯特生物公司；N,N’-二環(huán)乙基碳化亞胺(DCC)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、TMB、牛血清白蛋白(BSA)以及卵清白蛋白OVA等均購自美國Sigma公司；其他化學(xué)試劑均符合分析標(biāo)準(zhǔn)；新西蘭大白兔2只，雄性，每只體重2.5kg)。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計(jì)。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

本發(fā)明提到的上述特征，或?qū)嵤├岬降奶卣骺梢匀我饨M合。本專利說明書所揭示的所有特征可與任何組合物形式并用，說明書中所揭示的各個(gè)特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特別說明，所揭示的特征僅為均等或相似特征的一般性例子。

實(shí)施例1 半抗原—3-戊二酰基新烏頭堿(AC-GS)的制備及鑒定

1.取苯甲酰新烏頭原堿76.8mg(0.130mmol)與戊二酸酐135.0mg(1.184mmol，摩爾比為1:9.1)，吡啶2mL室溫反應(yīng)10h，6ml冰水終止反應(yīng)后，用24ml乙酸乙酯萃取3次，減壓蒸干。取水層60℃旋干，得77.7mg無色膜狀產(chǎn)物。

2.經(jīng)過ESI-MS、¹³C-NMR、¹H-NMR、HMBC、HSQC二維譜鑒定式Ⅰ化合物化學(xué)結(jié)構(gòu)。ESI-MS測(cè)定儀器：MSD-Trap-XCT，Q-Tof micro(ESI-MS)型質(zhì)譜儀(Agilent公司)，¹H-NMR、¹³C-NMR及HMBC、HSQC測(cè)定均采用AVANCE III-400核磁共振儀(Bruker公司)

3.1.從ESI-MS看出，式Ⅰ化合物分子離子峰m/z信號(hào)為704[M]+，說明反應(yīng)產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量為703，與烏頭堿相對(duì)分子質(zhì)量相比增加114，這與烏頭堿與一分子戊二酸酐單酯化后的產(chǎn)物增加的相對(duì)分子質(zhì)量正好一致，說明戊二酸酸酐已經(jīng)與烏頭堿產(chǎn)生了酯化反應(yīng)(圖1)。

3.2.¹H-NMR譜(圖2)中出現(xiàn)δ_H＝4.98的H，且HMBC譜(圖3)中δ_H 4.94的H與C＝O上的C有相關(guān)性即是發(fā)生反應(yīng)的C上的H，HSQC二維譜(圖4)中δ_H＝4.98對(duì)應(yīng)的δ_C＝71.84，且δ_H＝4.94的H與C₄和C₁₉相關(guān)，推斷戊二酸連接在C₃位置上，即式Ⅰ結(jié)構(gòu)為3-戊二酰基烏頭堿。

¹H-NMR譜(圖2)和¹³C-NMR譜(圖5)的具體解析結(jié)果如表1所示：

表1 H/C譜解析結(jié)果

實(shí)施例2 免疫抗原(AC-GS-BSA)和包被抗原(AC-GS-OVA)的制備

1.準(zhǔn)確稱取3-戊二酰基烏頭堿42.5mg、N-羥基琥珀酰亞胺17.4mg、N,N′-二環(huán)乙基碳化亞胺27.0mg添加至2mL DMF中，置磁力攪拌器上避光室溫?cái)嚢?h。將90.9mg BSA溶于2mL 0.01mol·L^-1PBS(pH7.4)中,然后在攪拌下逐滴加入到上述反應(yīng)液中，于4℃攪拌反應(yīng)過夜。

2.反應(yīng)完畢后將反應(yīng)物用雙蒸水透析72h，冷凍干燥得白色粉末，-20℃保存。

3.采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOFMS)鑒定免疫原偶聯(lián)物(AC-GS-BSA)的偶聯(lián)情況：

MALDI-TOFMs可以直接顯示免疫操作的半抗原數(shù)(Hapten Number)，方法簡(jiǎn)潔快速。

圖6為BSA的MALDI-TOFMS圖譜，由該圖可知BSA的分子量為66431.1Da。

圖7為AC-BSA復(fù)合物的MALDI-TOFMS圖譜，AC-BSA的主峰出現(xiàn)于m/z 75862.0Da附近。

己知BMC-GS的分子量是703，可計(jì)算得到AC-BSA的偶聯(lián)率為13。

計(jì)算公式＝(AC-GS-BSA--BSA)/BMC-GS＝(79724.3/80348.5-66431.1)/703。

4.用相同方法制備包被抗原即3-戊二酰基烏頭堿與雞血清白蛋白的偶聯(lián)物(AC-GS-OVA)。

實(shí)施例3 用免疫抗原免疫新西蘭兔獲得單酯型烏頭堿多抗

一、免疫抗原的配置：BMC-GS-BSA溶液加入弗氏完全佐劑形成白色油包水型的乳濁液。加強(qiáng)免疫時(shí)，將相同濃度的BMC-GS-BSA加入等體積的弗氏不完全佐劑。

二、免疫動(dòng)物：兔子在免疫前單籠飼養(yǎng)7-10天，觀察健康狀況后進(jìn)行免疫。在免疫前耳緣靜脈取血1.5-2mL作為陰性血清。首次免疫時(shí)，每只兔子于脊柱兩側(cè)分6點(diǎn)皮下注射，每隔14天進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫。末次免疫后第7天，兔頸動(dòng)脈取血，分離多克隆抗體血清。

三、免疫監(jiān)控：以免疫前兔血清為陰性對(duì)照，每次加強(qiáng)免疫后7d從兔耳緣靜脈取血1mL，按血清效價(jià)測(cè)定方法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。

采用間接ELISA方法測(cè)定：

(1)將濃度為10μg/ml的包被抗原(BMC-GS-OVA，按實(shí)施例2的方法制備)包被酶標(biāo)板，4℃過夜；

(2)采用洗液洗板后用封閉液進(jìn)行封閉，150μL/孔，37℃孵育1h；

(3)洗液洗板后，每孔加入100μL從1:1000開始倍比稀釋的抗體血清，另用空白血清作陰性對(duì)照，于37℃孵育2h。

(4)洗液洗板，每孔加入稀釋20000的HRP標(biāo)記山羊抗鼠酶標(biāo)二抗100μL，37℃孵育1h；

(5)洗液洗板，每孔加入顯色液100μL，37℃溫箱孵育20min后每孔加入50μL終止液后在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔OD_450nm值。陰性對(duì)照OD₄₅₀值為N，陽性對(duì)照OD₄₅₀值為P。若P/N≥2.1且P-N＞0.2即為陽性，若1.5＜P/N＜2.1為可疑，P/N≤1.5為陰性。

四、血清處理方法：免疫結(jié)束后兔頸動(dòng)脈取血，室溫靜置1h，4℃靜置過夜，待其凝固，略有上清析出時(shí)，3000rpm離心10min，取出上層抗血清。與等量甘油混合后-20℃冰箱保存。

實(shí)施例4 單酯型烏頭堿多抗的純化

1.用50％飽和硫酸銨沉淀：

(1)逐滴加入飽和硫酸銨5ml，前期要等出現(xiàn)的沉淀溶解后再繼續(xù)，直至不再溶解，繼續(xù)加完至50％，放入冰箱，4℃下靜置2h；

(2)將所得血清沉淀物轉(zhuǎn)入離心管中，4℃下10 000r/min離心30min，將上清液棄去，取沉淀物溶于2ml PBS。

2.用33％飽和硫酸銨沉淀：

取上述含沉淀的PBS溶液，逐滴加入1.2ml的飽和硫酸銨至33％，4℃靜置2h，同樣條件下離心，取沉淀物，用1mLPBS溶解沉淀。

實(shí)施例5 單酯型烏頭堿多抗的特性鑒定

一.單酯型烏頭堿多抗的鑒定

(1)蛋白含量測(cè)定：取4ul蛋白標(biāo)品與樣品加入到96孔板的各孔中；每孔加入200ul的BCA工作液，搖晃混勻30s，在37℃孵育30min；冷卻至室溫，使用酶標(biāo)儀在562nm檢測(cè)吸光值；以BSA濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍內(nèi)，根據(jù)各蛋白試樣的校正吸光值，以及樣品稀釋度，計(jì)算出樣品的蛋白濃度為14.98mg/ml。

(2)單酯型烏頭堿抗體的特異性鑒定：系列稀釋烏頭堿,中烏頭堿,次烏頭堿，苯甲酰烏頭堿,苯甲酰中烏頭堿,苯甲酰次烏頭堿，烏頭原堿，中烏頭原堿，次烏頭原堿，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)多抗與其的交叉反應(yīng)：取出2.5μg/ml的包被抗原包被好的酶標(biāo)板，洗液洗板后，加入封閉劑37℃封閉1小時(shí)；洗液洗板后，每孔加入50μL的競(jìng)爭(zhēng)藥物和50μL稀釋到最適濃度的抗體溶液進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)，37℃孵育2小時(shí)；洗液洗板后，加入HRP標(biāo)記羊抗鼠酶標(biāo)二抗，100μL/孔，37℃孵育；洗液洗板后，加底物顯色，100μL/孔，37℃顯色后直接加入2M H₂SO4，50μl/孔；用酶標(biāo)儀測(cè)定終止反應(yīng)后的酶標(biāo)板在450nm處的吸光值。交叉反應(yīng)計(jì)算公式如下：

交叉反應(yīng)(％)＝[IC₅₀(半抗原)/IC₅₀(競(jìng)爭(zhēng)藥物)]×100％

結(jié)果表明(表3)：苯甲酰新烏頭堿(BMC)與單酯型烏頭堿類化合物苯甲酰烏頭堿(BAC)、苯甲酰次烏頭堿(BHC)的交叉反應(yīng)分別為70.28％、143.39％，與雙酯型烏頭堿類化合物烏頭堿(AC)、新烏頭堿(MC)、次烏頭堿(HC)的交叉反應(yīng)為1.19％、1.69％、0.95％，而與烏頭原堿、新烏頭原堿、次烏頭原堿無交叉反應(yīng)。

表3 與其他化合物的交叉反應(yīng)表

實(shí)施例6單酯型烏頭堿酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒的制備及其應(yīng)用

一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成：

(1)預(yù)包被抗原的酶標(biāo)板：用包被緩沖液將包被抗原稀釋成2.5μg/ml，每孔加入100μl，4℃過夜，次日傾去包被液，用稀釋好的洗液洗滌3次，拍干，然后在每孔中加入150μl封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁箔袋密封保存。

(2)單酯型烏頭堿對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品和陰性對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

(3)單酯型烏頭堿多抗

(4)辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔二抗。

(5)抗體稀釋液：0.01M PBS，pH 7.6。

(6)10×濃縮洗液：含有0.5％吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液，pH 7.4。

(7)顯色液A液，顯色液B液。使用前將A液與B液等體積混合。

(8)終止液：2M硫酸溶液。

二、試劑盒的應(yīng)用

(一)檢測(cè)方法

1.樣品前處理

取生附子粉末2.0g，精密稱定，置于塞錐形瓶中，加氨試液3ml，精密加入異丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液50ml，稱定重量，超聲處理30分鐘，放冷，再稱定重量，用異丙醇-乙酸乙酯(1:1)混合溶液補(bǔ)足減少的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液25ml，40℃下減壓回收溶劑至干，殘?jiān)芗尤胍掖蓟旌先芤?ml溶解，濾過即得。用乙醇稀釋成10-50倍的溶液。將上述溶液用PBS稀釋成含10％乙醇的待測(cè)樣品溶液。

2.單酯型烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

將苯甲酰新烏頭原堿標(biāo)準(zhǔn)品用乙醇配制500000-5ng/mL的不同濃度溶液，將上述溶液用PBS稀釋成含10％乙醇的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

3.用試劑盒檢測(cè)

(1)檢測(cè)步驟

取出所需數(shù)量的微孔和所有試劑常溫下放置10min。先分別加50μL各濃度的單酯型標(biāo)準(zhǔn)液以及待測(cè)樣品加到微孔中，再加入50μL的單酯型烏頭堿多抗稀釋液(1：20000)，陽性對(duì)照孔為50μL多抗稀釋液加50μL含10％乙醇的PBS，空白孔為50μL PBS加50μL含10％乙醇的PBS，37℃，孵育120min。倒去孔內(nèi)液體，加入400μl洗液到每個(gè)微孔內(nèi)，輕輕晃動(dòng)數(shù)秒，快速翻轉(zhuǎn)將微孔內(nèi)液體倒盡，向一疊干凈的吸水紙拍幾下，如此重復(fù)操作共洗板3次。加入100μl酶標(biāo)二抗工作液，37℃，孵育60min。倒去孔內(nèi)液體并洗板3次。將顯色A液和顯色B液等量混合配成底物顯色液。每個(gè)微孔加入100μl的底物顯色液，室溫避光顯色15-20min。加入終止液50μl，用酶標(biāo)儀于450nm下測(cè)定吸光度值。

(2)試劑盒重復(fù)性和穩(wěn)定性測(cè)試以及結(jié)果計(jì)算

板內(nèi)精密度測(cè)試：取同一塊酶標(biāo)板上的6個(gè)微孔，用待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

板間精密度測(cè)試：取同一批次的3塊酶標(biāo)板，用待測(cè)樣品進(jìn)行測(cè)試，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

變異系數(shù)的計(jì)算方法：變異系數(shù)(CV)＝測(cè)定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)差與其平均值的百分比。

結(jié)果計(jì)算：以加入雙酯型烏頭堿標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的吸光值為B，不加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的吸光值為B0，B/B0為縱坐標(biāo)，lg(標(biāo)準(zhǔn)品，ng/mL)為橫坐標(biāo)；以ln((B/B0)/(1-B/B0))為縱坐標(biāo)，lg(標(biāo)準(zhǔn)品，ng/mL)為橫坐標(biāo)，如圖8所示，線性方程為Y＝-0.7445x+1.9274，R²＝0.9975。線性范圍為5ng/ml～50μg/ml，檢測(cè)限為1.15ng，靈敏度較高，計(jì)算出生附子藥材中單酯型烏頭堿含量為0.372mg/g(表4和表5)。

表4 板內(nèi)重復(fù)性測(cè)試結(jié)果

本發(fā)明所涉及的多個(gè)方面已做如上闡述。然而，應(yīng)理解的是，在不偏離本發(fā)明精神之前提下，本領(lǐng)域?qū)I(yè)人員可對(duì)其進(jìn)行等同改變和修飾，所述改變和修飾同樣落入本申請(qǐng)所附權(quán)利要求的覆蓋范圍。