本發(fā)明涉及一種孔雀石綠半抗原、抗原、單克隆抗體制備方法及其酶聯(lián)免疫定量檢測(cè)方法，屬于免疫學(xué)范疇。

背景技術(shù)：
孔雀石綠(Malachitegreen，MG)分子式為：C23H25N2Cl，分子量365，電離常數(shù)pK值為6.9。pH值為4.0時(shí)，全部電離，pH值為6.9時(shí)50％電離，pH為7.4時(shí)，有25％電離，pH上升為10.1時(shí)，則不發(fā)生電離。自1993年證實(shí)孔雀石綠具有抗菌殺蟲等藥效以來，許多國(guó)家曾廣泛用作驅(qū)蟲劑和殺菌劑，以殺滅水產(chǎn)動(dòng)物體外的寄生蟲、原生動(dòng)物和魚卵中的霉菌等。在魚類養(yǎng)殖中使用防治魚類的水霉病等。在治療魚體和魚卵體表傳染病的藥物中，很少有其它化學(xué)藥物可與其效果相媲美，特別是治療那些由水霉和多子小瓜蟲引起的疾病。孔雀石綠的抗菌殺蟲機(jī)理是：孔雀石綠在細(xì)胞分裂時(shí)阻礙蛋白肽的形成，使細(xì)胞內(nèi)的氨基酸無法轉(zhuǎn)化為蛋白肽，使細(xì)胞分裂受到抑制，從而產(chǎn)生抗菌殺蟲作用?？兹甘G等進(jìn)入人類或動(dòng)物機(jī)體后，通過生物轉(zhuǎn)化可產(chǎn)生致癌、致畸、致突變等副作用。美國(guó)食品藥品管理局將孔雀石綠作為致癌敏感化合物?？兹甘G對(duì)呼吸系統(tǒng)酶有毒性影響，可導(dǎo)致虹蹲魚和羅非魚的呼吸失調(diào)?？兹甘G可在環(huán)境中長(zhǎng)期存在并對(duì)水生和陸生生物產(chǎn)生毒性。臨床報(bào)道和試驗(yàn)研究都證明孔雀石綠對(duì)多器官有毒性?？兹甘G影響食物的吸收、動(dòng)物生長(zhǎng)和繁殖能力。造成肝、脾、腎和心的病變，皮膚、眼睛、肺部和骨骼的損害。鑒于孔雀石綠的危害性，許多國(guó)家都將孔雀石綠列為水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物。我國(guó)也于2002年5月將孔雀石綠列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》中，禁止用于所有食品動(dòng)物。但由于孔雀石綠的抗菌果較好，價(jià)格便宜，不少業(yè)戶在一段時(shí)間內(nèi)仍可能偷偷使用，在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)的檢查中也屢屢看到孔雀石綠的殘留問題，尤其是河南、湖北等地的水產(chǎn)養(yǎng)殖和水產(chǎn)品運(yùn)輸過程中，孔雀石綠仍在被普遍使用。2002年12月農(nóng)業(yè)部對(duì)農(nóng)牧發(fā)【1999】17號(hào)文《動(dòng)物性食品中獸藥殘留限量》進(jìn)行了重新修訂(235號(hào)公告)其中規(guī)定孔雀石綠為不得檢出。目前對(duì)孔雀石綠的檢測(cè)方法主要有：薄層色譜法、分光光度法、共振瑞利散射法、氣質(zhì)聯(lián)用法、高效液相色譜法和酶聯(lián)免疫法等，目前國(guó)內(nèi)尚無關(guān)于孔雀石綠的系統(tǒng)檢測(cè)方法，該方法的建立為監(jiān)控動(dòng)物源性食品中孔雀石綠殘留提供了技術(shù)支持。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種孔雀石綠半抗原、抗原、單克隆抗體制備方法及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的孔雀石綠半抗原，是式(1)所示化合物：式1本發(fā)明還保護(hù)式(1)所示化合物的制備方法，包括如下步驟：(1)于25mL三角瓶中加入1g對(duì)羥基苯甲醛，2g氯化鋅，溶于20mL無水乙醇中；(2)加入3mLN，N-二甲基苯胺，90℃回流24h，反應(yīng)完畢，減壓去溶劑，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，1/2，v/v)；(3)將其溶于20mL吡啶中，加入琥珀酸酐0.74g(與底物摩爾比為1∶1.2)。在80℃下反應(yīng)20h，反應(yīng)完畢，減壓去溶劑。加入稀鹽酸調(diào)pH值至5左右，加入乙酸乙酯萃取3次。合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，減壓去溶劑，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)。本發(fā)明提供的孔雀石綠抗原，是將式(1)所示化合物和載體蛋白偶聯(lián)得到的偶聯(lián)物。所述孔雀石綠抗原的結(jié)構(gòu)示意圖見圖3。本發(fā)明還保護(hù)所述孔雀石綠抗原的制備方法，包括如下步驟：(1)取10mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中；(2)取15mg二氯乙烷(EDC)用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；(3)稱取載體蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mLPBS(PH7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h；(4)用0.01mol/LPBS4℃透析3d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；(5)分裝，于-20℃保存?zhèn)溆?。常用載體蛋白均可采用，如牛血清白蛋白(BSA)，卵清蛋白(OVA)，人血清白蛋白(HSA)，鼠血清白蛋白(MSA)，甲狀腺蛋白(TG)和血藍(lán)蛋白(KLH)等。所述孔雀石綠抗原可以作為免疫抗原制備孔雀石綠特異性單克隆抗體，也可以作為包被抗原制備酶標(biāo)板。所述抗體具體可為單克隆抗體。式(1)所示化合物、所述孔雀石綠抗原、所述抗體均可應(yīng)用于檢測(cè)孔雀石綠。應(yīng)用孔雀石綠抗原和孔雀石綠單克隆抗體制備得到的酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，是由包被有包被原的酶標(biāo)板；酶標(biāo)二抗；孔雀石綠特異性抗體、孔雀石綠系列標(biāo)準(zhǔn)品、底物顯色液、終止液、濃縮復(fù)溶液、濃縮洗滌液、氧化劑濃縮液、孔雀石綠提取劑、樣品凈化劑組成。本發(fā)明依靠免疫學(xué)、免疫化學(xué)基本原理和殘留分析技術(shù)手段，設(shè)計(jì)、合成小分子目標(biāo)分析物半抗原，并與載體蛋白偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動(dòng)物制備針對(duì)小分子分析物的特異性抗體。利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，定性的檢測(cè)樣本中微量小分子目標(biāo)分析物，具有特異、靈敏、準(zhǔn)確、快速、方便、廉價(jià)等特點(diǎn)。本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)便可行、成本較低，半抗原產(chǎn)率較高。本發(fā)明克服了現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)中對(duì)孔雀石綠樣品預(yù)處理復(fù)雜、耗時(shí)、且需要大量有機(jī)溶劑萃取，以及在檢測(cè)過程中要用到精密昂貴的檢測(cè)儀器而不適于推廣使用等缺點(diǎn)。本發(fā)明的孔雀石綠人工抗原，通過免疫動(dòng)物可產(chǎn)生了針對(duì)孔雀石綠的特異性抗體，用于快速檢測(cè)食品中的孔雀石綠殘留，具有簡(jiǎn)單、快速、處理樣品量大、靈敏度高、特異性強(qiáng)等諸多優(yōu)點(diǎn)。附圖說明圖1為孔雀石綠酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2為孔雀石綠人工半抗原的核磁共振氫譜。圖3為孔雀石綠抗原的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。產(chǎn)率％＝實(shí)際得到的產(chǎn)物的質(zhì)量/理論上得到產(chǎn)物的質(zhì)量×100％。實(shí)施例1、孔雀石綠半抗原的制備和鑒定一、孔雀石綠半抗原的制備(1)于25mL三角瓶中加入1g對(duì)羥基苯甲醛，2g氯化鋅，溶于20mL無水乙醇中；(2)加入3mLN，N-二甲基苯胺，90℃回流24h，反應(yīng)完畢，減壓去溶劑，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，1/2，v/v)；(3)將其溶于20mL吡啶中，加入琥珀酸酐0.74g(與底物摩爾比為1∶1.2)。在80℃下反應(yīng)20h，反應(yīng)完畢，減壓去溶劑。加入稀鹽酸調(diào)pH值至5左右，加入乙酸乙酯萃取3次。合并有機(jī)相，無水硫酸鎂干燥，減壓去溶劑，柱層析純化(乙酸乙酯/石油醚，2/1，v/v)。二、孔雀石綠半抗原的鑒定核磁共振氫譜見圖2。分析結(jié)果表明：新增加的12.0左右的羧基信號(hào)峰以及2.5-3.0之間的兩個(gè)亞甲基峰說明半抗原合成成功。實(shí)施例2、孔雀石綠人工抗原的制備和鑒定一、孔雀石綠抗原的合成(1)取10mg半抗原，溶解于1mL二甲基甲酰胺(DMF)中；(2)取15mg二氯乙烷(EDC)用0.2mL水充分溶解后于加入半抗原溶解液中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A；(3)稱取載體蛋白40mg，使之充分溶解在2.8mLPBS(PH7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h；(4)用0.01mol/LPBS4℃透析3d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；(5)分裝，于-20℃保存?zhèn)溆谩６?、孔雀石綠人工抗原的鑒定按合成孔雀石綠免疫抗原反應(yīng)所用的半抗原、載體蛋白與偶聯(lián)產(chǎn)物的比例，分別進(jìn)行紫外(200～400nm)掃描鑒定，并通過比較三者在同一波長(zhǎng)下的吸光值計(jì)算其結(jié)合比。產(chǎn)物的紫外光譜圖與載體蛋白相比發(fā)生了變化，說明半抗原已經(jīng)與載體蛋白成功偶聯(lián)制得孔雀石綠人工抗原。經(jīng)計(jì)算，孔雀石綠半抗原分子與BSA分子的結(jié)合比為12.8∶1，OVA分子的結(jié)合比為16.2∶1。實(shí)施例3、單克隆抗體制備和靈敏度測(cè)定一、孔雀石綠單抗的制備1、用上述制備出的免疫原(MG-BSA)按100μg/只，以生理鹽水溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6～8周齡Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3天以免疫復(fù)合物100μg/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。2、按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑(PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時(shí)候進(jìn)行全換液。3、細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原(預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其最佳包被濃度和陽性血清稀釋度)包被酶標(biāo)板，加入被測(cè)孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD進(jìn)行顯色反應(yīng)。篩選出的陽性孔再用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法篩選，先將細(xì)胞上清與100μg/mL的孔雀石綠等體積混合，37℃水浴作用30min，再加入到包被好的酶標(biāo)板中。同時(shí)用PBS取代孔雀石綠作對(duì)照，其余步驟同上。若經(jīng)孔雀石綠阻斷后的OD450nm值下降到對(duì)照孔的50％以下，則判為陽性，經(jīng)2～3次檢測(cè)都為陽性的孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。4、將2～3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，凍存；并取8～10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0.5mL/只，7～10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1～2×106/只，7～10日后抽取小鼠腹水，離心取上清，測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆?。二、孔雀石綠抗體的半數(shù)抑制量(IC50)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司。用方陣滴定法確定孔雀石綠包被抗原(載體蛋白為卵清蛋白，制備方法同實(shí)施例2所示)和實(shí)施例3步驟一制備的單抗的工作濃度，孔雀石綠包被抗原的工作濃度為5.0μg/mL，抗血清的工作濃度為1∶32000。用不同濃度的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品溶液做實(shí)驗(yàn)溶液，其濃度如下：0、0.2、0.6、1.8、5.4ng/mL。采用8組平行試驗(yàn)(n＝8)。間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法：用上述工作濃度的抗原包被酶標(biāo)板，將實(shí)驗(yàn)溶液與抗體溶液同時(shí)加入酶標(biāo)板小孔中，同時(shí)設(shè)置空白孔(將添加的抗體溶液換成高純水，其它一致)和陰性對(duì)照孔(將添加的實(shí)驗(yàn)溶液用PBS溶液代替，其它一致)，37℃溫育0.5h，倒出孔內(nèi)液體，用洗滌液洗滌3～5次，將酶標(biāo)板倒置在吸水紙上拍打；加入酶標(biāo)二抗溶液于酶標(biāo)板小孔中，37℃溫育0.5h，用洗滌液重復(fù)洗3～5次，吸干；加入底物顯色溶液到酶標(biāo)板小孔中，室溫下反應(yīng)10～15min，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450nm處測(cè)定OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠實(shí)驗(yàn)溶液濃度的log10值為橫坐標(biāo)，繪制半對(duì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。結(jié)果如下：吸光度值與每孔所加入的標(biāo)準(zhǔn)品溶液中孔雀石綠的濃度成反比；標(biāo)準(zhǔn)曲線具有完整的反S形狀，并具有上平臺(tái)和下平臺(tái)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的平行測(cè)定次數(shù)8次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(變異系數(shù))均在15％以內(nèi)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出半數(shù)抑制量(IC50)，比較檢測(cè)靈敏度。抑制率用以下式計(jì)算：式中：ODmax：為不加標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)的吸光值，ODx為標(biāo)準(zhǔn)品x時(shí)的吸光值，ODmin為空白對(duì)照孔的吸光值。由上述公式計(jì)算得孔雀石綠抗體在緩沖液中的半數(shù)抑制量(IC50)為0.495ng/mL。實(shí)施例4、檢測(cè)孔雀石綠的酶聯(lián)免疫試劑盒及其制備一、酶聯(lián)免疫試劑盒由下述物質(zhì)組成：1、包被孔雀石綠與包被抗原(MG-OVA)的酶標(biāo)板；2、抗體工作液：實(shí)施例3中所述單克隆抗體?？贵w工作液是用洗滌工作液對(duì)實(shí)施例3中的純化單克隆抗體稀釋成1∶64000的工作濃度得到的；3、孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品：以常規(guī)方法將孔雀石綠純品用含有10％甲醇的0.05mmol/L，pH＝7.4的PBS配制成濃度分別為0、0.2、0.6、1.8、5.4ng/mL的孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液，所述百分比為體積百分比；4、酶標(biāo)二抗：酶標(biāo)羊抗鼠抗體為辣根過氧化酶-羊抗鼠IgG原液，使用時(shí)用抗體工作液以1∶10的體積比例進(jìn)行稀釋得到的工作液；5、底物顯色液：由A液和B液組成，A液配方為每1000mL去離子水中加入過氧化脲1g，檸檬酸10.3g，Na2HPO4·12H2O35.8g，吐溫-20100μL，調(diào)至pH＝5；B液配方為每1000mL去離子水中加入四甲基聯(lián)苯胺700mg，10.3g檸檬酸，調(diào)至pH＝2.6；6、終止液：以常規(guī)方法配制濃度為2mol/L的硫酸溶液；7、洗滌液：每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的：將10mL吐溫20、5g疊氮化鈉和990mL磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0.01MpH值為7.4；8、濃縮復(fù)溶液：pH值為7.4，含有10％卵清蛋白、0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為質(zhì)量百分比；9、樣本凈化劑：固體堿性氧化鋁可直接使用；10、樣本提取劑：稱取5g無水乙酸鈉，加入去離子水溶解，最后定容至100mL；11、氧化劑濃縮液：稱取0.5g高錳酸鉀，用5％雙氧水溶液溶解，最后定容至100mL。二、試劑盒組分的制備包被有包被原的酶標(biāo)板及其制備包被有包被抗原(MG-OVA)的聚苯乙烯酶標(biāo)板：用10mM的碳酸鹽溶液將抗原作1∶50000倍稀釋(5.0μg/mL)，包被96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，每孔100μL，37℃溫育2h，傾去包被液，用洗滌液洗滌3次，每次10s，拍干，然后在每孔中加入150μL封閉液，37℃溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。包被緩沖液：pH值為9.6，0.05mol/L的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液；封閉液：pH值為9.2，含有5％小牛血清、體積百分比為0.2％吐溫-20、0.2mol/L的碳酸鹽緩沖液，所述百分比為體積百分比。三、試劑盒檢測(cè)方法(一)羅非魚樣品前處理用均質(zhì)器均質(zhì)組織樣本，稱取2.0±0.05g均質(zhì)物至50mL聚苯乙烯離心管中，加入1.9mL4％三氯乙酸溶液，用渦旋儀渦動(dòng)5min，加入4mL乙腈，再加入100μL孔雀石綠提取劑，渦動(dòng)振5min，靜置10min，3000g以上，室溫(20-25℃)離心10min，取出2mL上清液至50mL聚苯乙烯離心管中，加入2mL乙腈，加入100μL孔雀石綠氧化劑，輕輕振蕩混勻，室溫靜置20min，加入3g無水硫酸鈉，再加入0.2g樣本凈化劑，渦動(dòng)振蕩5min，3000g以上，室溫(20～25℃)離心10min，取上清液2mL上清液至10mL干凈的玻璃試管中，于50～60℃水浴氮?dú)饬飨麓蹈?0min，加入500μL復(fù)溶液渦動(dòng)溶解，取50μL用于分析。(二)用試劑盒檢測(cè)1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μL到對(duì)應(yīng)的微孔中，向已加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本的微孔板種加入混合好的抗體/酶標(biāo)記二抗混合液50μL/孔。輕輕振蕩酶標(biāo)板使微孔內(nèi)液體混合均勻后用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)30min，小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250μL/孔，充分洗滌4～5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干，加入底物液A液50μL/孔，再加底物液B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中顯色15min，加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處，測(cè)定每孔OD值。用每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100％，得到百分吸光度值。以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的半對(duì)數(shù)值為x軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。百分吸光度值(％)＝(B/B0)×100％2、樣品中孔雀石綠濃度的測(cè)定用每個(gè)檢測(cè)樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100，得到百分吸光度值。相對(duì)應(yīng)每一個(gè)檢測(cè)樣本溶液的百分吸光度值，則可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出檢測(cè)樣本溶液的吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度值換算出樣本溶液中孔雀石綠的殘留量。四、試劑盒檢測(cè)效果評(píng)價(jià)(一)最低檢測(cè)限試驗(yàn)對(duì)空白羅非魚樣本各重復(fù)測(cè)定20次得到樣本的測(cè)定值結(jié)果，根據(jù)結(jié)果計(jì)算最低檢測(cè)限。結(jié)果見下表1。最低檢測(cè)限＝x+3sx為空白樣品濃度平均值，s為空白樣品濃度標(biāo)準(zhǔn)差。表1空白雞肉樣本測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表μg/kg由上表檢測(cè)結(jié)果可知，空白羅非魚樣本的最低檢測(cè)限為0.46μg/kg。(二)準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)向不含孔雀石綠的羅非魚樣品中添加孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品，使孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品在樣品中的終濃度分別為1、2、4μg/kg；將添加后的樣品分別按照實(shí)驗(yàn)三中所述方法進(jìn)行前處理，得到檢測(cè)樣本溶液。從三個(gè)不同批次的試劑盒中各抽取3個(gè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法如實(shí)驗(yàn)三中所述，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，分別計(jì)算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表2。表2準(zhǔn)確度和精密度試驗(yàn)結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)：同一次測(cè)定中各平行樣本的變異系數(shù)。批間變異系數(shù)：同一樣本在不同批次測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)，取其平均值。結(jié)果表明：所有樣品的添加回收率在70.3～89.6％，批內(nèi)變異系數(shù)在4.1～11.3％，批間變異系數(shù)在6.2～9.7％。(三)試劑盒保存期試劑盒保存條件為2～8℃，經(jīng)過15個(gè)月的測(cè)定，試劑盒的最大吸光度值(0標(biāo)準(zhǔn))，50％抑制濃度、孔雀石綠添加實(shí)際測(cè)定值均在正常范圍之內(nèi)。考慮到運(yùn)輸和使用過程中，會(huì)有非正常保存條件出現(xiàn)，將試劑盒在37℃保存的條件下放置20天，進(jìn)行加速老化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該試劑盒的各項(xiàng)指標(biāo)完全符合要求?？紤]到試劑盒冷凍情況發(fā)生，將試劑盒放入-20℃冰箱冷凍15天，測(cè)定結(jié)果也表明試劑盒各項(xiàng)指標(biāo)完全正常。從以上結(jié)果可得出試劑盒可以在2-8℃至少可以保存12個(gè)月以上。(四)交叉反應(yīng)率試驗(yàn)選擇相應(yīng)的物質(zhì)進(jìn)行交叉反應(yīng)試驗(yàn)，通過各種標(biāo)準(zhǔn)曲線分別得到其50％抑制濃度(IC50)。用下式計(jì)算試劑盒對(duì)其它類似物的交叉反應(yīng)率：表3試劑盒的特異性藥物名稱交叉反應(yīng)率(％)孔雀石綠100結(jié)晶紫120隱形孔雀石綠100隱形結(jié)晶紫115磺胺二甲基嘧啶＜0.1氯霉素＜0.1四環(huán)素＜0.1紅霉素＜0.1恩諾沙星＜0.1實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明試劑盒對(duì)孔雀石綠、結(jié)晶紫、隱形孔雀石綠、隱形結(jié)晶紫均具有較高的交叉反應(yīng)率，而對(duì)磺胺二甲基嘧啶、氯霉素、四環(huán)素、紅霉素、恩諾沙星等藥物的交叉反應(yīng)率很低，特異性良好，即本發(fā)明試劑盒可以用于檢測(cè)羅非魚體內(nèi)2種孔雀石綠和2種結(jié)晶紫殘留總量。