專利名稱：一種檢測水產(chǎn)中孔雀石綠的免疫膠體金試劑板的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于水產(chǎn)中藥物殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測水產(chǎn)中孔雀石 綠的免疫膠體金試劑板。
背景技術(shù)：
孔雀石綠(MG)是一種三苯甲烷類染料，由苯甲醛和N，N-二甲基苯胺在鹽酸或 硫酸中縮合生成四甲基代二氨基三苯甲烷的隱性堿體后，在酸介質(zhì)中被二氧化鉛秘氧化制 得。因其氯化電位勢與組成酶的某些氨基酸相近，從而通過競爭作用阻礙蛋白肽的形成，可 用作抗菌殺蟲藥。孔雀石綠曾被廣泛用于預(yù)防與治療各類水產(chǎn)動物的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病 等。然而孔雀石綠具有高毒素、高殘留、高致癌和高致畸性。孔雀石綠進入人類或動物機體 后，可以通過生物轉(zhuǎn)化，還原代謝成脂溶性的隱性孔雀石綠，毒性高于孔雀石綠，嚴(yán)重威脅 人類身體健康。同時，孔雀石綠的殘留還嚴(yán)重影響了我國水產(chǎn)品的對外出口，給我國水產(chǎn)品 出口貿(mào)易帶來了巨大壁壘。歐盟、美國已宣布禁止其在經(jīng)濟魚類(觀賞魚除外)養(yǎng)殖過程中使用。2002年12 月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第235號公告《動物性食品中獸藥殘留最高限量》將孔雀石綠列為禁止使用 藥物，在動物性食品中不得檢出。目前，水產(chǎn)中孔雀石綠殘留常用的檢測方法主要有儀器法和免疫分析法。儀器法 有高效液相色譜法(HPLC)、液-質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、氣-質(zhì)聯(lián)用法、薄層色譜法、普通分光光度 法等。2005年9月我國質(zhì)檢總局、國家標(biāo)準(zhǔn)委共同發(fā)布實施了 GB/T 19857-2005《水產(chǎn)品 中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測定》國家標(biāo)準(zhǔn)，要求孔雀石綠及其代謝物在水產(chǎn)中的檢出 率不得超過1克/1000噸(Ippb)。該標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了水產(chǎn)品中孔雀石綠及其代謝物隱性孔雀石 綠、結(jié)晶紫及其代謝物隱性結(jié)晶紫殘留量的液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜和高效液相色譜的測定方 法，液相色譜_串聯(lián)質(zhì)譜法檢測限為0. 5ppb，高效液相色譜法檢測限為2ppb。儀器法特異 性好、準(zhǔn)確率高，但由于對設(shè)備、環(huán)境、操作技能等存在一定的要求，檢測周期長，不利于大 規(guī)模樣本篩選。免疫分析法有酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)膠體金免疫層析法(GICA)。酶聯(lián)免 疫吸附法檢測量大，操作相對簡單，但是該法同樣需要實驗室設(shè)備輔助，分析時間較長，具 有一定局限性。膠體金免疫層析法(GICA)是80年代繼三大標(biāo)記技術(shù)(熒光素、放射性同位素和 酶)后發(fā)展起來的固相標(biāo)記免疫測定技術(shù)。應(yīng)用層析式抗體免疫競爭原理，特異性檢測樣 品中的有毒有害物質(zhì)殘留，靈敏度高，成本低，操作簡便快速，無需特殊設(shè)備輔助。國內(nèi)外市場上提供檢測水產(chǎn)中孔雀石綠藥物殘留的ELISA產(chǎn)品應(yīng)用較廣，靈敏度 多在0. 5-2ppb。而操作更簡便，成本更低的GICA產(chǎn)品市場認(rèn)知度較低，靈敏度為2ppb，遠(yuǎn) 不能滿足當(dāng)前檢測需求。因此，研制開發(fā)一種檢測限符合要求，重現(xiàn)性好，檢測時間短，適合 現(xiàn)場快速檢測，技術(shù)產(chǎn)品或儀器設(shè)備成本較低，運行費用低的快速檢測試劑勢在必行。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的在于針對現(xiàn)有檢測技術(shù)的不足，提供一種靈敏度高、特異性強、 操作簡便快捷、不需要特殊儀器設(shè)備輔助、生產(chǎn)成本低的孔雀石綠免疫膠體金快速檢測試 劑板。本實用新型試劑板由塑料模板上下板、背襯及粘附在背襯上依次緊密相連的樣品 墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成。其中樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜 和吸水墊相鄰各部分間有l(wèi)_2mm的重疊，其目的一方面是保證層析作用從樣品墊到吸水墊 部位順利進行，另一方面是為了使樣品溶液與樣品墊有充分反應(yīng)時間，樣品墊上的緩沖體 系可以中和樣品溶液的酸堿度，保證樣品溶液中的有效成分與膠體金結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體 順利發(fā)生反應(yīng)。膠體金結(jié)合墊上包被有抗孔雀石綠單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物；硝酸纖維素膜 上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有孔雀石綠-載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為 檢測線和質(zhì)控線。偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白可為牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)或者 血藍(lán)蛋白(KLH)。本實用新型所描述的試劑板的各部分組成成分與功能如下塑料模板，起固定試紙條及標(biāo)示功能區(qū)(加樣孔、檢測區(qū)、控制區(qū))的作用背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組 成部分的作用。樣品墊由玻璃纖維制成，起吸收樣品溶液與緩沖樣品溶液pH值的作用。膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，其上標(biāo)記有抗孔雀石綠單克隆抗體與膠體金的結(jié)合 物，是樣品溶液中的有效成分與金標(biāo)抗體發(fā)生反應(yīng)的場所。硝酸纖維素膜部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。吸水墊為濾紙，作為吸水部分其作用是將移動上來的多余的溶液吸收。本實用新型試劑板具有如下有益效果(1)特異性好。本實用新型試劑板的抗孔雀石綠單克隆抗體對孔雀石綠、隱性孔雀 石綠、結(jié)晶紫、隱性結(jié)晶紫的交叉反應(yīng)率均為100%，與其他種類的抗生素包括氟喹諾酮類、 氯霉素、硝基呋喃類、磺胺類藥物的交叉反應(yīng)率< 0. 1%。(2)靈敏度高。2002年12月農(nóng)業(yè)部發(fā)布第235號公告《動物性食品中獸藥殘留最 高限量》將孔雀石綠列為禁止使用藥物，在動物性食品中不得檢出。目前市面上的膠體金快 速檢測試劑的靈敏度普遍為2ppb。本實用新型試劑板的靈敏度可達(dá)到孔雀石綠lppb、隱性 孔雀石綠lppb、結(jié)晶紫lppb、隱性結(jié)晶紫lppb。(3)操作簡便快速。本實用新型試劑板將免疫層析反應(yīng)所需的大部分原料已整合 到試劑條中，滴樣后抗原抗體反應(yīng)在固相膜上快速進行，大大縮短了檢樣時間，滴樣后5 8分鐘內(nèi)即可讀取結(jié)果。本實用新型試劑板的操作不需任何專業(yè)培訓(xùn)，普通人員均可操作， 只需按說明滴樣后用肉眼判讀即可。(4)不依賴于實驗設(shè)備。本實用新型試劑板在直接滴樣跑板后，通過肉眼判斷硝酸 纖維素膜上檢測線和控制線的顏色深淺對比來判讀結(jié)果，整個檢測過程無需用到任何實驗 設(shè)備，真正做到了對實驗設(shè)備零要求，尤其適合于野外及現(xiàn)場操作，易于推廣。(5)成本低，效益好。本實用新型試劑板生產(chǎn)工藝簡單，可實現(xiàn)單個樣本檢測，生產(chǎn)成本低，大大降低了檢測費用。
圖1為孔雀石綠免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為樣品墊，2為膠 體金結(jié)合墊，3為硝酸纖維素膜，4為檢測線，5為控制線，6為吸水墊，7為不干膠，8為PVC 板。圖2為孔雀石綠免疫膠體金快速檢測試劑板操作示意圖，其中S為加樣孔，C為控 制區(qū)，T為檢測區(qū)。圖3為孔雀石綠免疫膠體金快速檢測試劑板結(jié)果判定示意圖，其中C為控制區(qū)，T 為檢測區(qū)。具體實施方法本實用新型試劑板的制備包括孔雀石綠載體蛋白偶聯(lián)物的制備、抗孔雀石綠單克 隆抗體的制備、膠體金溶液、膠體金標(biāo)記抗孔雀石綠單克隆抗體的制備和孔雀石綠免疫膠 體金快速檢測試劑板的組裝。1.孔雀石綠與載體蛋白的偶聯(lián)采用碳二亞胺法(EDC法)將孔雀石綠與載體蛋白(牛血清蛋白)偶聯(lián)制備免疫 抗原和包被抗原。以N、N- 二甲基苯胺為原料，加入對硝基甲醛和稀鹽酸，再將該溶液滴加 到堿溶液中，析出的沉淀，按每IOOmg沉淀溶解于6mL 0. 3mol/mL HCl的比例溶解，緩慢加 Λ NaNO3,冰浴攪拌。IOmLPB緩沖液(0. 2mol/L，pH 6. 0)溶解50mg牛血清白蛋白，加入 到上述溶液中，再緩慢加入2mL 0. lmol/L 2-嗎啉乙磺酸緩沖液，2mL 二甲基甲酰胺溶劑， 26mgN-羥基琥珀酰亞胺保護劑和44mg 二氯乙烷溶劑，室溫下反應(yīng)3h。雙蒸水透析5天，濾 膜過濾后，收集，-20°C下凍存?zhèn)溆?。用卵清蛋白替代牛血清蛋白，采用同樣方法制備孔雀石綠-卵清蛋白偶聯(lián)物。2.抗孔雀石綠單克隆抗體的制備取6 8周齡雌性Balb/c小鼠，將作為免疫原的孔雀石綠-BSA偶聯(lián)物與等體積 的弗氏完全佐劑乳化，按100 μ g/只劑量皮下注射，之后每隔3周加強免疫1次，用不完全 佐劑腹腔注射。融合前3d強化免疫1次，不用佐劑，劑量加倍。細(xì)胞融合按常規(guī)方法進行 將Sp2/0多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞與免疫脾細(xì)胞按1 10的比例混合，在50%聚乙二醇作用下融 合，HAT培養(yǎng)基懸浮，分種于96孔培養(yǎng)板中，37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后，待細(xì)胞生長到培養(yǎng)孔面積的1/4時，采用分步篩選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初 篩選7.孔雀石綠免疫膠體金快速檢測試劑板檢測實施操作方法7. 1樣品制備稱取2g剪碎水產(chǎn)樣本于15mL離心管中，依次加入混合提取劑和乙腈，振蕩30s， 加入中性氧化鋁，劇烈振蕩2min，室溫下4000rpm離心5min，取3mL上清于新的5mL離心管 中，用刻度滴管移取2mL正己烷加入到離心管中，振蕩lmin，室溫下4000rpm離心lmin，棄 去上清，取2mL下層于5mL離心管中，用刻度滴管移取ImL 二氯甲烷加入到離心管中，振蕩 lmin，室溫下4000rpm離心lmin，棄去上層液體，取ImL下層液體于玻璃試管中，60°C下空 氣吹干；向吹干的試管中0. 3mL磷酸緩沖液，沖洗溶解試管內(nèi)壁上殘留物，吸取至少100 μ L溶液，待檢。7. 2檢測步驟在進行測試前先完整閱讀使用說明書，使用前將試劑板和待檢樣本溶液恢復(fù)至室 溫(20°C 30°C)。從原包裝袋中取出試劑板，水平放置于觀察者正面，吸取待檢樣品溶液 100 μ L于標(biāo)金微孔中，用小滴管吹打完全溶解孔內(nèi)紅色物質(zhì)，等待反應(yīng)5min ；吸取孔內(nèi)所 有溶液滴加到加樣孔中，加樣后開始計時；結(jié)果應(yīng)在5 Smin讀取，其他時間判讀無效。7. 3結(jié)果判斷讀取結(jié)果時，將試劑板水平置于觀察者正面。陰性(-)=T線顯色(檢測線，靠近加樣孔一端)比C線(對照線)深或一樣深，表 示樣品中孔雀石綠殘留含量低于檢測限或不含孔雀石綠殘留。陽性⑴Τ線顯色比C線淺，或T線無顯色，表示樣品中孔雀石綠殘留含量高于檢 測限，T線顯色比C線越淺，表示樣品中孔雀石綠含量越高。無效未出現(xiàn)C線，可能是操作不當(dāng)或試劑板已失效。應(yīng)再次閱讀說明書，并用新 的試劑板重新測試。
權(quán)利要求一種檢測水產(chǎn)中孔雀石綠的免疫膠體金試劑板，由上下兩塊塑料模板、背襯及粘附在背襯上依次緊密相連的樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜、吸水墊組成，其特征在于樣品墊、膠體金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊各部分之間有1 2mm的重疊，膠體金結(jié)合墊上包被有抗孔雀石綠單克隆抗體與膠體金的結(jié)合物，硝酸纖維素膜上從樣品墊到吸水墊方向依次包被有孔雀石綠載體蛋白偶聯(lián)物和羊抗鼠IgG，分別作為檢測線和質(zhì)控線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于偶聯(lián)孔雀石綠的載體蛋白可為牛血清白 蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)、血藍(lán)蛋白(KLH)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑板，其特征在于背襯為一面涂有不干膠的PVC板，樣品墊 由玻璃纖維制成，膠體金結(jié)合墊由聚酯膜制成，吸水墊為濾紙。
專利摘要本實用新型涉及一種檢測水產(chǎn)中孔雀石綠的免疫膠體金試劑板，可用于檢測水產(chǎn)品中的孔雀石綠。本實用新型試劑板由上下兩塊塑料模板和背襯組成，背襯上依次緊密粘貼著樣品墊、膠金結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊。硝酸纖維素膜從樣品墊到吸水墊方向上依次噴有檢測線和質(zhì)控線，可將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。該試劑板可進行半定量直觀檢測，整個操作過程僅需40min，且無需任何昂貴實驗設(shè)備輔助，利于大規(guī)模樣本篩選，適合工商部門、檢驗檢疫機構(gòu)、水產(chǎn)養(yǎng)殖場及水產(chǎn)品生產(chǎn)加工企業(yè)對水產(chǎn)品原料及產(chǎn)品中的孔雀石綠進行大規(guī)?？焖贆z測。
文檔編號G01N33/558GK201765234SQ20102051163
公開日2011年3月16日 申請日期2010年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月26日
發(fā)明者張少恩, 桑麗雅, 邵偉 申請人:杭州南開日新生物技術(shù)有限公司