專利名稱：一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原，特別是涉及一種用于孔雀石綠檢 測的完全抗原的制備方法。
背景技術(shù)：
由于孔雀石綠獨特的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，其自身不含氨基和羧基，不能為偶聯(lián)提供位點，給 半抗原的偶聯(lián)改造增加了一定的難度，添加氨基時會產(chǎn)生臨位、對位、間位不同產(chǎn)物，從而 導致改造后的產(chǎn)物不均一。難以用于孔雀石綠殘留檢測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明首次找到了孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類似物，從而合成完全抗原。它不但能有效的 制得用于孔雀石綠殘留檢測的免疫原。而且操作簡單，生產(chǎn)效率高。為了達到上述目的本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的本發(fā)明提供一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原，所述的完全抗原是用副品紅制備 的。本發(fā)明還提供一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原的制備方法，操作如下先將先將牛血清白蛋白、副品紅、1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以 摩爾比1 129 5216的比例一一加入到磷酸鹽緩沖液中，在室溫下反應(yīng)2個小時，接著 將反應(yīng)后的液體裝入透析袋中，再放入自來水中透析48小時，每12小時換液一次，最后收 集透析袋內(nèi)的液體，在-20°C中預冷凍2個小時，然后在-50°C下冷凍干燥，制成完全抗原粉 紅色固體粉末。所述的磷酸鹽緩沖液是PH為7. 4，含量為0. 01mol/L的磷酸緩沖液。所述的透析袋是半周長為22mm，截留分子量為14000的透析袋。由于孔雀石綠獨特的苯環(huán)結(jié)構(gòu)，其自身不含氨基和羧基，不能為偶聯(lián)提供位點，給 半抗原的偶聯(lián)改造增加了一定的難度，添加氨基時會產(chǎn)生臨位、對位、間位不同產(chǎn)物，從而 導致改造后的產(chǎn)物不均一。本發(fā)明首次找到了孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類似物副品紅，可以生產(chǎn)均 一的產(chǎn)物用于孔雀石綠檢測。另外，由于本發(fā)明采用了改進的碳二亞胺法，本發(fā)明的完全抗 原的合成過程只需要50個小時左右，這樣使制備過程得到了簡化，大大節(jié)約了制備完全抗 原的時間，提高了生產(chǎn)效率，其效率可提高49%左右。與此同時采用了自來水作為透析液， 該方法也降低了生產(chǎn)成本。另外，本發(fā)明制備的完全抗原的比例在20-37之間，由此，為對 提高孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測方法的準確度和靈敏度有了可靠的保證；并且，還有 利于普及推廣應(yīng)用。
具體實施例方式應(yīng)當理解，下面實施例中未說明的常規(guī)條件和方法，通常按照所屬領(lǐng)域?qū)嶒炄藛T 常規(guī)采用方法如薩姆布魯克和拉塞爾主編的《分子克隆實驗指南》第三版，或按照制造廠商所建議的步驟和條件。常用試劑為市售分析純試劑。實施例一以下將對本發(fā)明的一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原的制備方法作進一步的詳 細描述。具體步驟如下1、稱取9. 6g的氯化鈉、3. 58g十二水磷酸氫二鈉、0. 4g氯化鉀、0. 7g磷酸二氫鉀加 入950ml的蒸餾水，調(diào)節(jié)PH至7. 4，再加入50ml的蒸餾水，配置成1000ml，濃度為0. Olmol/ L的磷酸緩沖液。2、在15ml的離心管中依次加入牛血清白蛋白32mg (0. 48u mol)、副品紅 20mg(61.8u mol)、1-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽480mg (2503. 8u mol)，再 加入8ml的磷酸緩沖液(PH為7. 4，含量為0. Olmol/L)，在室溫下反應(yīng)2小時。3、將反應(yīng)好的液體裝入透析袋(半周長22mm，截留分子量14000)內(nèi)，再放入裝有 自來水的燒杯中，透析48小時，每12小時換自來水一次。4、將透析好的液體，在_20°C中預冷凍2個小時，然后在_50°C下冷凍干燥，制成完 全抗原粉紅色固體粉末。實施例二用于孔雀石綠檢測的完全抗原的使用及效果(1)采用此合成的完全抗原用于免疫小鼠，免疫劑量為0.25mg/次，免疫四次后進 行眼眶取血，利用間接ELISA法，測得的小鼠血清效價可達6. 25X 105，遠遠高于其他抗原免 疫小鼠獲得血清效價，為后續(xù)的單克隆抗體的制備奠定了基礎(chǔ)。(2)孔雀石綠進入魚體后，24h之內(nèi)98%代謝為無色孔雀石綠，利用合成的完全抗 原，通過競爭性ELISA檢查，可直接檢測無色孔雀石綠，避免了其他檢測方法需將無色孔雀 石綠重新轉(zhuǎn)化為孔雀石綠，節(jié)省了成本和時間。(3)采用此合成的完全抗原免疫小鼠，獲得的抗體能有效的檢測水產(chǎn)品中孔雀石 綠及無色孔雀石綠的殘留，檢出限200ng/kg，遠低于國家標準《水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫 殘留量的測定高效液相色譜熒光檢測法》中0. 5ug/kg的檢出限。
權(quán)利要求
一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原，其特征在于，所述的完全抗原是用副品紅制備的。
2.一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原的制備方法，其特征在于，通過下列方法制 得先將牛血清白蛋白、副品紅、I-乙基-(3-甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽以摩爾比 1 129 5216的比例一一加入到磷酸鹽緩沖液中，在室溫下反應(yīng)2個小時；接著將反應(yīng) 后的液體裝入透析袋中，再放入自來水中透析48小時；每12小時換液一次，最后收集透析 袋內(nèi)的液體；在-20°C中預冷凍2個小時，然后在-50°C下冷凍干燥，制成完全抗原粉紅色固 體粉末。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原的制備方法，其特征在于 所述的磷酸鹽緩沖液是PH為7. 4，含量為0. 01mol/L的磷酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原的制備方法，其特征在于 所述的透析袋是半周長為22mm，截留分子量為14000的透析袋。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于孔雀石綠檢測的完全抗原及其制備方法。本發(fā)明首次利用孔雀石綠的結(jié)構(gòu)類似物副品紅，進行了用于孔雀石綠檢測的完全抗原的合成。免疫原是由副品紅和牛血清蛋白在室溫條件下，通過碳二亞胺法進行偶聯(lián)反應(yīng)，用磷酸緩沖液(pH為7.4，濃度為0.01mol/L)透析后，經(jīng)過冷凍干燥獲得的。研究表明，該方法不僅成功地合成了可用于制備檢測孔雀石綠特異抗體的免疫原，同時采用了新的偶聯(lián)方法、縮短了制備時間，提高了偶聯(lián)比率。本發(fā)明為開發(fā)孔雀石綠藥物殘留酶聯(lián)免疫檢測方法奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C07K14/765GK101948531SQ20101026039
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月23日
發(fā)明者付喬芳, 姜有聲, 楊先樂, 符貴紅, 胡鯤, 陳力, 黃宣運 申請人:上海海洋大學