甲拌磷膠體金檢測卡的制作方法
【技術領域】
[0001]屬于食品安全檢測領域，具體涉及食品中有害殘留物的檢測方法，特別是甲拌磷試紙檢測方法。
【背景技術】
[0002]甲拌磷是有機磷類重要的殺蟲殺螨劑，主要用來防治小麥、水稻、高粱、棉花等大田作物害蟲，為土壤和種子的處理劑，是高等毒性，甲拌磷在植物體內氧化為更高毒性的氧化物，并有較長的殘效期，對人類的健康存在潛在威脅，因此，對甲拌磷殘留快速檢測方法的研究具有一定意義。目前，常見的甲拌磷檢測方法為氣質聯(lián)用法和液質聯(lián)用法，由于常規(guī)儀器分析方法前處理復雜，費時費力，設備昂貴，需要專業(yè)人員操作，不適宜大量樣品和現(xiàn)場快速檢測。而本發(fā)明則研制出了一種方便現(xiàn)場檢測、快速簡便、成本低廉的檢測卡檢測方法。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明目的在于提供快速檢測出植物源食品中甲拌磷的殘留。
[0004]本發(fā)明的技術方案是甲拌磷的檢測卡及其檢測樣品的處理方法。甲拌磷的檢測卡是在長條扁平薄殼狀的檢測卡外殼內設置檢測條，檢測卡外殼表面有檢測窗孔和加樣孔，其特征在于測試條是由支承背板上粘貼四種原件組成:支承背板中部粘貼硝酸纖維素膜，支承背板一端上粘貼吸水紙，另一端粘貼樣品墊，吸水紙內端與硝酸纖維素膜搭接，樣品墊與硝酸纖維素膜之間則有一段金標墊，由金標墊將樣品墊與硝酸纖維素膜連接在一起。金標墊中是含有第二種屬動物蛋白和甲拌磷抗體的混合物，硝酸纖維素膜上橫向有2條間隔開的顯色印記帶，一條是含甲拌磷蛋白質偶聯(lián)物的檢測帶，另一條是第二種屬動物蛋白的IgG (常用的為抗兔抗體或抗鼠抗體)；測試條置入檢測卡外殼內，樣品墊正對加樣孔，硝酸纖維素膜正對檢測窗孔。
[0005]樣品處理方法是:稱取Ig樣品于50mL具塞錐形瓶中，精確至0.0lg。加入正己烷:乙酸乙酯混合溶劑1mL和內標工作液(滅蟻靈20 μ L，蓋上瓶塞置于超聲波發(fā)生器中，以40%輸出功率超聲提取30分鐘。加入2g無水硫酸鈉至錐形瓶中，蓋上瓶塞充分振蕩。將提取液全部轉移至離心管中，在7000r/min條件下離心10分鐘。取上清液5mL，上清液即為藥物的抽提液。
[0006]本發(fā)明的優(yōu)點是能快速檢測出蔬菜中含有的甲拌磷，且節(jié)省檢測成本，使用方便，檢測快速，靈敏度高，結果準確。
【附圖說明】
[0007]圖1是甲拌磷檢測卡外殼及檢測試紙條在外殼內的安置圖。
[0008]圖2是甲拌磷檢測卡檢測試紙條結構示意圖。
[0009]圖3是檢測試紙條硝酸纖維素膜上顯示印跡帶示意圖。
【具體實施方式】
[0010]1.標記膠體金的制備
膠體金溶液的制備:先將I g氯金酸(HAuCl4)粉末溶于100 mL超純水配置成1%的氯金酸溶液；再取I L超純水于特質電爐上加熱，至沸騰后加入10 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，沸騰后繼續(xù)加熱，5分鐘后加10 mL 1%的氯金酸溶液，再次加熱至沸騰，等待顏色變?yōu)榫萍t色后開始計時，10分鐘后停止加熱，取下后自然冷卻、定容至I L，即為膠體金溶液。
[0011]抗體標記:確定抗體所需的0.1 mol/1 K2CO3的比例，取100 mL膠體金溶液，加入此比例0.1 mo I/L的K2CO3,混勻(約5 min),再將甲拌磷和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01 mol/L, ρΗ7.4)溶解稀釋至2 mg/mL,加入2 mL 2 mg/mL的甲拌磷抗體(或2 mL 2mg/mL第二種屬動物蛋白),混勻(5 min),最后加入10% BSA 2 mL,混勻(5 min)。離心三次留沉淀，此三次收集的沉淀即為金標甲拌磷抗體。
[0012]膠體金標記部分處理:將甲拌磷抗體稀釋后，按一定比例將載體(如玻璃纖維、聚酯膜等)浸透，鋪均勻，取出放于37 °C恒溫烘箱烘制8-12 h，干燥后即作為膠體金標記部分。
[0013]2.免疫層析專用高分子復合膜制備
首先用一種硝酸纖維素膜制成透明背襯膜，在背襯膜上覆蓋一層對蛋白質結合力強，浸潤性能好的具有一定孔徑的層析膜。背襯膜的作用是阻止粘合劑中的有機溶劑對層析膜上蛋白質的破壞。
[0014]3.層析膜的點樣方法
將一定濃度的甲拌磷抗原(甲拌磷與載體物質形成的偶合物)精確定量；以一定間距(5mm)呈橫條狀點定于層析膜上，供檢測用。
[0015]甲拌磷檢測卡是在檢測卡外殼I中設置檢測試紙條2，檢測卡外殼I的結構及檢測試紙條2的設置見附圖1，檢測卡外殼I為長條扁平薄殼狀外殼，長70 mm，寬20 mm，厚5mm ,薄殼壁厚I mm ,由工程塑料制成,檢測卡外殼I由上蓋和下蓋兩半聯(lián)接而成,在檢測卡外殼I上蓋上有檢測窗孔3和加樣孔4。檢測試紙條2放置在檢測卡外殼I的下蓋內。
[0016]檢測試紙條2是多層結構的窄條薄片,片長60 mm ,片寬約4 mm，厚度小于2.5mm。檢測試紙條2是多層結構:底層是支承背板5,為聚乙烯薄片,厚度約0.5 mm ,長60mm ,寬4 mm ;支承背板5中部粘貼硝酸纖維素膜6 ,硝酸纖維素膜厚0.5 mm,長20 mm ,寬4 mm。硝酸纖維素膜6上有兩條間隔開的橫向顯示印跡帶，參見附圖3，兩條顯示印跡中，一條是檢測線10，含甲拌磷偶聯(lián)物，另一條是參照線11，含第二種屬動物蛋白的IgG。支承背板5 —端上粘貼吸水紙9，另一端粘貼樣品墊8，吸水紙9內端與硝酸纖維素膜6搭接，樣品墊8與硝酸纖維素膜6之間則有一段金標墊7，由金標墊7將樣品墊8與硝酸纖維素膜6連接在一起，搭接寬度在1-2 mm。樣品墊8材料為吸水玻璃纖維或聚酯膜。
[0017]使用甲拌磷膠體金檢測卡時，先將待檢測的樣品液(藥物的抽提液稀釋后，直接用于檢測)從加樣孔4中滴入甲拌磷檢測試紙條2的樣品墊8，由于虹作用原理，帶動待檢測的樣品液及膠體金膜7所含的抗甲拌磷單克隆抗體膠體金標記物一起向硝酸纖維素膜6擴散，5-10分鐘內觀察結果。
[0018]檢測卡的主要反應是免疫學的抗原和抗體反應，在硝酸纖維素膜上遷移的膠體金標記的抗體，在測試線上與含有甲拌磷蛋白質偶聯(lián)物，以及參照線含第二種屬動物蛋白的IgG反應，形成棕紅色條帶。若樣品中相應的待測甲拌磷高于允許值，樣品加入后先與金標墊中的抗體反應，而不會與檢測帶所帶有的甲拌磷蛋白質偶聯(lián)物反應，從而不顯色。主要有以下3種檢測結果:
1.檢測線10和參照線11同時顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測結果為陰性，說明被測樣品中不含甲拌磷或含量低于允許值；
2.檢測線10不顯色，參照線11顯現(xiàn)棕紅色印跡，表示檢測結果為陽性，說明被測樣品中甲拌磷含量高于允許值；
3.檢測線10顯現(xiàn)棕紅色印跡，參照線11不顯色，或檢測線10和參照線11均不顯色，表示檢測試紙條失效。
【主權項】
1.甲拌磷膠體金檢測卡，其特征在于:在試紙的背襯上依次貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分和吸水部分，膠體金標記部分被標記的物質為第二種屬動物蛋白和甲拌磷抗體的混合物；檢測反應部分包被有檢測用甲拌磷抗原I條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG I條作為參照線。2.根據(jù)權利要求1所述的甲拌磷膠體金檢測卡，其特征在于:甲拌磷檢測用抗原為甲拌磷與載體物質形成的偶合物。3.根據(jù)權利要求2所述的甲拌磷膠體金檢測卡，其特征在于:所述的載體物質，為蛋白質、蛋白質片段、合成多肽、半合成多肽或多糖。4.根據(jù)權利要求1所述的甲拌磷膠體金檢測卡，其特征在于:所述的第二種屬動物蛋白為非抗體來源動物的蛋白質。
【專利摘要】本發(fā)明涉及甲拌磷膠體金檢測卡。該方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應部分及吸水部分。檢測反應部分上面包被有檢測用抗原1條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1條作為參照線。該快速檢測試紙條特異性強，能夠半定量檢測，環(huán)境溫度為4-40℃都可以使用，適合于個體養(yǎng)殖戶、食品衛(wèi)生質檢部門、海關等植物源食品進行甲拌磷殘留的快速檢測。本發(fā)明具有特異性強、靈敏性高、能夠實現(xiàn)半定量檢測，且操作簡單方便等有益效果。
【IPC分類】G01N33/558
【公開號】CN105572350
【申請?zhí)枴緾N201410534144
【發(fā)明人】杜道林, 洪霞, 劉靜
【申請人】江蘇維賽科技生物發(fā)展有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2014年10月12日