專利名稱：與多個(gè)分子的抗原反復(fù)結(jié)合的抗原結(jié)合分子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法、增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法、藥物動(dòng)力學(xué)提高的抗原結(jié)合分子、抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)增加的抗原結(jié)合分子、以及它們的制備方法等。
背景技術(shù)：
抗體在血漿中的穩(wěn)定性高、副作用也少，因此作為藥品而受到關(guān)注。其中，有多種IgG型抗體藥物已上市，目前還有多種抗體藥物正在開(kāi)發(fā)中(非專利文獻(xiàn)1、非專利文獻(xiàn)2)。另一方面，作為可適用于第2代抗體藥物的技術(shù)，人們開(kāi)發(fā)了各種技術(shù)，有人報(bào)道了提高效應(yīng)子功能、抗原結(jié)合能力、藥物動(dòng)力學(xué)、穩(wěn)定性的技術(shù)或降低免疫原性風(fēng)險(xiǎn)的技術(shù)等(非專利文獻(xiàn)3)。認(rèn)為問(wèn)題在于:由于抗體藥物通常給藥量非常大，所以難以制備皮下給藥制劑；以及制造成本高等。作為減少抗體藥物的給藥量的方法，人們?cè)诳紤]提高抗體的藥物動(dòng)力學(xué)的方法和提高抗體與抗原的親和性(親和力)的方法。作為提高抗體的藥物動(dòng)力學(xué)的方法，有人報(bào)道了恒定區(qū)的人工氨基酸取代(非專利文獻(xiàn)4、5)。作為增強(qiáng)抗原結(jié)合能力、抗原中和能力的技術(shù)，有人報(bào)道了親和力成熟技術(shù)(非專利文獻(xiàn)6)，通過(guò)向可變區(qū)的CDR區(qū)等的氨基酸中導(dǎo)入突變，可以增強(qiáng)與抗原的結(jié)合活性。通過(guò)增強(qiáng)抗原結(jié)合能力，可以提 高在體外的生物活性、或者減少給藥量，還可以進(jìn)一步提高在體內(nèi)的藥效(非專利文獻(xiàn)7)。另一方面，每I分子的抗體能夠中和的抗原量依賴于親和力，通過(guò)增強(qiáng)親和力，可以以少的抗體量中和抗原，可以通過(guò)各種方法來(lái)增強(qiáng)抗體的親和力。并且，只要與抗原進(jìn)行共價(jià)鍵結(jié)合、使親和力無(wú)限大，就可以用I分子的抗體中和I分子的抗原(抗體為二價(jià)時(shí)中和兩分子的抗原)。但在現(xiàn)有方法中，用I分子的抗體中和I分子的抗原(抗體為二價(jià)時(shí)中和兩分子的抗原)的化學(xué)量論的中和反應(yīng)是界限，以抗原量以下的抗體量無(wú)法完全中和抗原。即，在增強(qiáng)親和力的效果方面存在界限(非專利文獻(xiàn)9)。當(dāng)抗體為中和抗體時(shí)，為了使其中和效果持續(xù)一定期間，必需給予該期間內(nèi)在體內(nèi)產(chǎn)生的抗原量以上的抗體量，僅憑提高上述抗體的藥物動(dòng)力學(xué)或親和力成熟技術(shù)，在減少必需的抗體給藥量方面存在界限。因此，為了以抗原量以下的抗體量目標(biāo)期間持續(xù)抗原的中和效果，必需用I個(gè)抗體中和多個(gè)抗原。作為用I個(gè)抗體中和多個(gè)抗原的方法，有利用賦予抗體催化功能的催化抗體進(jìn)行的抗原的滅活。當(dāng)為蛋白抗原時(shí)，認(rèn)為通過(guò)水解抗原的肽鍵可以將抗原滅活，通過(guò)抗體催化該水解反應(yīng)，可以反復(fù)中和(失活)抗原(非專利文獻(xiàn)8)。迄今為止，報(bào)道了許多有關(guān)催化抗體和催化抗體制作技術(shù)，但作為藥品具有足夠的催化活性的催化抗體則未見(jiàn)報(bào)道。即，在抗某抗原的抗體的體內(nèi)試驗(yàn)中，與普通的不具有催化功能的中和抗體相比，以低劑量發(fā)揮同等以上的效果、或者以相同的給藥量可以更持續(xù)地發(fā)揮效果的催化抗體迄今為止未見(jiàn)報(bào)道。這樣，沒(méi)有關(guān)于用I分子的抗體中和多個(gè)抗原、可以發(fā)揮優(yōu)于普通中和抗體的體內(nèi)效果的抗體的報(bào)道，為了減少給藥量以及延長(zhǎng)持續(xù)性，人們希望開(kāi)發(fā)用I個(gè)抗體中和多個(gè)抗原、在體內(nèi)較普通的中和抗體更能發(fā)揮效果的新型抗體制作技術(shù)。本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)如下所示?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn) 非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)1:Monoclonal antibody successes in the clinic， JaniceMReichert, Clark J Rosensweig， Laura B Faden & Matthew C Dewitz, NatureBiotechnology23，1073-1078(2005).
非專利文獻(xiàn)2:Pavlou AK，Belsey MJ.The therapeutic antibodies marketto2008.Eur J Pharm Biopharm.2005Apr ；59(3):389-96.
非專利文獻(xiàn)3 ；Kim SJ, Park Y，Hong HJ.Antibody engineering for thedevelopment of therapeutic antibodies.Mol Cells.2005Aug31 ；20(1):17-29.Review.
非專利文獻(xiàn)4 ；Hinton PR，Xiong JM, Johlfs MG，Tang MT，Keller S，Tsurushita N.An engineered human IgGlantibody with longer serum half-life.JImmunol.2006Janl ; 176(I):346-56.
非專利文獻(xiàn)5 ；Ghetie V，Popov S，Borvak J，Radu C，Matesoi D，Medesan C，Ober RJ, Ward ES.1ncreasing the serum persistence of an IgG fragment by randommutagenesis.Nat Biotechnol.1997Jul ；15(7):637-40.
非專利文獻(xiàn)6:Proc Natl Acad Sci U S A.2005Junl4 ; 102 (24):8466-71.Epub2005Jun6.A general method for greatly improving the affinity of antibodiesby using combinatorial libraries.Rajpal A，Beyaz N，Haber L，Cappuccilli G，Yee H，Bhatt RR, Takeuchi T，Lerner RA，Crea R.
非專利文獻(xiàn)7:Wu H，Pfarr DS，Johnson S，Brewah YA，Woods RM，Patel NK，WhiteWI, Young JF，Kiener PA.Development of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody forthe Prevention of Respiratory Syncytial Virus Infection in the Upper and LowerRespiratory Tract.J Mol Biol.2007，368，652-665.
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非專利文獻(xiàn)9 ；Rathanaswami P，Roalstad S，Roskos L, Su QJ, Lackie S，Babcook J.Demonstration of an in vivo generated sub-picomolar affinity fullyhuman monoclonal antibody to interleukin-8.Biochem Biophys ResCommun.2005Sep9 ；334(4):1004-13.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明鑒于上述狀況而設(shè)，其目的在于提供:抗原結(jié)合分子與抗原多次結(jié)合的方法、提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法、可以多次與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子、藥物動(dòng)力學(xué)得到改善的抗原結(jié)合分子、含有該抗原結(jié)合分子的藥物組合物、以及它們的制備方法。解決課題的方法本發(fā)明人等對(duì)抗原結(jié)合分子等具有抗原結(jié)合能力的多肽與抗原多次結(jié)合的方法、改善血漿中半衰期(血中半衰期)(提高藥物動(dòng)力學(xué))的方法進(jìn)行了深入研究。其結(jié)果，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):與在血漿中(血中)的PH下的抗原結(jié)合活性相比，在早期核內(nèi)體內(nèi)的pH下的抗原結(jié)合活性弱的抗原結(jié)合分子與抗原多次結(jié)合，血漿中半衰期長(zhǎng)。本發(fā)明涉及抗原結(jié)合分子與抗原多次結(jié)合的方法、提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法、能夠多次與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子、藥物動(dòng)力學(xué)提高的抗原結(jié)合分子、藥物動(dòng)力學(xué)提高的抗原結(jié)合分子的制備方法等，更具體而言，本發(fā)明提供下述[I] [50]。[I]抗原結(jié)合分子，其對(duì)于抗原的在pH5.8下的KD與在pH7.4下的KD之比、SPKD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值為 2 以上。[2] [I]所述的抗原結(jié)合分子，其中KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值為10以上。[3] [I]所述的抗原結(jié)合分子，其中KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值為40以上。[4] [I] [3]中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于:至少I個(gè)氨基酸被組氨酸取代、或者插入至少I個(gè)組氨酸。[5] [I] [4]中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于:該抗原結(jié)合分子具有拮抗活性。[6] [I] [5]中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于:該抗原結(jié)合分子與膜抗原或可溶型抗原結(jié)合。[7] [I] [6]中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子，其特征在于:抗原結(jié)合分子為抗體。[8]藥物組合物，其中含有[I] [7]中任一項(xiàng)所述的抗原結(jié)合分子。[9]提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法，該方法通過(guò)使抗原結(jié)合分子在PH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性來(lái)進(jìn)行。[10]增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法，該方法通過(guò)使抗原結(jié)合分子在PH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性來(lái)進(jìn)行。[11]增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)目的方法，該方法通過(guò)使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性來(lái)進(jìn)行。[12]使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法，該方法通過(guò)使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性來(lái)進(jìn)行。[13]使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的 方法，該方法通過(guò)使抗原結(jié)合分子在PH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在PH7.4下的抗原結(jié)合活性來(lái)進(jìn)行。[14]增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法，該方法通過(guò)使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性來(lái)進(jìn)行。[15] [9] [14]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:對(duì)于抗原的在pH5.8下的KD與在ρΗ7.4下的KD之比、即KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值為2以上。[16] [9] [14]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:使KD(pH5.8) /KD (pH7.4)的值為10以上。[17] [9] [14]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:使KD(pH5.8) /KD (pH7.4)的值為40以上。[18]提高藥物動(dòng)力學(xué)的方法，該方法通過(guò)用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸來(lái)進(jìn)行。[19]增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法，該方法通過(guò)用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸來(lái)進(jìn)行。[20]增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)目的方法，該方法通過(guò)用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸來(lái)進(jìn)行。[21]使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法，該方法通過(guò)用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸來(lái)進(jìn)行。[22]使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法，該方法通過(guò)用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸來(lái)進(jìn)行。[23]增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法，該方法通過(guò)用組氨酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸來(lái)進(jìn)行。[24] [18] [23]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:通過(guò)取代成組氨酸或插入組氨酸，使pH5.8下的抗原結(jié) 合活性與在pH7.4下的抗原結(jié)合活性之比即KD(pH5.8)/KD (pH7.4)的值與組氨酸取代或插入前相比變大。[25] [9] [24]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:抗原結(jié)合分子具有拮抗活性。[26] [9] [25]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:抗原結(jié)合分子與膜抗原或可溶型抗原結(jié)合。[27] [9] [26]中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于:抗原結(jié)合分子為抗體。[28]抗原結(jié)合分子的篩選方法，該方法包括以下步驟:(a)獲得ρΗ6.7 ρΗ10.0下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟；(b)獲得ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟；(c)選擇ρΗ6.7 ρΗ10.0下的抗原結(jié)合活性高于ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟。[29] [28]所述的篩選方法，其特征在于:選擇ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性為pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性的兩倍以上的抗體。[30]抗原結(jié)合分子的篩選方法，該方法包括以下步驟:(a)在ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟；(b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子置于ρΗ4.0 ρΗ6.5的條件下的步驟；(c)獲得在ρΗ4.0 ρΗ6.5的條件下解離的抗原結(jié)合分子的步驟。[31]第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的篩選方法，該方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟；(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫在第一 pH條件下與柱結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟；(c)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟。[32]第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的篩選方法，該方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子文庫(kù)與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟；(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫抗原結(jié)合分子的步驟；(c)擴(kuò)增編碼被洗脫的抗原結(jié)合分子的基因的步驟；(d)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟。

[33] [31]或[32]所述的篩選方法，其特征在于:第一 pH為ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0，第二pH 為 ρΗ4.0 ρΗ6.5。[34] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，其中抗原結(jié)合分子是抗原結(jié)合分子中的至少I個(gè)以上的氨基酸被組氨酸取代或插入至少I個(gè)組氨酸的抗原結(jié)合分子。[35] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，該方法以獲得血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子為目的。[36] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，該方法以獲得能夠與抗原進(jìn)行兩次以上結(jié)合的抗原結(jié)合分子為目的。[37] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，該方法以獲得可結(jié)合的抗原數(shù)多于抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗原結(jié)合分子為目的。[38] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，該方法以獲得在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗原結(jié)合分子為目的。[39] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，該方法以獲得以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)、以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子為目的。[40] [28] [33]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，該方法以獲得血漿中抗原消除能力增加的抗原結(jié)合分子為目的。[41] [28] [40]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，其中抗原結(jié)合分子是用作藥物組合物的抗原結(jié)合分子。[42] [28] [41]中任一項(xiàng)所述的篩選方法，其特征在于:抗原結(jié)合分子為抗體。[43]抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)獲得pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟；(b)獲得ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟；(c)選擇ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟；(d)獲得編碼(C)中所選擇的抗原結(jié)合分子的基因的步驟；(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。[44]抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)在ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟；(b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子置于ρΗ4.0 ρΗ6.5的條件下的步驟；(c)獲得在ρΗ4.0 ρΗ6.5的條件下解離的抗原結(jié)合分子的步驟；(d)獲得編碼(C)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟；
(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。[45]第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟；(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫在第一 pH條件下與柱結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟；(c)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟；(d)獲得編碼(C)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟；(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。[46]第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的制備方法，該方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子文庫(kù)與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟；(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫抗原結(jié)合分子的步驟；(c)擴(kuò)增編碼被洗脫的抗原結(jié)合分子的基因的步驟；(d)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟；(e)獲得編碼(d)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟；(f)使用(e)中得到的基`因制備抗原結(jié)合分子的步驟。[47] [45]或[46]所述的制備方法，其特征在于:第一 pH為ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0，第二pH 為 ρΗ4.0 ρΗ6.5。[48] [43] [47]中任一項(xiàng)所述的制備方法，該制備方法進(jìn)一步包括:用組氨酸取代抗原結(jié)合分子中的至少I個(gè)以上的氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸的步驟。[49] [43] [48]中任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于:抗原結(jié)合分子為抗體。[50]藥物組合物，其中含有利用[43] [49]中任一項(xiàng)所述的制備方法制備的抗原結(jié)合分子。發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，提供使I分子的抗原結(jié)合分子與多個(gè)抗原反復(fù)結(jié)合的方法。I分子的抗原結(jié)合分子通過(guò)與多個(gè)抗原結(jié)合，可以提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)，且可以在體內(nèi)發(fā)揮優(yōu)于普通的抗原結(jié)合分子的效果。


圖1是顯示與膜型抗原結(jié)合的抗體的分解路徑的圖。圖2是顯示基于FcRn的IgG分子的補(bǔ)救機(jī)制的圖。圖3是顯示IgG分子在核內(nèi)體內(nèi)從膜型抗原上解離，從而再次與新的抗原結(jié)合的示意圖。圖4是顯示IgG分子在核內(nèi)體內(nèi)從可溶型抗原上解離，從而再次與新的抗原結(jié)合的示意圖。圖5是顯示固定有抗原的柱淘選的圖。圖6是顯示由柱淘選獲得的克隆的噬菌體ELISA的結(jié)果的曲線圖。上段是WT，下段是CL5。
圖7是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體的生物學(xué)中和活性的曲線圖。圖8是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在pH7.4下與可溶型IL_6受體結(jié)合的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。最上的是WT，上起第2位是H3pl/L73，上起第3位是Hl70/L82，最下的是 CLH5/L73。圖9是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在pH5.8下與可溶型IL_6受體結(jié)合的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。最上的是WT，上起第2位是H3pl/L73，上起第3位是Hl70/L82，最下的是 CLH5/L73。圖10是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體與膜型IL-6受體結(jié)合(pH7.4)和解離(pH5.8)的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。最上的是WT，上起第2位是H3pl/L73，上起第3 位是 H170/L82，最下的是 CLH5/L73。圖11是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體與SR344反復(fù)結(jié)合的Biacore的傳感圖。圖12是顯示在pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體與SR344反復(fù)結(jié)合試驗(yàn)中的總抗原結(jié)合量的曲線圖。圖13是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在人IL_6受體轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的血漿中抗體濃度變化的曲線圖。圖14是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在食蟹猴體內(nèi)的血漿中抗體濃度變化的曲線圖。圖15是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在食蟹猴體內(nèi)的CRP濃度變化的曲線圖。圖16是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在食蟹猴體內(nèi)的非結(jié)合型食蟹猴IL-6受體濃度變化的曲線圖。圖17是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體與膜型IL_6受體結(jié)合(pH7.4)和解離(ρΗ5.8)的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。上起依次為WT、H3pI/L73_IgGl、Fv2_IgGl、Fv4-1gGlo圖18是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在人IL_6受體轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的WT、H3pI/L73-1gGl、Fv2-1gGl、Fv4-1gGl的血漿中抗體濃度變化的曲線圖。圖19是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體與膜型IL_6受體的結(jié)合(pH7.4)和解離(ρΗ5.8)的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。上起依次為WT、Fv4-1gGl、Fv4-1gG2、Fv4-M58。圖20是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體在人IL_6受體轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的WT、Fv4-1gGl、Fv4-1gG2、Fv4_M58的血漿中抗體濃度變化的曲線圖。圖21是顯示pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體與膜型IL_6受體的結(jié)合(pH7.4)和解離(pH5.8)的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。上起依次為Fvl_M71、Fvl_M73、Fv3_M71、Fv3-M73。圖22 是顯示在食蟹猴體內(nèi)以 0.5mg/kg 給予 H3pI/L73_IgGl、Fvl_M71、Fvl_M73、Fv2-1gGl、Fv3-M73、Fv4-M73和以1.0mg/kg給予高親和性抗體時(shí)，pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體的血漿中抗體濃度變化的曲線圖。圖23是顯示在食蟹猴體內(nèi)pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體的H3pI/L73_IgGl、Fvl-M71、Fvl-M73、Fv2_Ig Gl、Fv3_M73、Fv4_M73、高親和性 Ab 給藥組的 CRP 濃度變化的曲線圖。圖24是顯示在食蟹猴體內(nèi)pH依賴性結(jié)合抗IL-6受體抗體的H3pI/L73_IgGl、Fvl-M71、Fvl-M73、Fv2_IgGl、Fv3_M73、Fv4_M73、高親和性Ab給藥組的非結(jié)合型食蟹猴IL-6受體濃度變化的曲線圖。圖 25 是顯示重鏈(VH1、VH2、VH3、VH4)和輕鏈(VL1、VL2、VL3)的 FR1、FR2、FR3、FR4和⑶R1、⑶R2、⑶R3的圖。星號(hào)顯示排比序列中存在氨基酸突變的位點(diǎn)。圖26是顯示作為pH依賴性結(jié)合抗IL-6抗體的抗IL6克隆2在pH7.4和pH5.5下與IL-6結(jié)合的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。pH7.4的圖從上起依次顯示100、50、25、12.5、6.25ng/mL 的 IL-6。圖27是顯示作為pH依賴性結(jié)合抗IL-31受體抗體的抗IL31R克隆I在pH7.4和pH5.5下與IL-31受體結(jié)合的Biacore傳感圖的結(jié)果的圖。pH5.5的圖從上起依次顯示100、50,25,12.5ng/mL 的 IL-31 受體。圖28是顯示對(duì)小鼠靜脈內(nèi)給予SR344和抗人IL_6受體抗體的混合溶液后的血漿中抗體濃度變化的圖。圖29是顯示對(duì)小鼠靜脈內(nèi)給予SR344和抗人IL_6受體抗體的混合溶液后的血漿中SR344濃度變化的圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法。更具體而言，提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，來(lái)增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié) 合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的方法。更具體而言，提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，來(lái)增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的方法。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子中的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明還提供使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法。更具體而言，提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性PH下的抗原結(jié)合能力，使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法。本發(fā)明還提供使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明還提供使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法。更具體而言，提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性PH下的抗原結(jié)合能力，使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法。本發(fā)明還提供使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法。更具體而言，本發(fā)明提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，來(lái)增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明還提供提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法。更具體而言，提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性PH下的抗原結(jié)合能力，來(lái)提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)(延長(zhǎng)血漿中滯留性)的方法。本發(fā)明還提供提高藥物動(dòng)力學(xué)的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供提高藥物動(dòng)力學(xué)的方法，其特征在于:取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法。更具體而言，提供通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，來(lái)增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法，其特征在于:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸。本發(fā)明還提供增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法，其特征在于:取代、缺失、添加·和/或插入抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)中的氨基酸。本發(fā)明中，“藥物動(dòng)力學(xué)的提高”、“藥物動(dòng)力學(xué)的改善”或“優(yōu)異的藥物動(dòng)力學(xué)”可以改稱“血漿中(血中)滯留性的提高”、“血漿中(血中)滯留性的改善”、“優(yōu)異的血漿中(血中)滯留性”，這些語(yǔ)句以相同的意義使用。本發(fā)明中，使酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于中性pH下的抗原結(jié)合能力，是指使抗原結(jié)合分子在pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性弱于在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性。優(yōu)選使抗原結(jié)合分子在pH5.5 pH6.5下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.0 pH8.0下的抗原結(jié)合活性，特別優(yōu)選使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性。因此，本發(fā)明中酸性pH通常是指pH4.0 pH6.5，優(yōu)選為pH5.5 pH6.5，特別優(yōu)選為ρΗ5.8。本發(fā)明中，中性pH通常是指ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0，優(yōu)選為ρΗ7.0 ρΗ8.0，特別優(yōu)選為ΡΗ7.4。本發(fā)明中，“使抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力”的描述還可以描述成使抗原結(jié)合分子在中性下的抗原結(jié)合能力高于在酸性PH下的抗原結(jié)合能力。即，本發(fā)明中，只要增大抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力與在中性pH下的抗原結(jié)合能力之差即可(例如象后述那樣，只要增大KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值即可)。為了增大抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力與在中性pH下的抗原結(jié)合能力之差，例如可以降低酸性PH下的抗原結(jié)合能力，也可以提高中性pH下的抗原結(jié)合能力，或者可以是兩者。測(cè)定抗原的結(jié)合活性時(shí)，除pH以外的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇，沒(méi)有特別限定，例如，如實(shí)施例所述，可以在MES緩沖液中、37°C的條件下進(jìn)行測(cè)定?？乖Y(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的測(cè)定可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行，例如，如實(shí)施例所述，可以使用Biacore (GE Healthcare)等進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)抗原為可溶型抗原時(shí),通過(guò)使抗原以分析物的形式流經(jīng)固定有抗原結(jié)合分子的芯片(chip)，可以評(píng)價(jià)抗原結(jié)合分子與可溶型抗原的結(jié)合能力；當(dāng)抗原為膜型抗原時(shí)，通過(guò)使抗原結(jié)合分子以分析物的形式流經(jīng)固定有抗原的芯片，可以評(píng)價(jià)抗原結(jié)合分子與膜型抗原的結(jié)合能力。本發(fā)明中， 只要酸性pH下的抗原結(jié)合活性弱于中性pH下的抗原結(jié)合活性，對(duì)酸性PH下的抗原結(jié)合活性與中性pH下的抗原結(jié)合活性之差沒(méi)有特別限定，優(yōu)選對(duì)于抗原的在pH5.8 下的 KD 與在ρΗ7.4 下的 KD (Dissociation constant:解離常數(shù))之比即 KD (pH5.8)/KD(pH7.4)的值為2以上，進(jìn)一步優(yōu)選1 ( 冊(cè).8)/1(0( !17.4)的值為10以上，更進(jìn)一步優(yōu)選KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值為40以上。對(duì)KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值的上限沒(méi)有特別限定，只要在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)中能夠制作，可以是400、1000、10000等任何值。作為抗原結(jié)合活性的值，當(dāng)抗原為可溶型抗原時(shí)，可以使用KD(解離常數(shù))；當(dāng)抗原為膜型抗原時(shí)，可以使用表觀H) (Apparent dissociation constant:表觀解離常數(shù))。KD (解離常數(shù))和表觀KD(表觀解離常數(shù))可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行測(cè)定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、斯卡恰特作圖法(Scatchard plot)、FACS 等。本發(fā)明中，作為表示酸性pH下的抗原結(jié)合活性與中性pH下的抗原結(jié)合活性之差的其他指標(biāo)，例如還可以使用解離速度常數(shù)kd(Dissociation rate constant:解離速度常數(shù))。作為表示結(jié)合活性之差的指標(biāo)，當(dāng)使用kd(解離速度常數(shù))來(lái)代替KD (解離常數(shù))時(shí)，對(duì)于抗原的在PH5.8下的kd(解離速度常數(shù))與在PH7.4下的kd(解離速度常數(shù))之比即kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值優(yōu)選為2以上，進(jìn)一步優(yōu)選為5以上，更進(jìn)一步優(yōu)選為10以上，更優(yōu)選為30以上。對(duì)匕( 冊(cè).8)/\( !17.4)的值的上限沒(méi)有特別限定，只要在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)常識(shí)內(nèi)能夠制作，可以是50、100、200等任何值。作為抗原結(jié)合活性的值，當(dāng)抗原為可溶型抗原時(shí)，可以使用kd(解離速度常數(shù))；當(dāng)抗原為膜型抗原時(shí)，可以使用表觀kd(Apparent dissociation rate constant:表觀解離速度常數(shù))。kd(解離速度常數(shù))和表觀kd(表觀解離速度常數(shù))可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行測(cè)定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、FACS等。本發(fā)明中，在不同pH下測(cè)定抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性時(shí)，優(yōu)選除pH以外的條件相同。對(duì)使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性的方法(賦予pH依賴性結(jié)合能力的方法)沒(méi)有特別限定，可以通過(guò)任何方法來(lái)進(jìn)行?？梢粤信e:例如通過(guò)將抗原結(jié)合分子中的氨基酸取代成組氨酸、或在抗原結(jié)合分子中插入組氨酸，使pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于pH7.4下的抗原結(jié)合活性的方法。已知通過(guò)用組氨酸取代抗體中的氨基酸，可以賦予抗體PH依賴性的抗原結(jié)合活性(FEBS Letter, 309 (I)，85-88，(1992))。對(duì)導(dǎo)入(進(jìn)行)組氨酸突變(取代)或插入的位點(diǎn)沒(méi)有特別限定，只要與突變或插入前相比在PH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值變大)，可以是任何位點(diǎn)。例如，當(dāng)抗原結(jié)合分子為抗體時(shí)，可以列舉抗體的可變區(qū)等。導(dǎo)入(進(jìn)行)組氨酸突變或插入的數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定，可以用組氨酸只取代I個(gè)位點(diǎn)，或者只在I個(gè)位點(diǎn)插入組氨酸，也可以用組氨酸取代2個(gè)位點(diǎn)以上的多個(gè)位點(diǎn)，或者在2個(gè)位點(diǎn)以上的多個(gè)位點(diǎn)插入組氨酸。還可以同時(shí)導(dǎo)入除組氨酸突變以外的突變(突變成組氨酸以外的氨基酸)。還可以同時(shí)進(jìn)行組氨酸突變和組氨酸插入。組氨酸取代或組氨酸插入可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的、將丙氨酸分區(qū)(scanning)的丙氨酸取代成組氨酸的組氨酸分區(qū)等方法隨機(jī)進(jìn)行，可以從隨機(jī)導(dǎo)入組氨酸突變或插入的抗原結(jié)合分子文庫(kù)中選擇與突變前相比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值變大的抗原結(jié)合分子。將抗原結(jié)合分子的氨基酸取代成組氨酸或在抗原結(jié)合分子的氨基酸中插入組氨酸時(shí)，雖然沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選組氨酸取代或插入后的抗原結(jié)合分子在PH7.4下的抗原結(jié)合活性與組氨酸取代或插入前的抗原結(jié)合分子在PH7.4下的抗原結(jié)合活性同等。這里，組氨酸取代或插入后的抗原結(jié)合分子在PH7.4下的抗原結(jié)合活性與組氨酸取代或插入前的抗原結(jié)合分子在PH7.4下的抗原結(jié)合活性同等，是指組氨酸取代或插入后的抗原結(jié)合分子維持著組氨酸取代或插入前的抗原結(jié)合分子所具有的抗原結(jié)合活性的10%以上、優(yōu)選50%以上、進(jìn)一步優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選90%以上。通過(guò)組氨酸取代或插入，抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性變低時(shí)，通過(guò)抗原結(jié)合分子中的I或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等，可以使抗原結(jié)合活性與組氨酸取代或插入前的抗原結(jié)合活性同等。本發(fā)明中，還包括這樣的在組氨酸取代或插入后通過(guò)進(jìn)行I個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入使結(jié)合活性同等的抗原結(jié)合分子。作為使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性的其他方法，可以列舉 :將抗原結(jié)合分子中的氨基酸取代成非天然型氨基酸或在抗原結(jié)合分子中的氨基酸中插入非天然型氨基酸的方法。已知可以人為地控制非天然氨基酸的pKa(Angew.Chem.1nt.Ed.2005,44,34、Chem Soc Rev.2004Sepl0 ；33 (7):422_30、AminoAcids.1999 ； 16 (3-4):345-79)。因此，在本發(fā)明中，可以使用非天然型氨基酸來(lái)代替上述組氨酸。另外，上述組氨酸取代和/或插入以及非天然型氨基酸的取代和/或插入可以同時(shí)進(jìn)行。本發(fā)明中使用的非天然型氨基酸可以是任何非天然型氨基酸，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的非天然型氨基酸等。并且，當(dāng)抗原結(jié)合分子是包含抗體恒定區(qū)的物質(zhì)時(shí)，作為使抗原結(jié)合分子在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在PH7.4下的抗原結(jié)合活性的其他方法，可以列舉:修飾抗原結(jié)合分子所含的抗體恒定區(qū)的方法。這樣的抗體恒定區(qū)的修飾的具體例子有:例如實(shí)施例中所述的取代成恒定區(qū)的方法。作為抗體恒定區(qū)的修飾方法，可以列舉:例如研究恒定區(qū)的多個(gè)同種型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，選擇在pH5.8下的抗原結(jié)合活性降低(在pH5.8下的解離速度變快)的同種型的方法。還可以列舉:通過(guò)向野生型同種型的氨基酸序列(野生型IgGl、IgG2、IgG3、IgG4氨基酸序列)中導(dǎo)入氨基酸取代，使在pH5.8下的抗原結(jié)合活性降低(在pH5.8下的解離速度變快)的方法。根據(jù)同種型(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)，抗體恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)的序列大不相同，由于鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的不同對(duì)抗原結(jié)合活性影響很大，所以通過(guò)根據(jù)抗原或表位的種類來(lái)選擇適當(dāng)?shù)耐N型，可以選擇pH5.8下抗原結(jié)合活性降低的(pH5.8下的解離速度加快)同種型。由于鉸鏈區(qū)的氨基酸序列的不同對(duì)抗原結(jié)合活性影響很大，所以作為野生型同種型的氨基酸序列的氨基酸取代位點(diǎn)，認(rèn)為優(yōu)選鉸鏈區(qū)。利用上述方法等使抗原結(jié)合物質(zhì)在pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值變大)時(shí)，雖然沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選與原始抗體相比，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值通常為2倍以上，優(yōu)選5倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選10倍以上。本發(fā)明中，“藥物動(dòng)力學(xué)提高”不僅包括抗原結(jié)合分子從對(duì)人、小鼠、大鼠、猴、兔、狗等動(dòng)物給藥到從血漿中消除(例如，直至形成抗原結(jié)合分子在細(xì)胞內(nèi)被分解等而無(wú)法返回到血漿中的狀態(tài))的時(shí)間變長(zhǎng)，還包含抗原結(jié)合分子從給藥起到從血漿中消除這一期間以能夠與抗原結(jié)合的狀態(tài)(例如，抗原結(jié)合分子未與抗原結(jié)合的狀態(tài))滯留在血漿中的時(shí)間變長(zhǎng)。即使抗原結(jié)合分子存在于血漿中，當(dāng)抗原已經(jīng)與該抗原結(jié)合分子結(jié)合時(shí)，該抗原結(jié)合分子也無(wú)法與新的抗原結(jié)合。因此，若抗原結(jié)合分子未與抗原結(jié)合的時(shí)間變長(zhǎng)，則能夠與新的抗原結(jié)合的時(shí)間變長(zhǎng)(能夠與新的抗原結(jié)合的機(jī)會(huì)增多)，可以減少在體內(nèi)抗原未與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時(shí)間(換言之，可以延長(zhǎng)抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的時(shí)間)。例如，相對(duì)于存在于血漿中等體內(nèi)的抗原(與抗原結(jié)合分子結(jié)合的分子和未與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原的總量)，與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原的比例，通常在給予抗原結(jié)合分子后經(jīng)過(guò)一定時(shí)間即減少。但是，若抗原結(jié)合分子以能夠與抗原結(jié)合的狀態(tài)滯留的時(shí)間變長(zhǎng)，則可以抑制(例如減少其減少的程度等)其減少，結(jié)果，自給予抗體起經(jīng)過(guò)一定期間后，相對(duì)于體內(nèi)存在的抗原，與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原的比例變高。S卩，本發(fā)明的“藥物動(dòng)力學(xué)的提高”，未必是指從給予抗原結(jié)合分子到抗原結(jié)合分子消除的時(shí)間延長(zhǎng)(變長(zhǎng))。下述情形也均包含在本發(fā)明的“藥物動(dòng)力學(xué)的提高”中:即使抗原結(jié)合分子從給藥起到消除的時(shí)間沒(méi)有變化，但抗原結(jié)合分子以能夠與抗原結(jié)合的狀態(tài)(例如抗原結(jié)合分子未與抗原結(jié)合的狀態(tài))滯留于血漿中的時(shí)間變長(zhǎng)的情形；以及體內(nèi)的抗原未與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時(shí)間減少(換言之，抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的時(shí)間變長(zhǎng))的情形；或者相對(duì)于體內(nèi)存在的抗原，與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原的比例變高的情形。因此，本發(fā)明的“藥物動(dòng)力學(xué)的提高”至少`包含以下(I) (4)。(I)從給予抗原結(jié)合分子到抗原結(jié)合分子從血漿中消除的時(shí)間延長(zhǎng)。(2)給予抗原結(jié)合分子后，抗原結(jié)合分子以能夠與抗原結(jié)合的狀態(tài)存在于血漿中的時(shí)間延長(zhǎng)。(3)給予抗原結(jié)合分子后，體內(nèi)的抗原未與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時(shí)間減少(抗原結(jié)合分子與體內(nèi)的抗原結(jié)合的時(shí)間延長(zhǎng))。(4)相對(duì)于體內(nèi)存在的抗原，與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原的比例增加。當(dāng)抗原為存在于血漿中的可溶型抗原時(shí)，即使抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)(從血漿中消除的速度)同等，有時(shí)抗原結(jié)合分子所結(jié)合的抗原的消除也變快。這與通過(guò)降低抗原的藥物動(dòng)力學(xué)(從血漿中的消除變快)，使相對(duì)于抗原的相對(duì)的抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)提高有關(guān)，即、與抗原結(jié)合分子以可與抗原結(jié)合的狀態(tài)存在于血漿中的時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)。因此，作為本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的“藥物動(dòng)力學(xué)提高”的一種方式，還包含給予抗原結(jié)合分子后可溶型抗原從血漿中消除的速度(抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力)加快。本發(fā)明中，I分子的抗原結(jié)合分子是否與多個(gè)抗原結(jié)合，當(dāng)抗原為膜型抗原時(shí)，可以根據(jù)抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)是否提高來(lái)判斷。是否“藥物動(dòng)力學(xué)提高了”可以如下判斷。例如，從給予抗原結(jié)合分子到抗原結(jié)合分子消除的時(shí)間是否延長(zhǎng)，這可以通過(guò)測(cè)定抗原結(jié)合分子的血漿中半衰期、平均血漿中滯留時(shí)間、血漿中清除率等任意一個(gè)參數(shù)(7 7 —V 2今木于4夕7演習(xí)(二石理解(南山堂))來(lái)判斷。例如，對(duì)小鼠、大鼠、猴、兔、狗、人等給予抗原結(jié)合分子時(shí)，當(dāng)為血漿中半衰期變長(zhǎng)或平均血漿中滯留時(shí)間變長(zhǎng)的情況等時(shí)，可以說(shuō)抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)提高。上述參數(shù)可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來(lái)測(cè)定，例如使用藥物動(dòng)力學(xué)分析軟件WinNonlin(Pharsight),按照附錄的操作指南進(jìn)行無(wú)區(qū)室分析(noncompartmental analysis),由此可以適當(dāng)評(píng)價(jià)。抗原結(jié)合分子從給藥到消除這一期間以可與抗原結(jié)合的狀態(tài)存在于血漿中的時(shí)間是否被延長(zhǎng)，這可以通過(guò)測(cè)定未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的血漿中濃度，并測(cè)定未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的血漿中半衰期、平均血漿中滯留時(shí)間、血漿中清除率等任一個(gè)參數(shù)來(lái)判斷。未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的血漿中濃度的測(cè)定可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，例如按照Clin Pharmacol.2008Apr ；48 (4):406-17中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。給予抗原結(jié)合分子后體內(nèi)的抗原未與抗原結(jié)合分子結(jié)合的時(shí)間是否減少(抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的時(shí)間變長(zhǎng))，這可以通過(guò)測(cè)定抗原結(jié)合分子未結(jié)合的非結(jié)合型抗原的血漿中濃度，根據(jù)非結(jié)合型抗原的血漿中濃度、或非 結(jié)合型抗原量相對(duì)于總抗原量的比例維持在低水平的期間來(lái)判斷。非結(jié)合型抗原的血漿中濃度或非結(jié)合型抗原的抗原量相對(duì)于總抗原量的比例的測(cè)定可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行，例如按照PharmRes.2006Jan ；23(1) =95-103中所述的方法進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)抗原在體內(nèi)顯示出任何功能時(shí)，抗原是否被中和抗原的功能的抗原結(jié)合分子(拮抗分子，antagonistic molecule)結(jié)合，這還可以根據(jù)該抗原的功能是否被中和來(lái)評(píng)價(jià)?？乖墓δ苁欠癖恢泻?，這可以通過(guò)測(cè)定反映抗原的功能的任何體內(nèi)的標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)?？乖欠癖患せ羁乖墓δ艿目乖Y(jié)合分子(激動(dòng)分子，agonistic molecule)結(jié)合,這可以通過(guò)測(cè)定反映抗原的功能的任何體內(nèi)的標(biāo)志物來(lái)評(píng)價(jià)。對(duì)非結(jié)合型抗原的血漿中濃度的測(cè)定、非結(jié)合型抗原的抗原量相對(duì)于總抗原量的比例的測(cè)定、體內(nèi)標(biāo)志物的測(cè)定等測(cè)定沒(méi)有特別限定，優(yōu)選自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后進(jìn)行測(cè)定。本發(fā)明中，對(duì)自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)一定時(shí)間后沒(méi)有特別限定，根據(jù)所給予的抗原結(jié)合物質(zhì)的性質(zhì)等，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適時(shí)確定，例如自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)I天后、自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)3天后、自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)7天后、自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)14天后、自給予抗原結(jié)合物質(zhì)起經(jīng)過(guò)28天后等。本發(fā)明中，優(yōu)選在人體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)提高。當(dāng)難以測(cè)定在人體內(nèi)的血漿中滯留性時(shí)，可以根據(jù)在小鼠(例如正常小鼠、人抗原表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠、人FcRn表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)體內(nèi)的血漿中滯留性，預(yù)測(cè)在人體內(nèi)的血漿中滯留性。對(duì)血漿中滯留性的測(cè)定方法沒(méi)有特別限定，例如可以按照實(shí)施例所述的方法進(jìn)行?？乖Y(jié)合分子能否與抗原多次結(jié)合，這可以通過(guò)測(cè)定在與血漿中相同的中性條件下與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原是否在與核內(nèi)體內(nèi)相同的酸性條件下解離、再次在中性條件下能夠與多少抗原結(jié)合來(lái)評(píng)價(jià)。具體而言，使用Biacore這樣的評(píng)價(jià)抗原結(jié)合分子_抗原反應(yīng)的儀器，在中性條件下使抗原結(jié)合分子-抗原復(fù)合體作用，之后暴露于酸性條件下一定時(shí)間，之后再次在中性條件下測(cè)定抗原結(jié)合分子能否與抗原結(jié)合，由此可以進(jìn)行評(píng)價(jià)。與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了 PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合量提高兩倍時(shí)，可以說(shuō)與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了 PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子的結(jié)合次數(shù)提高兩倍。當(dāng)抗原為膜型抗原，與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子經(jīng)由抗原被攝入并被溶酶體分解，從而從血漿中消除時(shí)，通過(guò)評(píng)價(jià)與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了 PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)或與抗原的結(jié)合期間是否提高或提高了多少，可以評(píng)價(jià)與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了 PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子的結(jié)合次數(shù)是否增加。例如，與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了 PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合期間提高兩倍時(shí)，可以說(shuō)與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子的結(jié)合次數(shù)提高兩倍。另外，測(cè)定抗原結(jié)合分子未結(jié)合的非結(jié)合型抗原的血漿中濃度，當(dāng)非結(jié)合型抗原的血漿中濃度、或非結(jié)合型抗原的抗原量相對(duì)于總抗原量的比例維持在低水平的時(shí)間延長(zhǎng)兩倍時(shí)，可以說(shuō)與修飾前的抗原結(jié)合分子相比，賦予了 PH依賴性結(jié)合能力的抗原結(jié)合分子的結(jié)合次數(shù)提高兩倍。當(dāng)抗原為可溶型抗原時(shí)，在血漿中的中性條件下與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在核內(nèi)體內(nèi)解離，抗原結(jié)合分子返回血漿中時(shí)，抗原結(jié)合分子可以在血漿中的中性條件下再次與抗原結(jié)合，所以具有在核內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下解離抗原的性質(zhì)的抗原結(jié)合分子可以與抗原多次結(jié)合。和與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在核內(nèi)體內(nèi)未解離的情形(抗原維持著與抗原結(jié)合分子結(jié)合的狀態(tài)返回血漿中)相比，與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在核內(nèi)體內(nèi)解離時(shí)，抗原被運(yùn)送到溶酶體中被分解，所以抗原從血漿中消除的速度增加。即，以抗原從血漿中消除的速度為指標(biāo)，還可以判斷抗原結(jié)合分子能否與抗原多次結(jié)合?？乖瓘难獫{中消除的速度的測(cè)定，例如還可以通過(guò)對(duì)體內(nèi)給予抗原(例如膜抗原)和抗原結(jié)合分子，測(cè)定給藥后血漿中的抗原濃度來(lái)進(jìn)行。當(dāng)抗原(例如膜抗原)在體內(nèi)產(chǎn)生(分泌)時(shí)，若抗原從血漿中的消除速度增加，則血漿中抗原濃度降低，因此也可以以血漿中抗原濃度為指標(biāo)，判斷抗原結(jié)合分子能否與抗原多次結(jié)合。本發(fā)明中 ，“增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)”是指，對(duì)人、小鼠、猴等給予抗原結(jié)合分子時(shí)，以抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合并攝入細(xì)胞內(nèi)的步驟為I次，增加該步驟。即，在本發(fā)明中，“抗原結(jié)合分子兩次與抗原結(jié)合”是指，抗原結(jié)合分子以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)，之后以解離了抗原的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外，被釋放的抗原結(jié)合分子再次與抗原結(jié)合并攝入細(xì)胞內(nèi)?？乖Y(jié)合分子攝入細(xì)胞內(nèi)時(shí)，抗原結(jié)合分子可以以結(jié)合I個(gè)抗原的狀態(tài)攝入，也可以以結(jié)合2個(gè)或2個(gè)以上的抗原的狀態(tài)攝入。本發(fā)明中，“抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)增加”是指，不必所有抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合次數(shù)都增加，例如可以是抗原結(jié)合分子組合物所含的抗原結(jié)合分子中，兩次以上與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的比例上升、或抗原結(jié)合分子組合物所含的抗原結(jié)合分子的結(jié)合次數(shù)的平均值上升等。本發(fā)明中，優(yōu)選對(duì)人給予抗原結(jié)合分子時(shí)抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)增加，但在難以測(cè)定在人體內(nèi)的抗原結(jié)合次數(shù)時(shí)，根據(jù)體外的測(cè)定結(jié)果、在小鼠(例如表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠、表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)等體內(nèi)的測(cè)定結(jié)果，可以預(yù)測(cè)在人體內(nèi)的抗原結(jié)合次數(shù)。本發(fā)明中，優(yōu)選抗原結(jié)合分子兩次以上與抗原結(jié)合，例如優(yōu)選抗原結(jié)合分子組合物中所含的抗原結(jié)合分子的至少10%以上、優(yōu)選30%以上、進(jìn)一步優(yōu)選50%以上、更優(yōu)選80%以上(例如90%以上、95%以上等)的抗原結(jié)合分子兩次以上與抗原結(jié)合。本發(fā)明中，“增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)”是指，在對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給予抗原結(jié)合分子起到抗原結(jié)合分子被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體分解這一期間，增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)。通常，IgG等抗體具有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，所以I個(gè)抗體最多與2個(gè)抗原結(jié)合，與抗原結(jié)合的抗體攝入細(xì)胞內(nèi)，與抗原一同被溶酶體分解。因此，通常IgG等抗體最多可以與2個(gè)抗原結(jié)合。利用本發(fā)明的方法，通過(guò)使抗體等抗原結(jié)合分子在核內(nèi)體內(nèi)的PH下的抗原結(jié)合活性弱于在血漿中的PH下的抗原結(jié)合活性，攝入細(xì)胞內(nèi)的抗體等抗原結(jié)合分子在細(xì)胞內(nèi)解離抗原，被釋放到細(xì)胞外，能夠再次與抗原結(jié)合。即，利用本發(fā)明的方法，可以與多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目 的抗原結(jié)合。具體而言，例如當(dāng)為具有2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的IgG時(shí)，通過(guò)采用本發(fā)明的方法，在給予抗體到抗體被分解這一期間可以與3個(gè)以上、優(yōu)選4個(gè)以上的抗原結(jié)合。例如，當(dāng)抗體為中和抗體時(shí)，“增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)”還可以是指增加抗原結(jié)合分子所能中和的抗原數(shù)。因此，當(dāng)抗體為中和抗體時(shí)，還可以將“結(jié)合”與“中和”互換。本發(fā)明中，“增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)”是指，不必所有抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)都增加，例如可以是抗原結(jié)合分子組合物中所含的抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的平均值增加，還可以是能夠與多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的比例增加等。本發(fā)明中，優(yōu)選將抗原結(jié)合分子給予人時(shí)抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)增加，當(dāng)難以測(cè)定人體內(nèi)的抗原數(shù)時(shí)，根據(jù)體外的測(cè)定結(jié)果、小鼠(例如表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠、表達(dá)人FcRn的轉(zhuǎn)基因小鼠等)或猴(例如食蟹猴等)等的測(cè)定結(jié)果，可以預(yù)測(cè)人體內(nèi)的可結(jié)合的抗原數(shù)。通常，當(dāng)抗體為中和抗體時(shí)，認(rèn)為上述抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)與抗原結(jié)合分子所能中和的抗原數(shù)相關(guān)，因此抗原結(jié)合分子所能中和的抗原數(shù)的測(cè)定可以和上述抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的測(cè)定同樣進(jìn)行。本發(fā)明還提供:通過(guò)給予酸性pH下的抗原結(jié)合活性低于中性pH下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子，使抗原結(jié)合分子在體內(nèi)兩次以上與抗原結(jié)合的方法。本發(fā)明還涉及:在具有中和活性的抗原結(jié)合分子中，通過(guò)給予酸性pH下的抗原結(jié)合活性低于中性PH下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子，中和多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目的抗原的方法。優(yōu)選涉及通過(guò)給予酸性PH下的抗原結(jié)合活性低于中性pH下的抗原結(jié)合活性的IgG，中和3個(gè)以上、優(yōu)選4個(gè)以上的抗原的方法。本發(fā)明還涉及:通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法。本發(fā)明中，抗原從抗原結(jié)合分子上解離的位置只要是細(xì)胞內(nèi)即可，可以是任何位置，優(yōu)選為早期核內(nèi)體內(nèi)。本發(fā)明中，“在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離”是指，未必與抗原結(jié)合分子結(jié)合攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原全部在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離，只要與使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力低于在中性pH下的抗原結(jié)合能力之前相比，在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的抗原的比例增加即可。本發(fā)明還涉及:通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子與FcRn的結(jié)合的方法。通常，F(xiàn)cRn在核內(nèi)體內(nèi)與抗原結(jié)合分子結(jié)合，當(dāng)抗原結(jié)合分子與膜型抗原結(jié)合時(shí)，認(rèn)為其無(wú)法與FcRn結(jié)合，因此，作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，當(dāng)抗原為膜型抗原時(shí)，可以列舉下述方法:通過(guò)使抗原結(jié)合分子在核內(nèi)體內(nèi)的PH(酸性pH)下的抗原結(jié)合能力弱于在血漿中的pH(中性pH)下的抗原結(jié)合能力，促進(jìn)核內(nèi)體內(nèi)的抗原結(jié)合分子從抗原上解離，促進(jìn)抗原結(jié)合分子與FcRn的結(jié)合。當(dāng)抗原為可溶型抗原時(shí)，可以列舉下述方法:無(wú)論是否存在抗原的結(jié)合，抗原結(jié)合分子可以與FcRn結(jié)合，但若通過(guò)使抗原結(jié)合分子在核內(nèi)體內(nèi)的pH(酸性pH)下的抗原結(jié)合能力弱于在血漿中的pH(中性pH)下的抗原結(jié)合能力，在核內(nèi)體內(nèi)可以促進(jìn)抗原從抗原結(jié)合分子上解離，則會(huì)促進(jìn)“未與抗原結(jié)合”的抗原結(jié)合分子與FcRn的結(jié)合。無(wú)論抗原是膜型還是可溶型，只要未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子可以通過(guò)FcRn返回到血漿中，就可以再次與抗原結(jié)合，因此通過(guò)重復(fù)此過(guò)程，抗原結(jié)合分子可以多次與抗原結(jié)合。本發(fā)明中，“促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子與FcRn的結(jié)合”是指，不必所有抗原結(jié)合分子都與FcRn結(jié)合，只要與使抗原結(jié)合分子在核內(nèi)體內(nèi)的pH下的抗原結(jié)合能力弱于在血漿中的PH下的抗原結(jié)合能力之前相比，細(xì)胞內(nèi)與FcRn結(jié)合而未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的比例增加即可。在本發(fā)明的促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子與FcRn的結(jié)合的方法中，優(yōu)選的抗原結(jié)合分子的例子有:與膜蛋白等膜型抗原(膜抗原)結(jié)合的抗原結(jié)合分子。其他優(yōu)選的抗原結(jié)合分子的例子有:與可溶型蛋白等可溶型抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子。促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子與FcRn的結(jié)合的方法，還可稱作是增強(qiáng)抗原結(jié)合分子與細(xì)胞內(nèi)(例如核內(nèi)體內(nèi))的FcRn的結(jié)合活性的方法。本發(fā)明還涉及:通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法。本發(fā)明中，“使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外”是指，不必所有以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子都以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外，只要與使抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合能力低于在中性pH下的抗原結(jié)合能力之前相比，被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子的比例增加即可。優(yōu)選被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子維持抗原結(jié)合能力。使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法，在抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合攝入細(xì)胞內(nèi)的情況下，也可說(shuō)成是賦予抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)容易被釋放到細(xì)胞外的性質(zhì)的方法。本發(fā)明還涉及:通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，來(lái)增加抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力的方法。本發(fā)明中，“血漿中抗原消除能力”是指，對(duì)體內(nèi)給予抗原結(jié)合分子或機(jī)體分泌時(shí)，使存在于血漿中的抗原從血漿中消除的能力。因此，本發(fā)明中，“抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力增加”是指，對(duì)體內(nèi)給予抗原結(jié)合分子時(shí)，只要與使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力低于在中性PH下的抗原結(jié)合能力之前相比，抗原從血漿中消除的速度加快即可?？乖Y(jié)合分子的血漿中抗原消除能力是否增加，例如可以通過(guò)對(duì)體內(nèi)給予可溶型抗原和抗原結(jié)合分子，測(cè)定給藥后的可溶型抗原的血漿中 濃度來(lái)判斷。通過(guò)使抗原結(jié)合分子在酸性PH下的抗原結(jié)合能力低于在中性pH下的抗原結(jié)合能力，給予可溶型抗原和抗原結(jié)合分子后血漿中的可溶型抗原的濃度降低時(shí)，可以判斷抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力增加。本發(fā)明還涉及:通過(guò)用組氨酸或非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸、或插入組氨酸或非天然氨基酸來(lái)提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法。本發(fā)明還提供:通過(guò)用組氨酸或非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸、或插入組氨酸或非天然氨基酸來(lái)增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法。本發(fā)明還涉及:通過(guò)用組氨酸或非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸、或插入組氨酸或非天然氨基酸來(lái)增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的方法。本發(fā)明還提供:通過(guò)用組氨酸或非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸、或插入組氨酸或非天然氨基酸，使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法。本發(fā)明還提供:通過(guò)用組氨酸或非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸、或插入組氨酸或非天然氨基酸，使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法。本發(fā)明還提供:通過(guò)用組氨酸或非天然氨基酸取代抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸、或插入組氨酸或非天然氨基酸，使抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力增加的方法。對(duì)導(dǎo)入組氨酸或非天然氨基酸突變(取代、插入等)的位點(diǎn)沒(méi)有特別限定，任何位點(diǎn)均可取代成組氨酸或非天然氨基酸，或者可以在任何位點(diǎn)插入組氨酸或非天然氨基酸。取代成組氨酸或非天然氨基酸或插入組氨酸或非天然氨基酸的位點(diǎn)的優(yōu)選例子有:影響抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合能力的區(qū)。例如，當(dāng)抗原結(jié)合分子為抗體時(shí)，可以列舉抗體的可變區(qū)或CDR等。對(duì)導(dǎo)入組氨酸或非天然氨基酸突變的數(shù)沒(méi)有特別限定，可以用組氨酸或非天然氨基酸只取代I個(gè)位點(diǎn)，或只在I個(gè)位點(diǎn)插入組氨酸或非天然氨基酸?；蛘?，可以用組氨酸或非天然氨基酸取代2個(gè)位點(diǎn)以上的多個(gè) 位點(diǎn)，或者在多個(gè)位點(diǎn)插入組氨酸或非天然氨基酸。除了用組氨酸或非天然氨基酸取代或插入以外，可以同時(shí)進(jìn)行其他氨基酸的缺失、添力口、插入和/或取代等。本發(fā)明中，作為取代成組氨酸或非天然氨基酸的位點(diǎn)的例子，當(dāng)抗原結(jié)合分子為抗體時(shí)，考慮抗體的CDR序列或決定CDR的結(jié)構(gòu)的序列作為修飾位點(diǎn)，可以列舉例如以下位點(diǎn)。氨基酸位點(diǎn)以 Kabat 編號(hào)(Kabat EA 等人.1991.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.NIH)表不。重鏈:H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、HlOOb、H102輕鏈:L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92、L94這些修飾位點(diǎn)中，認(rèn)為H32、H61、L53、L90、L94是普遍性高的修飾位點(diǎn)。雖然沒(méi)有特別限定，但在作為抗原為IL-6受體(例如人IL-6受體)時(shí)的優(yōu)選的修飾位點(diǎn)，可以列舉以下位點(diǎn)。重鏈:H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、HlOOb、H102輕鏈:L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92、L94組合多個(gè)位點(diǎn)并取代成組氨酸或非天然氨基酸時(shí)，優(yōu)選的組合的具體例子有:例如 H27、H31、H35 的組合；H27、H31、H32、H35、H58、H62、H102 的組合;L32、L53 的組合；L28、L32、L53的組合等。并且，作為重鏈與輕鏈的取代位點(diǎn)的優(yōu)選組合的例子，可以列舉:H27、H31、L32、L53 的組合。雖然沒(méi)有特別限定，但在抗原為IL_6(例如人IL-6)的情況下，作為優(yōu)選的修飾位點(diǎn)，可以列舉以下位點(diǎn)。重鏈:!132、昍9、冊(cè)1、!199輕鏈:L53、L54、L90、L94雖然沒(méi)有特別限定，但在抗原為IL-31受體(例如人IL-31受體)的情況下，優(yōu)選的修飾位點(diǎn)有H33。這些位點(diǎn)中，可以只將I個(gè)位點(diǎn)用組氨酸或非天然氨基酸取代，也可以將多個(gè)位點(diǎn)用組氨酸或非天然氨基酸取代。本發(fā)明的方法可適用于不依賴靶抗原的種類的任意抗原結(jié)合分子。本發(fā)明中，抗原結(jié)合分子只要是與作為對(duì)象的抗原具有特異性的結(jié)合活性的物質(zhì)即可，沒(méi)有特別限定，抗原結(jié)合分子的優(yōu)選的例子有:具有抗體的抗原結(jié)合區(qū)的物質(zhì)。抗體的抗原結(jié)合區(qū)的例子有:CDR或可變區(qū)。當(dāng)抗體的抗原結(jié)合區(qū)為CDR時(shí)，可以包含全長(zhǎng)抗體所含的全部6個(gè)⑶R，也可以包含I個(gè)或2個(gè)以上的⑶R。當(dāng)包含⑶R作為抗體的結(jié)合區(qū)時(shí)，所含的CDR可以進(jìn)行氨基酸的缺失、取代、添加和/或插入等，或者可以是CDR的一部分。當(dāng)抗原結(jié)合分子中包含抗體恒定區(qū)時(shí)，本發(fā)明還涉及:通過(guò)修飾(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)，來(lái)提高抗原結(jié)合分子的藥物動(dòng)力學(xué)的方法。

當(dāng)抗原結(jié)合分子中包含抗體恒定區(qū)時(shí)，本發(fā)明還提供:通過(guò)修飾(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)，來(lái)增加抗原結(jié)合分子與抗原的結(jié)合次數(shù)的方法。當(dāng)抗原結(jié)合分子中包含抗體恒定區(qū)時(shí)，本發(fā)明還涉及:通過(guò)修飾(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)，來(lái)增加抗原結(jié)合分子所能結(jié)合的抗原數(shù)的方法。當(dāng)抗原結(jié)合分子中包含抗體恒定區(qū)時(shí)，本發(fā)明還涉及:通過(guò)修飾(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)，使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)從抗原結(jié)合分子上解離的方法。當(dāng)抗原結(jié)合分子中包含抗體恒定區(qū)時(shí)，本發(fā)明還涉及:通過(guò)修飾(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)，使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的方法。當(dāng)抗原結(jié)合分子中包含抗體恒定區(qū)時(shí)，本發(fā)明還涉及:通過(guò)修飾(氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入等)抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)，使抗原結(jié)合分子的血漿中抗原消除能力增加的方法。作為本發(fā)明的抗原結(jié)合物質(zhì)的優(yōu)選方案，可以列舉包含F(xiàn)cRn結(jié)合區(qū)的抗原結(jié)合物質(zhì)。包含F(xiàn)cRn結(jié)合區(qū)的抗原結(jié)合物質(zhì)可以通過(guò)FcRn的補(bǔ)救路徑攝入細(xì)胞內(nèi)，之后再次返回到血漿中。FcRn結(jié)合區(qū)優(yōu)選為直接與FcRn結(jié)合的區(qū)。FcRn結(jié)合區(qū)的優(yōu)選的例子有:抗體的Fe區(qū)。但是，白蛋白或IgG等的能夠和與FcRn具有結(jié)合能力的多肽結(jié)合的區(qū)，可以經(jīng)由白蛋白或IgG等間接地與FcRn結(jié)合，因此，本發(fā)明中的FcRn結(jié)合區(qū)可以是和與這樣的FcRn具有結(jié)合能力的多肽結(jié)合的區(qū)。對(duì)作為本發(fā)明的方法的對(duì)象的抗體等的抗原結(jié)合分子所識(shí)別的抗原沒(méi)有特別限定，可以以識(shí)別任何抗原的抗體作為對(duì)象。利用本發(fā)明的方法提高藥物動(dòng)力學(xué)的抗體的例子有:例如識(shí)別受體蛋白(膜結(jié)合型受體、可溶型受體)或細(xì)胞表面標(biāo)志物等膜抗原的抗體、識(shí)別細(xì)胞因子等可溶型抗原的抗體等。本發(fā)明中，膜抗原的優(yōu)選的例子有:膜蛋白。本發(fā)明中，可溶型抗原的例子有:可溶型蛋白。利用本發(fā)明的方法使藥物動(dòng)力學(xué)提高的抗體所識(shí)別的抗原的具體例子有:例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL_8、IL-9、IL-10、IL-1U IL-12、IL-15、IL-31、IL-23、IL-2 受體、IL-6 受體、OSM 受體、gpl30、IL-5受體、CD40、CD4、Fas、骨橋蛋白、CRTH2、CD26、PDGF-D、CD20、單核細(xì)胞趨化活化因子、CD23、TNF-a ,HMGB-U α 4 整合素、ICAM_l、CCR2、CDlla、CD3、IFN Y、BLyS、HLA_DR、TGF_ β、CD52、IL-31受體等。特別優(yōu)選的抗原有IL-6受體。作為本發(fā)明的方法的對(duì)象的抗原結(jié)合分子，可以列舉:具有拮抗活性的抗原結(jié)合分子(拮抗抗原結(jié)合分子)、具有激動(dòng)活性的抗原結(jié)合分子(激動(dòng)抗原結(jié)合分子)等，作為優(yōu)選方案，可以列舉:拮抗抗原結(jié)合分子、特別是識(shí)別受體等的膜抗原或細(xì)胞因子等的可溶型抗原的拮抗抗原結(jié)合分子。例如，識(shí)別受體的拮抗抗原結(jié)合分子是與受體結(jié)合，阻礙受體與其配體的結(jié)合，抑制由受體介導(dǎo)的信號(hào)傳遞的抗原結(jié)合分子。本發(fā)明中，對(duì)作為對(duì)象的抗原結(jié)合分子沒(méi)有特別限定，可以是任何的抗原結(jié)合分子。本發(fā)明中使用的抗原結(jié)合分子優(yōu)選具有抗原結(jié)合活性(抗原結(jié)合區(qū))和FcRn結(jié)合區(qū)。本發(fā)明中，特別優(yōu)選為包含人FcRn結(jié)合區(qū)的抗原結(jié)合分子。具有抗原結(jié)合活性和FcRn結(jié)合區(qū)的抗原結(jié)合分子的例子有抗體。本發(fā)明的抗體的優(yōu)選例子有IgG抗體。使用IgG抗體作為抗體時(shí)，對(duì)其種類沒(méi)有限定，可以使用IgGl、IgG2、IgG3、IgG4等同種型(亞綱)的IgG0對(duì)于這些同種型的IgG的恒定區(qū)，可以象M73那樣，向恒定區(qū)部分導(dǎo)入氨基酸突變。導(dǎo)入的氨基酸突變可以列舉:例如增大或減少與Fe Y受體的結(jié)合的氨基酸突變(Proc NatlAcad Sci U S A.2006Mar l4 ； 103 (I I):4005-10)、增大或減少與FcRn的結(jié)合的氨基酸突變(J Biol Chem.2001Mar2 ；276(9) =6591-604)等，但并不限于這些。另外，通過(guò)選擇IgG2等的適當(dāng)?shù)暮愣▍^(qū)，也可以改變pH依賴性結(jié)合。當(dāng)作為本發(fā)明的對(duì)象的抗原結(jié)合分子為抗體時(shí)，抗體可以是小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等來(lái)源于任一種動(dòng)物的抗體。而且，可以是例如嵌合抗體、其中人源化抗體等取代了氨基酸序列的修飾抗體。還可以是雙重特異性抗體、結(jié)合有各種分子的抗體修飾物、包含抗體片段的多肽等?！扒逗峡贵w”是指將來(lái)源于不同動(dòng)物的序列組合而制作的抗體。嵌合抗體的具體例子有:例如包括小鼠抗體的重鏈、輕鏈的可變(V)區(qū)和人抗體的重鏈、輕鏈的恒定(C)區(qū)的抗體。“人源化抗體”也稱作重構(gòu)(reshaped)人抗體，是將來(lái)源于人以外的哺乳動(dòng)物的抗體、例如小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R，complementarity determining region)移植到人抗體的⑶R中而得到的抗體。用于鑒定⑶R的方法是公知的(Kabat等人，Sequenceof Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health,Bethesda, Md.;Chothia等人，Nature (1989) 342:877)。另外，其通常的基因重組方法也是公知的(參照歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP125023號(hào)公報(bào)、W096/02576號(hào)公報(bào))。
雙重特異性抗體是指在同一抗體分子內(nèi)具有識(shí)別不同表位的可變區(qū)的抗體。雙重特異性抗體可以是識(shí)別2個(gè)以上不同抗原的抗體，也可以是識(shí)別同一抗原上的不同的2個(gè)以上表位的抗體。作為包含抗體片段的多肽，例如有Fab片段、F (ab’)2片段、scFv (NatBiotechnol.2005Sep ;23 (9):1126-36)結(jié)構(gòu)域抗體(dAb) (W02004/058821，W02003/002609)、scFv_Fc (W02005037989)、dAb_Fc、Fc 融合蛋白等。這些分子中，特別是包含F(xiàn)e區(qū)的分子具有與FcRn的結(jié)合活性，所以適于采用本發(fā)明中發(fā)現(xiàn)的方法。并且，本發(fā)明可以使用的抗原結(jié)合分子可以是抗體樣分子?？贵w樣分子是指通過(guò)與祀分子結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用的分子(Current Opinion in Biotechnology2006,17:653_658、Current Opinion in Biotechnology 2007,18:1-10、Current Opinionin Structural Biologyl997,7:463-469> Protein Science2006,15:14-27),例如有DARPins(W02002/020565)、Affibody (親和體)(WOl995A)Ol937)、Avimer (冊(cè)2004/044011，W02005/040229) ,Adnectin(W02002/032925)等。即使是這些抗體樣分子，只要其能夠與靶分子進(jìn)行PH依賴性結(jié)合，就可以以I分子與多個(gè)靶分子結(jié)合?？乖Y(jié)合分子可以是進(jìn)行靶向結(jié)合的受體蛋白和受體Fe融合蛋白，例如有TNFR-Fc融合蛋白、ILlR-Fc融合蛋白、VEGFR-Fc融合蛋白、CTLA4_Fc融合蛋白等(NatMed.2003Jan ；9(1):47-52, BioDrugs.2006 ；20(3):151-60)。即使是這些受體蛋白和受體Fe融合蛋白，只要其能夠與靶分子進(jìn)行pH依賴性結(jié)合，就可以以I分子與多個(gè)靶分子結(jié)合?？乖Y(jié)合分子還可以是與靶向結(jié)合具有中和效果的人工配體蛋白和人工配體融合蛋白，例如有突變IL-6(EMB0 J.1994Decl5 ；13(24):5863-70)等。即使是這些人工配體蛋白和人工配體融合蛋白，只要其能夠與靶分子進(jìn)行pH依賴性結(jié)合，就可以以I分子與多個(gè)革El分子結(jié)合。并且，本發(fā)明的抗體可以是糖鏈被修飾的抗體。糖鏈被修飾的抗體的例子有:例如糖苷化修飾的抗體(W099/54342等)、糖鏈中添加的巖藻糖缺失的抗體(W000/61739、W002/31140, W02006/067·847, W02006/067913 等)、具有含二等分(bisecting)GlcNAc 的糖鏈的抗體(W002/79255等)等。本發(fā)明的方法不受特定理論的限定，例如使酸性pH下的抗原結(jié)合能力弱于中性PH下的抗原結(jié)合能力、提高藥物動(dòng)力學(xué)、以及多次與抗原結(jié)合的關(guān)系可以如下說(shuō)明。例如，當(dāng)抗體是與膜抗原結(jié)合的抗體時(shí)，給予體內(nèi)的抗體與抗原結(jié)合，之后抗體保持著與抗原結(jié)合的狀態(tài)和抗原一起通過(guò)內(nèi)化作用攝入細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)體中。之后，抗體保持著與抗原結(jié)合的狀態(tài)向溶酶體移動(dòng)，抗體與抗原一起被溶酶體分解。由內(nèi)化作用介導(dǎo)的從血漿中的消除被稱作抗原依賴性消除，在大多數(shù)抗體分子中有報(bào)道(Drug DiscovToday.2006Jan ;11(1_2):81-8)。當(dāng)I分子的IgG抗體以二價(jià)與抗原結(jié)合時(shí)，以I分子的抗體與2分子的抗原結(jié)合的狀態(tài)被內(nèi)化，直接被溶酶體分解。因此，當(dāng)為普通抗體時(shí)，I分子的IgG抗體無(wú)法與3分子以上的抗原結(jié)合。例如，當(dāng)為具有中和活性的I分子的IgG抗體時(shí)，無(wú)法中和3分子以上的抗原。IgG分子的血漿中滯留性較長(zhǎng)(消除慢)，這是由于作為IgG分子的補(bǔ)救受體而已知的FcRn在起作用。通過(guò)胞飲作用攝入核內(nèi)體中的IgG分子，其在核內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下與在核內(nèi)體內(nèi)表達(dá)的FcRn結(jié)合。無(wú)法與FcRn結(jié)合的IgG分子攝入溶酶體內(nèi)，被溶酶體分解，但與FcRn結(jié)合的IgG分子向細(xì)胞表面移動(dòng)，在血漿中的中性條件下自FcRn上解離，又返回到血漿中。當(dāng)抗體是與可溶型抗原結(jié)合的抗體時(shí)，給予體內(nèi)的抗體與抗原結(jié)合，之后抗體保持著與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)。攝入細(xì)胞內(nèi)的抗體多半通過(guò)FcRn被釋放到細(xì)胞外，但由于是保持著與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外，因此無(wú)法再次與抗原結(jié)合。因此，和與膜抗原結(jié)合的抗體一樣，當(dāng)為普通抗體時(shí)，I分子的IgG抗體無(wú)法與3分子以上的抗原結(jié)合。本發(fā)明人等認(rèn)為:通過(guò)內(nèi)化作用與膜抗原等抗原結(jié)合的抗體攝入細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)體中時(shí)，與抗原結(jié)合著的抗體移動(dòng)到溶酶體中被分解，相對(duì)于此，在核內(nèi)體內(nèi)抗原已解離的IgG抗體可以與在核內(nèi)體內(nèi)表達(dá)的FcRn結(jié)合。即，本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn):在血漿中與抗原強(qiáng)力結(jié)合、在核內(nèi)體內(nèi)與抗原微弱結(jié)合的抗體，在血漿中與抗原結(jié)合，與抗原形成復(fù)合體，在此狀態(tài)下通過(guò)內(nèi)化作 用攝入細(xì)胞內(nèi)的核內(nèi)體內(nèi)，在核內(nèi)體內(nèi)與抗原解離后，與FcRn結(jié)合并向細(xì)胞表面移動(dòng)，以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)再次返回到血漿中，可以中和多個(gè)膜型抗原。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn):具有在血漿中與抗原強(qiáng)力結(jié)合、在核內(nèi)體內(nèi)與抗原微弱結(jié)合的性質(zhì)的抗體，即使在與可溶型抗原等抗原結(jié)合的情況下，在核內(nèi)體內(nèi)也與抗原解離，因此以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)再次被釋放到血漿中，可以中和多個(gè)可溶型抗原。特別是本發(fā)明人等著眼于血漿中的pH與核內(nèi)體內(nèi)的pH不同，發(fā)現(xiàn)在血漿中的pH條件下與抗原強(qiáng)力結(jié)合、在核內(nèi)體內(nèi)的pH條件下與抗原微弱結(jié)合的抗體，I個(gè)抗體分子可以與多個(gè)抗原結(jié)合，血漿中滯留性優(yōu)異。核內(nèi)體是膜小胞之一，在真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)形成網(wǎng)絡(luò)，在從細(xì)胞膜到溶酶體的過(guò)程中掌管高分子的代謝。據(jù)報(bào)道，核內(nèi)體內(nèi)的pH通常為pH5.5 pH6.0的酸性(Nat RevMol Cell Biol.2004Feb ；5(2):121-32)，又已知血漿中的pH幾乎為中性(通常為ρΗ7.4)。因此，酸性pH下的抗原結(jié)合活性弱于中性pH下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子在中性pH的血漿中與抗原結(jié)合攝入細(xì)胞內(nèi)，之后在酸性pH的核內(nèi)體內(nèi)與抗原解離。與抗原解離的抗原結(jié)合分子與FcRn結(jié)合并向細(xì)胞表面移動(dòng)，以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)再次返回到血漿中，結(jié)果，可以與抗原多次結(jié)合，藥物動(dòng)力學(xué)提高。<抗原結(jié)合分子物質(zhì)>本發(fā)明還提供在pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性低于在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子、優(yōu)選在pH5.0 pH6.0下的抗原結(jié)合活性低于在pH7.0
8.0下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子。在pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性低于在pH6.7 10.0下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的具體例子有:pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于PH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子。pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于pH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子還可稱作PH7.4下的抗原結(jié)合活性高于pH5.8下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子。本發(fā)明的pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于pH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子，只要其在PH5.8下的抗原結(jié)合活性低于在pH7.4下的結(jié)合即可，對(duì)其結(jié)合活性之差沒(méi)有限定，即使差別甚微但只要PH5.8下的抗原結(jié)合活性低即可。作為本發(fā)明的pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于pH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的優(yōu)選方案，可以列舉PH7.4下的抗原結(jié)合活性為pH5.8下的抗原結(jié)合活性的兩倍以上的抗原結(jié)合分子；作為進(jìn)一步優(yōu)選的方案，可以列舉PH7.4下的抗原結(jié)合活性為pH5.8下的抗原結(jié)合活性的10倍以上的抗原結(jié)合分子；作為更優(yōu)選的方案，可以列舉pH7.4下的抗原結(jié)合活性為pH5.8下的抗原結(jié)合活性的40倍以上的抗原結(jié)合分子。具體而言，作為本發(fā)明的pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于pH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的優(yōu)選方案，對(duì)于抗原的在PH5.8下的KD與在pH7.4下的KD之比、SPKD (pH5.8) /KD (pH7.4)的值為2以上，進(jìn)一步優(yōu)選KD (pH5.8) /KD (pH7.4)的值為10以上，更進(jìn)一步優(yōu)選KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值為40以上。對(duì)KD (pH5.8) /KD (ρΗ7.4)的值的上限沒(méi)有特別限定，只要在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)中可以制作，可以是400、1000、10000等任何值。并且，作為本發(fā)明的在ρΗ5.8下的抗原結(jié)合活性低于在ρΗ7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的其他優(yōu)選方案，對(duì)于抗原在ΡΗ5.8下的kd與在pH7.4下的kd之比、SPkd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值為2以上，優(yōu)選kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值為5以上，進(jìn)一步優(yōu)選kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值為10以上，更進(jìn)一步優(yōu)選kd (pH5.8)/kd(pH7.4)的值為30以上。對(duì)&( !15.8)/\1( !17.4)的值的上限沒(méi)有特別限定，只要在本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)中可以制作，可以是50、100、200等任何值。測(cè)定抗原的結(jié)合活性時(shí)，除pH以外的條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)選擇，沒(méi)有特別限定，例如，如實(shí)施例所述，可以在MES緩沖液中、37°C的條件下進(jìn)行測(cè)定。另外，抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的測(cè)定可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行，例如，如實(shí)施例所述，可以使用Biacore TlOO (GE Healthcare)等進(jìn)行測(cè)定。認(rèn)為這樣的在酸性pH下與抗原微弱結(jié)合的抗原結(jié)合分子在核內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下容易自抗原上解離，認(rèn)為其在細(xì)胞內(nèi)被內(nèi)化后與FcRn結(jié)合，容易被釋放到細(xì)胞外。在細(xì)胞內(nèi)未被分解而被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子可以再次與抗原結(jié)合。因此，例如當(dāng)抗原結(jié)合分子為中和抗原結(jié)合分子時(shí)，在核內(nèi)體內(nèi)的酸性條件下容易自抗原上解離的抗原結(jié)合分子可以多次與 抗原結(jié)合并中和抗原。結(jié)果，PH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性低于PH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子成為血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子。作為在pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的優(yōu)選方案，可以列舉抗原結(jié)合分子中的至少I個(gè)氨基酸被取代成組氨酸或非天然氨基酸、或插入有至少I個(gè)組氨酸或非天然氨基酸的抗原結(jié)合分子。對(duì)導(dǎo)入組氨酸或非天然氨基酸突變的位點(diǎn)沒(méi)有特別限定，只要與取代前相比PH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于pH7.4下的抗原結(jié)合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值變大、或kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值變大)，可以是任何位點(diǎn)。例如，當(dāng)抗原結(jié)合分子為抗體時(shí)，可以是抗體的可變區(qū)或CDR等。被取代成組氨酸或非天然氨基酸的氨基酸的數(shù)或插入的氨基酸的數(shù)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適當(dāng)確定，可以用組氨酸或非天然氨基酸取代I個(gè)氨基酸，也可以插入I個(gè)氨基酸，還可以用組氨酸或非天然氨基酸取代2個(gè)以上的多個(gè)氨基酸，也可以插入2個(gè)以上的氨基酸。另外，除取代成組氨酸或非天然氨基酸、或者插入組氨酸或非天然氨基酸以外，還可以同時(shí)進(jìn)行其他氨基酸的缺失、添加、插入和/或取代等。取代成組氨酸或非天然氨基酸、或者插入組氨酸或非天然氨基酸，這可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的將丙氨酸分區(qū)的丙氨酸取代成組氨酸的組氨酸分區(qū)等方法隨機(jī)進(jìn)行，也可以從隨機(jī)導(dǎo)入了組氨酸或非天然氨基酸突變的抗原結(jié)合分子中選擇與突變前相比KD(pH5.8)/KD(pH7.4)或kd(pH5.8)/kd(pH7.4)的值變大的抗原結(jié)合分子。作為如此地突變成組氨酸或非天然氨基酸、且在pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于在PH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的優(yōu)選例子，可以列舉如:突變成組氨酸或非天然氨基酸后在PH7.4下的抗原結(jié)合活性與突變成組氨酸或非天然氨基酸之前在pH7.4下的抗原結(jié)合活性同等的抗原結(jié)合分子。本發(fā)明中，組氨酸或非天然氨基酸突變后的抗原結(jié)合分子與組氨酸或非天然氨基酸突變前的抗原結(jié)合分子具有同等的抗原結(jié)合活性，是指以組氨酸或非天然氨基酸突變前的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性為100%時(shí)，組氨酸或非天然氨基酸突變后的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性至少為10%以上、優(yōu)選50%以上、進(jìn)一步優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選為90%以上。組氨酸或非天然氨基酸突變后在pH7.4下的抗原結(jié)合活性可以高于組氨酸或非天然氨基酸突變前在PH7.4下的抗原結(jié)合活性。通過(guò)組氨酸或非天然氨基酸的取代或插入，抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性變低時(shí)，可以通過(guò)取代、缺失、添加和/或插入抗原結(jié)合分子中的I個(gè)或多個(gè)氨基酸等，使抗原結(jié)合活性與組氨酸取代或插入前的抗原結(jié)合活性同等。本發(fā)明還包含:在這樣的組氨酸取代或插入后，通過(guò)進(jìn)行I個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、缺失、添加和/或插入，使結(jié)合活性同等的抗原結(jié)合分子。并且，當(dāng)抗原結(jié)合分子為包含抗體恒定區(qū)的物質(zhì)時(shí)，在pH5.8下的抗原結(jié)合活性低于在PH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的其他優(yōu)選方案有:修飾抗原結(jié)合分子中所含的抗體恒定區(qū)的方法。修飾后的抗體恒定區(qū)的具體例子有:例如實(shí)施例中記載的恒定區(qū)。利用上述方法等使抗原結(jié)合物質(zhì)的pH5.8下的抗原結(jié)合活性弱于pH7.4下的抗原結(jié)合活性(KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值變大)時(shí)，雖然沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選與原始抗體相t匕，KD(pH5.8)/KD(pH7.4)的值通常為2倍以上、優(yōu)選5倍以上、進(jìn)一步優(yōu)選10倍以上。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子，只要其在pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性低于在PH6.7 10.0下的抗原結(jié)合活性，除此之外可以具有任何性質(zhì)，例如可以是激動(dòng)抗原結(jié)合分子或拮抗抗原結(jié)合分子等。本發(fā)明的優(yōu)選的抗原結(jié)合分子的例子有:拮抗抗原結(jié)合分子。拮抗抗原結(jié)合分子通常是抑制配體(激動(dòng)劑)與受體的結(jié)合、抑制受體介導(dǎo)的向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號(hào)的抗原結(jié)合分子。本發(fā)明還提供:以下的至少I個(gè)位點(diǎn)的氨基酸被取代成組氨酸或非天然氨基酸的抗體。氨基酸位點(diǎn)以 Kabat 編號(hào)(Kabat EA 等人.1991.Sequences of Proteins ofImmunological Interest.NIH)表不。重鏈:H27、H31、H32、H33、H35、H50、H58、H59、H61、H62、H63、H64、H65、H99、HlOOb、H102輕鏈:L24、L27、L28、L32、L53、L54、L56、L90、L92、L94這些修飾位點(diǎn)中，認(rèn)為H32、H61、L53、L90、L94是普遍性高的修飾位點(diǎn)。雖然沒(méi)有特別限定，但在抗原為IL-6受體(例如人IL-6受體)的情況下，優(yōu)選的修飾位點(diǎn)有以下位點(diǎn)。重鏈:H27、H31、H32、H35、H50、H58、H61、H62、H63、H64、H65、HlOOb、H102輕鏈:L24、L27、L28、L32、L53、L56、L90、L92、L94將多個(gè)位點(diǎn)組合起來(lái)取代成組氨 酸或非天然氨基酸時(shí)，優(yōu)選的組合的具體例子有:例如 H27、H31、H35 的組合，H27、H31、H32、H35、H58、H62、H102 的組合，L32、L53 的組合，L28、L32、L53的組合等。并且，重鏈與輕鏈的取代位點(diǎn)的優(yōu)選組合的例子有:H27、H31、L32、L53的組合。雖然沒(méi)有特別限定，但在抗原為IL-6 (例如人IL-6)的情況下，優(yōu)選的修飾位點(diǎn)有以下位點(diǎn)。重鏈:!132、昍9、冊(cè)1、!199輕鏈:L53、L54、L90、L94雖然沒(méi)有特別限定，但在抗原為IL-31受體(例如人IL-31受體)的情況下，優(yōu)選的修飾位點(diǎn)有H33。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子所識(shí)別的抗原可以是任何抗原。本發(fā)明的抗體所識(shí)別的抗原的具體例子有:上述受體蛋白(膜結(jié)合型受體、可溶型受體)、細(xì)胞表面標(biāo)志物等膜抗原或細(xì)胞因子等可溶型抗原、例如 IL-1、IL-2、IL-3、IL_4、IL_5、IL_6、IL_7、IL_8、IL-9、IL-10、IL-1U IL- 12、IL-15、IL-31、IL-23、IL-2 受體、IL-6 受體、OSM 受體、gpl30、IL-5受體、CD40、CD4、Fas、骨橋蛋白、CRTH2、CD26、PDGF-D, CD20、單細(xì)胞趨化活化因子、CD23、TNF-a ,HMGB-U α 4 整合素、ICAM-1、CCR2、CDlla、CD3、IFN Y、BLyS、HLA_DR、TGF_ β、CD52、IL-31受體等。特別優(yōu)選的抗原例如有:IL_6受體。本發(fā)明的抗原結(jié)合分子如上所述。本發(fā)明中，作為抗原結(jié)合分子的優(yōu)選的方案，可以列舉抗體。具有抗原結(jié)合活性和FcRn結(jié)合區(qū)的抗體的例子有:IgG抗體。使用IgG抗體作為抗體時(shí)，對(duì)其種類沒(méi)有限定，可以使用 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4 等。對(duì)本發(fā)明的抗體的來(lái)源沒(méi)有特別限定，可以是任何來(lái)源的抗體，可以使用例如小鼠抗體、人抗體、大鼠抗體、兔抗體、山羊抗體、駱駝抗體等。而且，可以是例如上述嵌合抗體、其中人源化抗體等取代了氨基酸序列的修飾抗體。還可以是上述的雙重特異性抗體、結(jié)合有各種分子的抗體修飾物、包含抗體片段的多肽、糖鏈修飾抗體等。嵌合抗體的制作是公知的，例如，當(dāng)為人-小鼠嵌合抗體時(shí)，連接編碼抗體V區(qū)的DNA和編碼人抗體C區(qū)的DNA，將其插入表達(dá)載體中并導(dǎo)入到宿主中產(chǎn)生抗體，從而可以得到嵌合抗體?！叭嗽椿贵w”也稱作重構(gòu)(reshaped)人抗體，是將來(lái)源于人以外的哺乳動(dòng)物的抗體例如小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)移植到人抗體的CDR中而得到的抗體。用于鑒定 CDR 的方法是公知的(Kabat 等人，Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.；Chothia 等人，Nature (1989) 342:877)。另外，其通常的基因重組方法也是公知的(參照歐洲專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)EP125023號(hào)公報(bào)、W096/02576號(hào)公報(bào))。人源化抗體可以利用公知的方法如下產(chǎn)生:例如，確定小鼠抗體的CDR，將該CDR和人抗體的構(gòu)架區(qū)(FR)連接得到抗體，獲取編碼所得抗體的DNA，之后通過(guò)使用通常的表達(dá)載體的系統(tǒng)產(chǎn)生人源化抗體。上述DNA可以使用多個(gè)寡核苷酸作為引物，通過(guò)PCR法來(lái)合成，上述寡核苷酸制作成在CDR和FR的末端區(qū)均具有重疊部分(參照W098/13388號(hào)公報(bào)中記載的方法)。選擇經(jīng)由⑶R連接的人抗體的FR，使CDR形成良好的抗原結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)需要，可以修飾抗體可變區(qū)中FR的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的CDR形成合適的抗原結(jié)合位點(diǎn)(Sato等人，Cancer Res.(1993)53:10.01-6)。在可修飾的FR中的氨基酸殘基中，包括通過(guò)非共價(jià)鍵直接與抗原結(jié)合的部分(Amit等人，Science (1986) 233:747-53)、影響或作用于 CDR 結(jié)構(gòu)的部分(Chothia 等人，J.Mol.Biol.(1987) 196 =901-17)以及與VH-VL相互作用有關(guān)的部分(EP239400號(hào)專利公報(bào))。當(dāng)本發(fā)明中的抗體為嵌合抗體或人源化抗體時(shí)，上述抗體的C區(qū)優(yōu)選使用來(lái)源于人抗體的C區(qū)。例如，在H鏈中可以使用Cy 1、Cy2、Cy3、Cy4等；在L鏈中可以使用Ck、CA等。為了增大或降低與Fcy受體或FcRn的結(jié)合、為了改善抗體的穩(wěn)定性或抗體的產(chǎn)生，根據(jù)需要可以向人抗體C區(qū)中導(dǎo)入氨基酸突變。本發(fā)明中的嵌合抗體優(yōu)選包含來(lái)源于人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的可變區(qū)和來(lái)源于人抗體的恒定區(qū)。而人源化抗體優(yōu)選包含來(lái)源于人以外的哺乳動(dòng)物的抗體的CDR和來(lái)源于人抗體的FR和C區(qū)。來(lái)源于人抗體的恒定區(qū)優(yōu)選包含F(xiàn)cRn結(jié)合區(qū)，這樣的抗體的例子有:IgG(IgGl、IgG2、IgG3、IgG4)。本發(fā)明中的人源化抗體所使用的恒定區(qū)可以是屬于任意同種型的抗體的恒定區(qū)。優(yōu)選使用人IgG的恒定區(qū)，但并不受限于此。對(duì)用于人源化抗體的來(lái)源于人抗體的FR也沒(méi)有特別限定，可以是屬于任意同種型的抗體的FR。本發(fā)明中的嵌合抗體和人源化抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)，只要顯示出原始抗體的結(jié)合特異性即可，可以通過(guò)缺失、取代、插入和/或添加等進(jìn)行修飾。使用來(lái)源于人的序列得到的嵌合抗體和人源化抗體，由于其在人體內(nèi)的免疫原性降低，所以當(dāng)為了治療目的等對(duì)人進(jìn)行給藥時(shí)有用。本發(fā)明的抗體可以利用任何方法而得到，例如，對(duì)于本來(lái)在pH5.8下的抗原結(jié)合活性高于在PH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗體或抗原結(jié)合活性為相同程度的抗體，通過(guò)上述的組氨酸取代等，可以人為地使在PH5.8下的抗原結(jié)合活性低于在pH7.4下的抗原結(jié)合活性，還可以從由以下所示的抗體文庫(kù)或雜交瘤得到的多個(gè)抗體中篩選在PH5.8下的抗原結(jié)合活性低于在PH7.4下的抗原結(jié)合活性的抗體，從而選擇本發(fā)明的抗體。將抗體中的氨基酸取代成組氨酸時(shí)，導(dǎo)入組氨酸突變之前的抗體的H鏈或L鏈的氨基酸序列還可以使用已知的序列，還可以使用按照本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法新獲得的抗體的氨基酸序列。例如，抗體既可以由抗體文庫(kù)獲得，也可以由產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤克隆編碼抗體的基因而獲得。關(guān)于抗體文庫(kù)，已經(jīng)有多個(gè)抗體文庫(kù)為人所公知，另外抗體文庫(kù)的制作方法也是公知的，所以本領(lǐng)域技術(shù)人員可以獲取適當(dāng)?shù)目贵w文庫(kù)。例如，關(guān)于抗體噬菌體文庫(kù)，可以參照 Clackson 等人，Naturel991, 352:624-8 ；Marks 等人，J.Mol.Biol.1991,222:581-97 ；ffaterhouses 等人，Nucleic Acids Res.1993,21:2265-6 !Griffiths 等人，EMBOJ.1994,13:324.0-60 ；Vaughan 等人，Nature Biotechno logy 1996,14:309-14 和日本特表平20-504970號(hào)公報(bào)等文獻(xiàn)。此外，可以使用以真核細(xì)胞作為文庫(kù)的方法(W095/15393號(hào)小冊(cè)子)或核糖體提示法等公知方法。而且，還已知使用人抗體文庫(kù)，通過(guò)淘選獲得人抗體的技術(shù)。例如，可以以人抗體的可變區(qū)作為單鏈抗體(scFv)，通過(guò)噬菌體展示法使之在噬菌體表面表達(dá)，來(lái)選擇與抗原結(jié)合的曬菌體。分析所選擇的曬菌體的基因，可以確定編碼與抗原結(jié)合的人抗體可變區(qū)的DNA序列。一旦清楚了與抗原結(jié)合的scFv的DNA序列，就可以根據(jù)該序列制作適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，獲得人抗體。上述方法已經(jīng)眾所周知，可以參考W092/01047、W092/20791、W093/06213、W093/11236、W093/19172、W095/01438、W095/15388。由雜交瘤獲得編碼 抗體的基因的方法，基本上使用公知技術(shù)，使用所需抗原或表達(dá)所需抗原的細(xì)胞作為致敏抗原，按照通常的免疫方法對(duì)其進(jìn)行免疫，利用通常的細(xì)胞融合法使所得的免疫細(xì)胞與公知的親本細(xì)胞融合，再利用通常的篩選法篩選產(chǎn)生單克隆抗體的細(xì)胞(雜交瘤)，并使用逆轉(zhuǎn)錄酶由所得雜交瘤的mRNA合成抗體可變區(qū)(V區(qū))的cDNA，將該cDNA和編碼所需抗體恒定區(qū)(C區(qū))的DNA連接而得到。更具體而言，并不特別限于以下例子，用于得到上述的編碼H鏈和L鏈的抗體基因的致敏抗原包括:具免疫原性的完全抗原和不具免疫原性的不完全抗原兩者，上述不完全抗原包括半抗原等。例如，可以使用目標(biāo)蛋白的全長(zhǎng)蛋白或部分肽等。此外，已知由多糖類、核酸、脂質(zhì)等構(gòu)成的物質(zhì)能夠成為抗原，對(duì)本發(fā)明抗體的抗原并沒(méi)有特別限定?？乖闹苽淇梢园凑毡绢I(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行，例如可以按照使用桿狀病毒的方法(例如W098/46777等)等進(jìn)行制備。雜交瘤的制作，例如可以按照Milstein等人的方法(G.Kohler 和 C.Milstein, Methods Enzymol.1981,73:3_46)等來(lái)進(jìn)行。當(dāng)抗原的免疫原性低時(shí)，可以使之與白蛋白等具免疫原性的大分子結(jié)合來(lái)進(jìn)行免疫。根據(jù)需要，還可以使抗原與其他分子結(jié)合，從而成為可溶性抗原。當(dāng)使用膜抗原(例如受體等)這樣的跨膜分子作為抗原時(shí)，可以使用膜抗原的胞外區(qū)部分作為片段，或者使用在細(xì)胞表面上表達(dá)跨膜分子的細(xì)胞作為免疫原。產(chǎn)生抗體的細(xì)胞可以通過(guò)使用上述適當(dāng)?shù)闹旅艨乖?，?duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫而得到?；蛘?在體外對(duì)能夠產(chǎn)生抗體的淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫而成為產(chǎn)生抗體的細(xì)胞。進(jìn)行免疫的動(dòng)物可以使用各種哺乳動(dòng)物，但通常使用嚙齒類、兔形目、靈長(zhǎng)類動(dòng)物?？梢岳?小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠等嚙齒類；兔等兔形目；食蟹猴、恒河猴、狒狒、黑猩猩等的猴等的靈長(zhǎng)類動(dòng)物。此外，還已知具有人抗體基因的所有組成部分(repertories)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，通過(guò)使用這樣的動(dòng)物，也可以得到人抗體(參照 W096/34096 ;Mendez 等人，Nat.Genet.1997，15:146-56)。不使用上述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，例如，通過(guò)在體外用所需抗原或表達(dá)所需抗原的細(xì)胞致敏人淋巴細(xì)胞，并使致敏淋巴細(xì)胞與人骨髓瘤細(xì)胞例如U266融合，也可以得到具抗原結(jié)合活性的所需人抗體(參照日本特公平1-59878號(hào)公報(bào))。還可以通過(guò)用所需抗原對(duì)具有人抗體基因的全部的所有組成成分的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行免疫得到所需的人抗體(參照W093/12227、W092/03918、W094/02602、W096/34096,W096/33735)。動(dòng)物的免疫可如下進(jìn)行:將致敏抗原用磷酸鹽緩沖液(PBS)或生理鹽水等適當(dāng)稀釋并懸浮，根據(jù)需要混合佐劑并進(jìn)行乳化，然后注射到動(dòng)物的腹腔內(nèi)或皮下來(lái)進(jìn)行免疫。之后，優(yōu)選每4 21天給予數(shù)次和弗式不完全佐劑混合的致敏抗原。確認(rèn)抗體的產(chǎn)生可以通過(guò)常規(guī)方法測(cè)定動(dòng)物血清中目標(biāo)抗體的效價(jià)來(lái)進(jìn)行。雜交瘤可如下制備:使用常用融合劑(例如聚乙二醇)，使自利用所需抗原免疫的動(dòng)物或淋巴細(xì)胞得到的產(chǎn)生抗體的細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合來(lái)制備(Golding，MonoclonalAntibodies (單克隆抗體):Principles and Practice, Academic Press, 1986, 59-103)。根據(jù)需要培養(yǎng)、增殖雜交瘤細(xì)胞，通過(guò)免疫沉淀、放射免疫分析(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)等公知的分析方法，測(cè)定由該雜交瘤產(chǎn)生的抗體的結(jié)合特異性。之后，根據(jù)需要可以利用有限稀釋法等方法亞克隆產(chǎn)生抗體的雜交瘤，上述抗體的目標(biāo)特異性、親和性或活性已測(cè)定。接下來(lái) ，可以使用能夠與抗體特異性結(jié)合的探針(例如，與編碼抗體恒定區(qū)的序列互補(bǔ)的寡核苷酸等)，由雜交瘤或產(chǎn)生抗體的細(xì)胞(致敏淋巴細(xì)胞等)克隆編碼所選擇的抗體的基因。還可以通過(guò)RT-PCR由mRNA進(jìn)行克隆。免疫球蛋白分為IgA、IgD、IgE、IgG和IgM五個(gè)不同類別。這些類別又進(jìn)一步分成幾個(gè)亞類(同種型)(例如IgG-l、IgG-2、IgG-3和IgG-4 ；IgA-1和IgA-2等)。本發(fā)明中，對(duì)抗體制備中使用的H鏈和L鏈沒(méi)有特別限定，可以來(lái)源于屬于上述任一類別和亞類的抗體，特別優(yōu)選為IgG。這里，還可以通過(guò)基因工程技術(shù)修飾編碼H鏈和L鏈的基因。例如，對(duì)于小鼠抗體、大鼠抗體、兔抗體、倉(cāng)鼠抗體、山羊抗體、駱駝抗體等抗體，為了減弱其對(duì)人的異種抗原性等，可以適當(dāng)制作人工修飾的基因重組型抗體，例如嵌合抗體、人源化抗體等。嵌合抗體是包含除人以外的哺乳動(dòng)物例如小鼠抗體的H鏈、L鏈的可變區(qū)和人抗體的H鏈、L鏈的恒定區(qū)的抗體，可以通過(guò)將編碼小鼠抗體可變區(qū)的DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，將其插入到表達(dá)載體中，并導(dǎo)入到宿主中產(chǎn)生抗體，從而得到嵌合抗體。人源化抗體也稱作重構(gòu)(reshaped)人抗體,可通過(guò)PCR法由多個(gè)寡核苷酸合成,上述寡核苷酸制作成在DNA序列的末端具有重疊部分，上述DNA序列設(shè)計(jì)成連接除人以外的哺乳動(dòng)物例如小鼠抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)(⑶R)。將所得DNA和編碼人抗體恒定區(qū)的DNA連接，然后插入到表達(dá)載體中，并將其導(dǎo)入到宿主中而產(chǎn)生人源化抗體(參照EP239400、W096/02576)。經(jīng)由⑶R連接的人抗體的FR，選擇互補(bǔ)性決定區(qū)形成良好的抗原結(jié)合位點(diǎn)的FR。根據(jù)需要，可以取代抗體可變區(qū)的構(gòu)架區(qū)的氨基酸，使重構(gòu)人抗體的互補(bǔ)性決定區(qū)形成適當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合位點(diǎn)(K.Sato等人，Cancer Res.1993,53: 10.01-10.06)。除上述的人源化以外，認(rèn)為還為了改善例如與抗原的結(jié)合性等抗體的生物學(xué)特性而進(jìn)行修飾。本發(fā)明中的修飾可以通過(guò)位點(diǎn)特異性突變(參照例如Kunkel (1910.0)Proc.Natl.Acad.Sc1.USA82:488)、PCR突變、盒式突變等方法來(lái)進(jìn)行。通常，生物學(xué)特性得到改善的抗體突變體，其相對(duì)于原始抗體可變區(qū)的氨基酸序列，具有70%以上、更優(yōu)選80%以上、進(jìn)一步優(yōu)選90%以上(例如95%以上、97%、98%、99%等)的氨基酸序列同源性和/或相似性。本說(shuō)明書中，序列同源性和/或相似性定義為:根據(jù)需要進(jìn)行序列排比和間隙導(dǎo)入，使序列同源性最大化之后，與原始抗體殘基相同(相同殘基)或相似(根據(jù)一般的氨基酸側(cè)鏈的特性分類為同一組的氨基酸殘基)的氨基酸殘基的比例。通常，天然氨基酸殘基根據(jù)其側(cè)鏈的性質(zhì)分為以 下幾組:(I)疏水性:丙氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸和亮氨酸；(2)中性親水性:天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、蘇氨酸和絲氨酸；(3)酸性:天冬氨酸和谷氨酸；(4)堿性:精氨酸、組氨酸和賴氨酸；(5)影響鏈取向的殘基:甘氨酸和脯氨酸；以及(6)芳族性:酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸。通常，存在于H鏈和L鏈的可變區(qū)中的共6個(gè)互補(bǔ)性決定區(qū)(超可變區(qū)KDR)相互作用，形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。已知即使是其中一個(gè)可變區(qū)，盡管與包括所有結(jié)合位點(diǎn)時(shí)相比親和性低，但也具有識(shí)別并結(jié)合抗原的能力。因此，本發(fā)明的編碼H鏈和L鏈的抗體基因，可以編碼包括H鏈和L鏈的各抗原結(jié)合位點(diǎn)的片段部分，只要由該基因所編碼的多肽維持與所需抗原的結(jié)合性即可。如上所述，重鏈可變區(qū)通常由3個(gè)⑶R區(qū)和4個(gè)FR區(qū)構(gòu)成。在本發(fā)明的優(yōu)選方案中，作為供于“修飾”的氨基酸殘基，例如可以從位于CDR區(qū)或FR區(qū)的氨基酸殘基中適當(dāng)選擇。通常，修飾CDR區(qū)的氨基酸殘基，有時(shí)會(huì)降低與抗原的結(jié)合能力。因此，本發(fā)明中對(duì)供于“修飾”的氨基酸殘基沒(méi)有特別限定，優(yōu)選從位于FR區(qū)的氨基酸殘基中適當(dāng)選擇。即使是CDR，當(dāng)確認(rèn)通過(guò)修飾其結(jié)合能力并沒(méi)有降低時(shí)，可以選擇該位點(diǎn)。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用公共數(shù)據(jù)庫(kù)等適當(dāng)獲得在人或小鼠等生物中可用作抗體可變區(qū)的FR的序列。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明的抗體的基因。編碼本發(fā)明的抗體的基因可以是任何基因，還可以是DNA、RNA、其他核酸類似體等。本發(fā)明還提供攜帶上述基因的宿主細(xì)胞。對(duì)該宿主細(xì)胞沒(méi)有特別限定，例如有大腸桿菌或各種動(dòng)物細(xì)胞等。宿主細(xì)胞可以用作例如用于制備或表達(dá)本發(fā)明的抗體的產(chǎn)生系統(tǒng)。用于制備多肽的產(chǎn)生系統(tǒng)包括:體外(in vitro)和體內(nèi)(in vivo)產(chǎn)生系統(tǒng)。體外產(chǎn)生系統(tǒng)例如有:使用真核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng) 和使用原核細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)?？捎米魉拗骷?xì)胞的真核細(xì)胞例如有:動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞、真菌細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞包括:哺乳動(dòng)物細(xì)胞、例如 CHO (J.Exp.Med.(1995) 108:94.0)、COS、HEK293、3T3、骨髓瘤細(xì)胞、BHK(幼倉(cāng)鼠腎)、HeLa、Vero等；兩棲動(dòng)物細(xì)胞、例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞(Xenopuslaevis oocytes) (Valle 等人，Nature (1981) 291:338-340)；以及昆蟲細(xì)胞、例如 Sf9>Sf21、Tn5。在本發(fā)明的抗體的表達(dá)中適合使用CH0-DG44、CH0-DX11B、C0S7細(xì)胞、HEK293細(xì)胞、BHK細(xì)胞。動(dòng)物細(xì)胞中，以大量表達(dá)為目的時(shí)，特別優(yōu)選CHO細(xì)胞。關(guān)于向宿主細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入載體，例如可以通過(guò)以下方法來(lái)進(jìn)行:磷酸鈣法、DEAE-葡聚糖法、使用正離子脂質(zhì)體DOTAP (Boehringer Mannheim制)的方法、電穿孔法、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法(Iipofection法)等。作為植物細(xì)胞，例如有來(lái)源于煙草的細(xì)胞和浮萍(Lemna minor),它們作為蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)而已知，利用愈傷組織培養(yǎng)該細(xì)胞的方法可以產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。使用真菌細(xì)胞的蛋白表達(dá)系統(tǒng)是公知的，這些真菌細(xì)胞可以用作產(chǎn)生本發(fā)明的抗體的宿主，上述真菌細(xì)胞例如有:酵母，例如酵母菌(Saccharomyces)屬的細(xì)胞(啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Saccharmyces pombe)等)；以及絲狀菌，例如曲霉屬(Aspergillus)的細(xì)胞(黑曲霉(Aspergillus niger)等)。使用原核細(xì)胞時(shí)，有使用細(xì)菌細(xì)胞的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為細(xì)菌細(xì)胞，除上述大腸桿菌(E.coli)外，已知還有使用枯草桿菌的產(chǎn)生系統(tǒng)，這些細(xì)菌細(xì)胞可用于產(chǎn)生本發(fā)明的抗體。〈篩選方法〉本發(fā)明提供篩選抗原結(jié)合分子在酸性pH下的抗原結(jié)合活性低于在中性pH下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的方法。本發(fā)明還提供可以以I分子與多個(gè)抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的篩選方法。本發(fā)明還提供血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子的篩選方法。本發(fā)明還提供在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原的抗原結(jié)合分子的篩選方法。本發(fā)明還提供以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)、以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子的篩選方法。本發(fā)明還提供血漿中抗原消除能力增加的抗原結(jié)合分子的篩選方法。本發(fā)明還提供用作藥物組合物時(shí)特別有用的抗原結(jié)合分子的篩選方法。具體而言，本發(fā)明提供抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟。(a)獲得pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟、(b)獲得pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟、(c)選擇ρΗ6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于ρΗ4.0 ρΗ6.5下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟。
在本發(fā)明的篩選方法中，只要pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性是PH6.7 ρΗΙΟ.0之間的抗原結(jié)合活性即可，沒(méi)有特別限定，作為優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有PH7.0 pH8.0之間的抗原結(jié)合活性；作為更優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH7.4下的抗原結(jié)合活性。另外，pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性只要是pH4.0 pH6.5之間的抗原結(jié)合活性即可，沒(méi)有特別限定，作為優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH5.5 pH6.5之間的抗原結(jié)合活性；作為更優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH5.8或pH5.5下的抗原結(jié)合活性?？乖Y(jié)合分子的抗原結(jié)合活性可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行測(cè)定，有關(guān)除PH以外的條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)確定?？乖Y(jié)合分子的抗原結(jié)合活性可以以 KD (Dissociation constant:角軍離常數(shù))、表觀 KD (Apparent dissociation constant:表觀解離常數(shù))、解離速度kd(Dissociation rate:解離速度)或表觀kd(Apparentdissociation:表觀解離速度)等形式進(jìn)行評(píng)價(jià)。這些參數(shù)可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法進(jìn)行測(cè)定，例如可以使用Biacore (GE healthcare)、斯卡恰特作圖法、FACS等。本發(fā)明中，選擇pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟，與選擇pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性低于pH6.7 PH10.0下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟意思相同。只要pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性，對(duì)pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性與pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性之差沒(méi)有特別限定，優(yōu)選PH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性為pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性的2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10倍以上，更優(yōu)選為40倍以上。本發(fā)明還提供抗 原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:(a)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子置于pH4.0 pH6.5的條件下的步驟、(c)獲得在ρΗ4.0 ρΗ6.5的條件下解離的抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:(a)選擇在pH4.0 pH6.5的條件下未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使(a)中選擇的抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(c)獲得在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:(a)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子置于pH4.0 pH6.5的條件下的步驟、(c)獲得在pH4.0 pH6.5的條件下解離的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)擴(kuò)增編碼解離的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟。步驟(a) (d)可以重復(fù)兩次以上。因此，本發(fā)明提供在上述方法中進(jìn)一步包括重復(fù)兩次以上步驟(a) (d)的步驟的方法。對(duì)步驟(a) (d)的重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限定，通常為10次以內(nèi)。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:
(a)選擇在pH4.0 pH6.5的條件下未與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使(a)中選擇的抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(c)獲得在PH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)擴(kuò)增編碼解離的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟。步驟(a) (d)可以重復(fù)兩次以上。因此，本發(fā)明提供在上述方法中進(jìn)一步包括重復(fù)兩次以上步驟(a) (d)的步驟的方法。對(duì)步驟(a) (d)的重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限定，通常為10次以內(nèi)。在本發(fā)明的篩選方法中，當(dāng)使用噬菌體文庫(kù)等時(shí)，擴(kuò)增編碼抗原結(jié)合分子的基因的步驟還可以作為擴(kuò)增噬菌體的步驟。在本發(fā)明的方法中，抗原與抗原結(jié)合分子的結(jié)合可以以任何狀態(tài)進(jìn)行，沒(méi)有特別限定。例如，通過(guò)使抗原與固定化的抗原結(jié)合分子接觸，可以使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合；通過(guò)使抗原結(jié)合分子與固定化的抗原接觸，可以使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合。另外，通過(guò)使抗原結(jié)合分子與抗原在溶液中接觸，可以使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子在第一 pH下的結(jié)合活性高于在第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟、(b)在第二 pH條件下從柱上 洗脫在第一 pH條件下與柱結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(C)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子在第一 pH下的結(jié)合活性低于在第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子通過(guò)固定有抗原的柱的步驟、(b)回收在步驟(a)中未與柱結(jié)合而洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟、(c)在第二 pH條件下使(b)中回收的抗原結(jié)合分子與柱結(jié)合的步驟、(d)獲得在步驟(C)中與柱結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟。(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子文庫(kù)與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟、(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫抗原結(jié)合分子的步驟、(C)擴(kuò)增編碼被洗脫的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(d)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟。步驟(a) (C)可以重復(fù)兩次以上。因此，本發(fā)明提供在上述方法中進(jìn)一步包括重復(fù)兩次以上步驟(a) (C)的步驟的方法。對(duì)步驟(a) (C)的重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限定，通常為10次以內(nèi)。本發(fā)明中，只要第一pH和第二pH各自不是相同的pH即可，可以是任何pH。優(yōu)選的第一 pH與第二 pH的組合的例子有:第一 pH為pH6.7 10.0之間的pH、第二 pH為pH4.0 PH6.5之間的pH的組合；更優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為pH7.0 pH8.0之間的pH、第二 pH為pH5.5 pH6.5之間的pH的組合；進(jìn)一步優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為pH7.4、第二 pH為ρΗ5.8或ρΗ5.5的組合。其他優(yōu)選的第一pH與第二pH的組合的例子有:第一pH為pH4.0 6.5之間的pH、第二 pH為pH6.7 ρΗΙΟ.0之間的pH的組合；更優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為pH5.5 PH6.5之間的pH、第二 pH為pH7.0 pH8.0之間的pH的組合；進(jìn)一步優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為ρΗ5.8或ρΗ5.5、第二 pH為ρΗ7.4的組合。利用本發(fā)明的方法篩選的抗原結(jié)合分子可以是任何抗原結(jié)合分子，例如可以將上述的抗原結(jié)合分子用于本發(fā)明的篩選。例如，可以篩選具有天然序列的抗原結(jié)合分子，也可以篩選氨基酸序列被取代的抗原結(jié)合分子。本發(fā)明中篩選的抗原結(jié)合分子的優(yōu)選例子有:例如抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸被組氨酸取代或插入至少I個(gè)組氨酸的抗原結(jié)合分子。對(duì)導(dǎo)入組氨酸取代或插入的位點(diǎn)沒(méi)有特別限定，可以在任何位點(diǎn)導(dǎo)入?？梢韵騃個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)入組氨酸取代或插入，也可以向2個(gè)位點(diǎn)以上的多個(gè)位點(diǎn)中導(dǎo)入。本發(fā)明中篩選的抗原結(jié)合分子的優(yōu)選例子有:例如包含被修飾的抗體恒定區(qū)的抗原結(jié)合分子。利用本發(fā)明的方法篩選的抗原結(jié)合分子，例如可以是通過(guò)組氨酸分區(qū)等方法向不同位點(diǎn)導(dǎo)入組氨酸取代或插入的多個(gè)不同的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以進(jìn)一步包括:將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入至少I個(gè)組氨酸的步驟。本發(fā)明的篩選方法可以使用非天然氨基酸來(lái)代替組氨酸。因此，也可以將上述組氨酸與非天然氨基酸互換來(lái)理解本發(fā)明。本發(fā)明的篩選方法可以進(jìn)一步包括修飾抗體恒定區(qū)的氨基酸的步驟。通過(guò)本發(fā)明的篩選方法篩選的抗原結(jié)合物質(zhì)可以以任何方式進(jìn)行制備，例如可以使用:事先存在的抗體、事先存 在的文庫(kù)(噬菌體文庫(kù)等)、對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫而得到的雜交瘤或由來(lái)自免疫動(dòng)物的B細(xì)胞制作的抗體或文庫(kù)、向這些抗體或文庫(kù)中導(dǎo)入組氨酸或非天然氨基酸突變而得到的抗體或文庫(kù)(提高組氨酸或非天然氨基酸的含有率的文庫(kù)或在特定位點(diǎn)導(dǎo)入了組氨酸或非天然氨基酸突變的文庫(kù)等)等。利用本發(fā)明的篩選方法，可以得到多次與抗原結(jié)合、血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作用于得到血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子的篩選方法。利用本發(fā)明的篩選方法，對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，還可以得到能夠與抗原進(jìn)行兩次以上結(jié)合的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作用于得到能夠兩次以上與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的篩選方法。利用本發(fā)明的篩選方法，對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，還可以得到能夠與多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作用于得到能夠與多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的篩選方法。例如，當(dāng)抗體為中和抗體時(shí)，可以用作用于得到能夠中和多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目的抗原的抗原結(jié)合分子的篩選方法。利用本發(fā)明的篩選方法，對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，還可以得到能夠在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作用于得到在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗原結(jié)合分子的篩選方法。
利用本發(fā)明的篩選方法，對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，還可以得到以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)、以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作用于得到以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)、以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子的篩選方法。利用本發(fā)明的篩選方法，對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，還可以得到可以使抗原從血漿中快速消除的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作用于得到血漿中抗原消除能力增加(高)的抗原結(jié)合分子的篩選方法。這些抗原結(jié)合分子可以減少對(duì)患者的給藥量或給藥頻率，結(jié)果，可以減少總給藥量，因此認(rèn)為其作為藥品特別優(yōu)異。因此，本發(fā)明的篩選方法可以用作作為藥物組合物的抗原結(jié)合分子的篩選方法。本發(fā)明還提供與原始文庫(kù)相比組氨酸的含有比例增加的文庫(kù)。文庫(kù)中所含的抗原結(jié)合分子所具有的組氨酸的比例增加的文庫(kù)可用于上述的篩選方法或后述的制備方法。提高了組氨酸的含有比例的文庫(kù)的制作方法可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法來(lái)制作，例如有以下方法。合成用于制作文庫(kù)的核酸時(shí)，利用三核苷酸法(J MolBiol.2008Feb29 ；376(4) =1182-200)，以相等的概率含有編碼20種氨基酸的20種的3堿基密碼子(三核苷酸)，從而可以在文庫(kù)化的位點(diǎn)以相等的概率含有20種氨基酸。此時(shí)，20種氨基酸中，通過(guò)使編碼組氨酸的三核苷酸的比例高于其他氨基酸的比例，可以提高在文庫(kù)化的位點(diǎn)出現(xiàn)組氨酸的可能性。<抗原結(jié)合分子制備方法>本發(fā)明提供抗原結(jié)合分子在核內(nèi)體內(nèi)的pH下的抗原結(jié)合活性低于在血漿中的pH下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的制備方法。本發(fā)明還提供血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子的制備方法。本發(fā)明還提供用作藥物組合物時(shí)特別有用的抗原結(jié)合分子的制備方 法。具體而言，本發(fā)明提供抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)獲得在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟、(b)獲得在pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性的步驟、(c)選擇在pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于在pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)獲得編碼(C)中選擇的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子置于pH4.0 pH6.5的條件下的步驟、(c)獲得在pH4.0 pH6.5的條件下解離的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)獲得編碼(C)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)選擇在pH4.0 pH6.5的條件下不與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使(a)中選擇的抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(c)獲得在PH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)獲得編碼(C)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)在pH6.7 10.0的條件下使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子置于pH4.0 pH6.5的條件下的步驟、(c)獲得在pH4.0 pH6.5的條件下解離的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)擴(kuò)增編碼解離的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟、(f)獲得編碼(e)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(g)使用(f)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。步驟(a) (d)可以重復(fù)兩次以上。因此，本發(fā)明提供在上述方法中進(jìn)一步包括重復(fù)兩次以上步驟(a) (d)的步驟的方法。對(duì)步驟(a) (d)的重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限定，通常為10次以內(nèi)。

本發(fā)明還提供抗原結(jié)合分子的篩選方法，該篩選方法包括以下步驟:(a)選擇 在pH4.0 pH6.5的條件下不與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(b)在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下使(a)中選擇的抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合的步驟、(c)獲得在pH6.7 ρΗΙΟ.0的條件下與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)擴(kuò)增編碼解離的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟、(f)獲得編碼(e)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(g)使用(f)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。步驟(a) (d)可以重復(fù)兩次以上。因此，本發(fā)明提供在上述方法中進(jìn)一步包括重復(fù)兩次以上步驟(a) (d)的步驟的方法。對(duì)步驟(a) (d)的重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限定，通常為10次以內(nèi)。本發(fā)明還提供第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備 方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟、(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫在第一 pH條件下與柱結(jié)合的抗原結(jié)合分子的步驟、(C)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟、(d)獲得編碼(C)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(e)使用(d)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。本發(fā)明還提供第一 pH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的制備方法，該制備方法包括以下步驟:(a)在第一 pH條件下使抗原結(jié)合分子文庫(kù)與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟、(b)在第二 pH條件下從柱上洗脫抗原結(jié)合分子的步驟、
(c)擴(kuò)增編碼被洗脫的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(d)獲得被洗脫的抗原結(jié)合分子的步驟、(e)獲得編碼(d)中取得的抗原結(jié)合分子的基因的步驟、(f)使用(e)中得到的基因制備抗原結(jié)合分子的步驟。 步驟(a) (C)可以重復(fù)兩次以上。因此，本發(fā)明提供在上述方法中進(jìn)一步包括重復(fù)兩次以上步驟(a) (C)的步驟的方法。對(duì)步驟(a) (C)的重復(fù)次數(shù)沒(méi)有特別限定，通常為10次以內(nèi)。在本發(fā)明的制備方法中，使用噬菌體文庫(kù)等時(shí)，擴(kuò)增編碼抗原結(jié)合分子的基因的步驟還可以作為擴(kuò)增噬菌體的步驟。本發(fā)明的制備方法中使用的抗原結(jié)合物質(zhì)可以按照任何方式來(lái)制備，例如可以使用:事先存在的抗體、事先存在的文庫(kù)(噬菌體文庫(kù)等)、由對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫得到的雜交瘤或由來(lái)自免疫動(dòng)物的B細(xì)胞制作的抗體或文庫(kù)、向這些抗體或文庫(kù)中導(dǎo)入組氨酸或非天然氨基酸突變而得到的抗體或文庫(kù)(提高了組氨酸或非天然氨基酸的含量的文庫(kù)或向特定位點(diǎn)導(dǎo)入了組氨酸或非天然氨基酸突變的文庫(kù)等)等。上述制備方法中，pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性只要是PH6.7 ρΗΙΟ.0之間的抗原結(jié)合活性即可，沒(méi)有特別限定，作為優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH7.0 pH8.0之間的抗原結(jié)合活性；作為進(jìn)一步優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH7.4下的抗原結(jié)合活性。另外，PH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性只要是PH4.0 pH6.5之間的抗原結(jié)合活性即可，沒(méi)有特別限定，作為優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH5.5 pH6.5之間的抗原結(jié)合活性；作為進(jìn)一步優(yōu)選的抗原結(jié)合活性，例如有pH5.8或pH5.5下的抗原結(jié)合活性。抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合活性可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法進(jìn)行測(cè)定，關(guān)于除PH以外的條件，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以適當(dāng)確定。選擇pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟，與選擇pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性低于pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性的抗原結(jié)合分子的步驟意思相同。只要pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性高于pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性即可，對(duì)pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性與pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性之差沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選pH6.7 ρΗΙΟ.0下的抗原結(jié)合活性為pH4.0 pH6.5下的抗原結(jié)合活性的2倍以上，進(jìn)一步優(yōu)選為10倍以上，更優(yōu)選為40倍以上。在上述制備方法中，抗原與抗原結(jié)合分子的結(jié)合可以以任何狀態(tài)進(jìn)行，沒(méi)有特別限定。例如，通過(guò)使抗原與固定化的抗原結(jié)合分子接觸，可以使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合；通過(guò)使抗原結(jié)合分子與固定化的抗原接觸，也可以使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合。另外，通過(guò)使抗原結(jié)合分子與抗原在溶液中接觸，也可以使抗原結(jié)合分子與抗原結(jié)合。上述制備方法中，只要第一 pH與第二 pH各自是不同的pH即可，可以是任何的pH。優(yōu)選的第一 PH與第二 pH的組合的例子有:第一 pH為pH6.7 10.0之間的pH、第二 pH為PH4.0 pH6.5之間的pH的組合；更優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為pH7.0 pH8.0之間的pH、第二 pH為pH5.5 pH6.5之間的pH的組合；進(jìn)一步優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為ρΗ7.4、第二 pH為ρΗ5.8或ρΗ5.5的組合。
其他優(yōu)選的第一 pH與第二 pH的組合的例子有:第一 pH為pH4.0 pH6.5之間的pH、第二 pH為pH6.7 ρΗΙΟ.0之間的pH的組合；更優(yōu)選的組合的例子有:第一 pH為pH5.5 pH6.5之間的pH、第二 pH為pH7.0 pH8.0之間的pH的組合；進(jìn)一步優(yōu)選的組合的例子有:第一 PH為pH5.8或pH5.5、第二 pH為pH7.4的組合。利用上述制備方法制備的抗原結(jié)合分子可以是任何的抗原結(jié)合分子，例如優(yōu)選的例子有:抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸被組氨酸取代或插入至少I個(gè)組氨酸的抗原結(jié)合分子。對(duì)導(dǎo)入這樣的組氨酸突變的位點(diǎn)沒(méi)有特別限定，可以在任何位點(diǎn)導(dǎo)入。可以向I個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)入組氨酸突變，也可以向2個(gè)位點(diǎn)以上的多個(gè)位點(diǎn)導(dǎo)入組氨酸突變。因此，在本發(fā)明的制備方法中，可以進(jìn)一步包括將抗原結(jié)合分子的至少I個(gè)氨基酸取代成組氨酸或插入組氨酸的步驟。在本發(fā)明的制備方法中，可以使用非天然氨基酸來(lái)代替組氨酸。因此，還可以將上述組氨酸與非天然氨基酸互換來(lái)理解本發(fā)明。作為利用上述制備方法制備的抗原結(jié)合分子的其他方案，例如有包含被修飾的抗體恒定區(qū)的抗原結(jié)合分子，因此，在本發(fā)明的制備方法中，可以進(jìn)一步包括修飾抗體恒定區(qū)中的氨基酸的步驟。利用本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子是血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作血漿中滯留性優(yōu)異的抗原結(jié)合分子的制備方法。利用本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子，將其對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，認(rèn)為其可以兩次以上與抗原結(jié)合。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作能夠兩次以上與抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的制備方法。并且，利用本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子，將其對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，認(rèn)為其可以與多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目的抗原結(jié)合。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作能夠與多于抗原結(jié)合分子的抗原結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的數(shù)目的抗原結(jié)合的抗原結(jié)合分子的制備方法。并且，利用本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子，將其對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，認(rèn)為其可以使在細(xì)胞外與抗原結(jié)合分子結(jié)合的抗原在細(xì)胞內(nèi)自抗原結(jié)合分子上解離。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作能夠在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗原結(jié)合分子的制備方法。并且，利用本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子，將其對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，認(rèn)為其可以使以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)的抗原結(jié)合分子以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作以與抗原結(jié)合的狀態(tài)攝入細(xì)胞內(nèi)、以未與抗原結(jié)合的狀態(tài)被釋放到細(xì)胞外的抗原結(jié)合分子的制備方法。并且，利用本發(fā)明的制備方法制備的抗原結(jié)合分子，將其對(duì)人、小鼠、猴等動(dòng)物給藥時(shí)，認(rèn)為其可以使抗原從血漿中快速消除。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作血漿中抗原消除能力增加(高)的抗原結(jié)合分子的制備方法。這些抗原結(jié)合分子可以減少對(duì)患者的給藥次數(shù)，認(rèn)為其作為藥品特別優(yōu)異。因此，本發(fā)明的制備方法可以用作作為藥物組合物的抗原結(jié)合分子的制備方法。本發(fā)明的制備方法中得到的基因，通常將其負(fù)載(插入)到適當(dāng)?shù)妮d體上，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。對(duì)該載體沒(méi)有特別限定， 只要是穩(wěn)定保持插入的核酸的載體即可，例如使用大腸桿菌作為宿主時(shí)，作為克隆用載體，優(yōu)選pBluescript載體(Stratagene公司制)等，但也可以使用各種市售載體。當(dāng)為了生產(chǎn)本發(fā)明的抗原結(jié)合分子而使用載體時(shí)，表達(dá)載體特別實(shí)用。對(duì)表達(dá)載體沒(méi)有特別限定，只要是在試管內(nèi)、大腸桿菌內(nèi)、培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)、生物個(gè)體內(nèi)表達(dá)抗原結(jié)合分子的載體即可，例如，在試管內(nèi)表達(dá)抗原結(jié)合分子時(shí)，優(yōu)選PBEST載體(Promega公司制)；在大腸桿菌內(nèi)表達(dá)抗原結(jié)合分子時(shí),優(yōu)選pET載體(Invitrogen公司制)；在培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)抗原結(jié)合分子時(shí)，優(yōu)選PME18S-FL3載體(GenBank檢索號(hào)AB009864);在生物個(gè)體內(nèi)表達(dá)抗原結(jié)合分子時(shí)，優(yōu)選pME18S載體(Mol Cell Biol.8:466-472(1988))等。向載體中插入本發(fā)明的DNA，可以利用常規(guī)方法、例如通過(guò)使用限制酶切位點(diǎn)的連接酶反應(yīng)來(lái)進(jìn)行(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel等人(1987)出版.John Wiley & Sons.Sectionll.4-11.11)。對(duì)上述宿主細(xì)胞沒(méi)有特別限定，根據(jù)目的使用各種宿主細(xì)胞。作為用于表達(dá)抗原結(jié)合分子的細(xì)胞，可以例示:細(xì)菌細(xì)胞(例如:鏈球菌(Streptococcus)、葡萄球菌(Staphylococcus)、大腸桿菌(E.coli)、鏈霉菌(Streptomyces)、枯草桿菌(Bacillussubtilis));真菌細(xì)胞(例如:酵母(Yeast)、曲霉(Aspergillus));昆蟲細(xì)胞(例如:果蠅S2 (Drosophila S2)、草地夜蛾 SF9 (Spodoptera SF9));動(dòng)物細(xì)胞(例如:CH0、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowes黑色素瘤細(xì)胞)和植物細(xì)胞。向宿主細(xì)胞中導(dǎo)入載體，例如可以通過(guò)憐酸I丐沉淀法、電脈沖穿孔法(Current protocols in Molecular Biology edit.Ausubel 等人.(1987)出版.John Wiley & Sons.Section9.1-9.9)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染法、顯微注射法等公知方法來(lái)進(jìn)行。宿主細(xì)胞的培養(yǎng)可以按照公知方法進(jìn)行。例如，以動(dòng)物細(xì)胞作為宿主時(shí)，培養(yǎng)液可以使用例如DMEM、MEM、RPMI1640、MDM。此時(shí)，可以結(jié)合使用FBS、胎牛血清(FCS)等血清補(bǔ)充液，也可以通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)時(shí)的PH優(yōu)選為約6 8。通常是在約30 40°C下培養(yǎng)約15 200小時(shí)，根據(jù)需要可以交換培養(yǎng)基或進(jìn)行通氣、攪拌?？梢韵蚰繕?biāo)多肽中插入適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)，以使在宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗原結(jié)合分子分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的內(nèi)腔、周質(zhì)間隙或胞外環(huán)境中。相對(duì)于目標(biāo)抗原結(jié)合分子而言，上述信號(hào)可以是內(nèi)源性信號(hào)，也可以是·異源信號(hào)。另一方面，作為在體內(nèi)產(chǎn)生多肽的系統(tǒng)，例如有使用動(dòng)物的產(chǎn)生系統(tǒng)或使用植物的產(chǎn)生系統(tǒng)。向這些動(dòng)物或植物中導(dǎo)入目標(biāo)多核苷酸，使在動(dòng)物或植物體內(nèi)產(chǎn)生多肽并回收。本發(fā)明中的“宿主”包括這些動(dòng)物和植物。使用動(dòng)物時(shí)，有使用哺乳動(dòng)物和昆蟲的產(chǎn)生系統(tǒng)。作為哺乳動(dòng)物，可以使用山羊、豬、綿羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993))。使用哺乳動(dòng)物時(shí)，可以使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。例如，制備編碼本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的多核苷酸，將其作為和山羊β_酪素等乳汁中固有產(chǎn)生的編碼多肽的基因的融合基因。然后，將包括該融合基因的多核苷酸片段注入到山羊胚胎中，將該胚胎移植到雌山羊體內(nèi)。接受了胚胎的山羊生出轉(zhuǎn)基因山羊，從該轉(zhuǎn)基因山羊或其后代產(chǎn)生的乳汁中可以得到目標(biāo)抗原結(jié)合分子。為了使轉(zhuǎn)基因山羊產(chǎn)生的含有抗原結(jié)合分子的乳汁量增加，可以給予轉(zhuǎn)基因山羊適當(dāng)?shù)募に?Ebert等人，Bio/Technology(1994)12:699-702)。作為產(chǎn)生本發(fā)明的抗原結(jié)合分子的昆蟲，例如可以使用蠶。使用蠶時(shí)，通過(guò)使蠶感染插入有編碼目標(biāo)抗原結(jié)合分子的多核苷酸的桿狀病毒，可以從該蠶的體液中得到目標(biāo)抗原結(jié)合分子。并且，在本發(fā)明的抗原結(jié)合分子產(chǎn)生中使用植物時(shí)，例如可以使用煙草。使用煙草時(shí)，將編碼目標(biāo)抗原結(jié)合分子的多核苷酸插入到植物表達(dá)用載體例如PM0N530中，將該載體導(dǎo)入根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)這樣的細(xì)菌中。用該細(xì)菌感染煙草例如煙草(Nicotiana tabacum),可以從該煙草的葉中得到所期望的抗原結(jié)合分子(Ma等人，Eur.J.1mmunol.(1994) 24:131-8)。用同樣的細(xì)菌感染浮萍(Lemna minor),克隆化后可以從浮萍的細(xì)胞中得到所期望的抗原結(jié)合分子(Cox KM等人.Nat.Biotechnol.2006Dec ；24(12):1591-1597)。如此操作得到的抗原結(jié)合分子，可以將其從宿主細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外(培養(yǎng)基、乳汁等)分離，純化成實(shí)質(zhì)上純粹且均勻的抗原結(jié)合分子?？乖Y(jié)合分子的分離、純化可以使用通常多肽的純化中所使用的分離、純化方法，但沒(méi)有任何限制。例如，可以適當(dāng)選擇組合層析柱、濾器、超濾、鹽析、溶劑沉淀、溶劑提取、蒸餾、免疫沉淀、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、等電點(diǎn)電泳法、透析、重結(jié)晶等來(lái)分離、純化抗原結(jié)合分子。

層析例如有:親合層析、離子交換層析、疏水層析、凝膠過(guò)濾、反相層析、吸附層析等(Strategies for Protein Purification and Characterization (蛋白質(zhì)純化與鑒定實(shí)驗(yàn)指南):A Laboratory Course Manual.Ed Daniel R.Marshark 等人.(I996)ColdSpring Harbor Laboratory Press)。上述層析可以使用液相層析、例如HPLC、FPLC等液相層析來(lái)進(jìn)行。用于親合層析的柱例如有:蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱例如有:Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia 制)等。根據(jù)需要，可以在純化抗原結(jié)合分子之前或之后，使適當(dāng)?shù)牡鞍仔揎椕概c抗原結(jié)合分子作用，以任意地進(jìn)行修飾或部分性地去除肽。作為蛋白修飾酶，例如可以使用胰蛋白酶、糜蛋白酶、賴氨酰內(nèi)肽酶、蛋白激酶、糖苷酶等?！纯笽L-6受體抗體〉本發(fā)明還提供以下(a) (m)中任一項(xiàng)所述的抗IL_6受體抗體。(a)抗體，該抗體包含具有下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:1(H53可變區(qū))的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第51位的Tyr、第59位的Asn、第63位的Ser、第106位的Met、第108位的Tyr中的至少I個(gè)被取代成His的氨基酸序列；(b)抗體(H3pl)，該抗體包含具有下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:I (H53可變區(qū))的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp和第35位的Trp被取代成His的氨基酸序列；(c)抗體，該抗體包含具有下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:1(H53可變區(qū))的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第59位的Asn、第63位的Ser、第108位的Tyr被取代成His的氨基酸序列；(d)抗體(H170)，該抗體包含具有下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:
I(H53可變區(qū))的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第59位的Asn、第63位的Ser、第108位的Tyr被取代成His、且第99位的Ser被取代成Val、第103位的Thr被取代成Ile的氨基酸序列；
(e)抗體，該抗體包含具有下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:1 (H53可變區(qū))的氨基酸序列中第31位的Asp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第106位的Met和第108位的Tyr被取代成His的氨基酸序列；(f)抗體(CLH5)，該抗體包含具有下述氨基酸序列的重鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:
1(H53可變區(qū))的氨基酸序列中第31位的Asp、第51位的Tyr、第63位的Ser、第106位的Met和第108位的Tyr被取代成HiS、且第99位的Ser被取代成Phe、第103位的Thr被取代成Ile的氨基酸序列；(g)抗體，該抗體包含具有下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):在SEQ ID N0:2(PF1L可變區(qū))的氨基酸序列中第28位的Asp、第32位的Tyr、第53位的Glu、第56位的Ser、第92位的Asn中的至少一個(gè)被取代成His的氨基酸序列；(h)抗體(L73)，該抗體包含具有下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:
2(PF1L可變區(qū))的氨基酸序列中第28位的Asp、第32位的Tyr和第53位的Glu被取代成His的氨基酸序列；(i)抗體(L82)，該抗體包含具有下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:I (H53可變區(qū))的氨基酸序列中第32位的Tyr和第53位的Glu被取代成His的氨基酸序列；(j)抗體(CLL5)，該抗體包含具有下述氨基酸序列的輕鏈可變區(qū):在SEQ ID NO:2(PF1L可變區(qū))的氨基酸序列中第32位的Tyr、第53位的Glu、第56位的Ser和第92位的Asn被取代成His的氨基酸序列；(k)抗體，該抗體包含(b)的重鏈可變區(qū)和(h)的輕鏈可變區(qū)；(I)抗體，該抗體包含(d)的重鏈可變區(qū)和(i)的輕鏈可變區(qū)；(m)抗體，該抗體包含(f)的重鏈可變區(qū)和(h)的輕鏈可變區(qū)。作為具有在SEQ ID N0:1(H53可變區(qū))的氨基酸序列中第27位的Tyr、第31位的Asp、第32位的Asp、第35位的Trp、第51位的Tyr、第59位的Asn、第63位的Ser、第106位的Met、第108位的Tyr中的至少I個(gè)被取代成His的氨基酸序列的重鏈可變區(qū)的具體例子，例如有以下的重鏈可變區(qū):重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO:3(H3pI)的氨基酸序列重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO:4(H170)的氨基酸序列重鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO:5(CLH5)的氨基酸序列作為具有在SEQ ID NO:2 (PF1L可變區(qū))的氨基酸序列中第28位的Asp、第32位的Tyr、第53位的Glu、第56位的Ser、第92位的Asn中的至少I個(gè)被取代成His的氨基酸序列的輕鏈可變區(qū)的具體例子，例如有以下的輕鏈可變區(qū):輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO:6(L73)的氨基酸序列輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO:7(L82)的氨基酸序列輕鏈可變區(qū)，其中具有SEQ ID NO:8(CLL5)的氨基酸序列上述H3pl、H170、CLH5、L73、L82和CLL5的各抗體中的氨基酸位點(diǎn)和氨基酸取代見(jiàn)下表I。氨基酸位點(diǎn)根據(jù)Kabat編號(hào)來(lái)表不。[表 1]
權(quán)利要求
1.藥品的制備方法，該制備方法包括以下步驟 (a)測(cè)定ρΗ6.7-ρΗΙΟ. O下的抗體的抗原結(jié)合活性的步驟； (b)測(cè)定pH4.0-pH6. 5下的抗體的抗原結(jié)合活性的步驟； (c)選擇pH6.7-pH10. O下的抗原結(jié)合活性高于pH4. 0_pH6. 5下的抗原結(jié)合活性的抗體的步驟； (d)獲得編碼(c)中所選擇的抗體的基因的步驟；和 (e)使用(d)中得到的基因制備抗體的步驟， 其中所述藥品包括以下中的任一種 (i)血漿中滯留性優(yōu)異的抗體； ( )當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能夠兩次以上與抗原結(jié)合的抗體； (iii)當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能結(jié)合的抗原數(shù)多于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體； (iv)在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗體； (v)與抗原結(jié)合并攝入細(xì)胞內(nèi)、并且以未與抗原結(jié)合的形式被釋放到細(xì)胞外的抗體；或 (vi)在血漿中抗原消除能力增加的抗體。
2.藥品的制備方法，該制備方法包括以下步驟 (a)在pH6.7-pH10. O的條件下使抗體與抗原結(jié)合的步驟； (b)將(a)的與抗原結(jié)合的抗體置于pH4.0-pH6. 5的條件下的步驟； (c)收集在pH4.0-pH6. 5的條件下解離的抗體的步驟； (d)獲得編碼(C)中取得的抗體的基因的步驟；和 (e)使用(d)中得到的基因制備抗體的步驟 其中所述藥品包括以下中的任一種 (i)血漿中滯留性優(yōu)異的抗體； ( )當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能夠兩次以上與抗原結(jié)合的抗體； (iii)當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能結(jié)合的抗原數(shù)多于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體； (iv)在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗體； (v)與抗原結(jié)合并攝入細(xì)胞內(nèi)、并且以未與抗原結(jié)合的形式被釋放到細(xì)胞外的抗體；或 (vi)在血漿中抗原消除能力增加的抗體。
3.藥品的制備方法，該制備方法包括以下步驟 (a)在第一pH條件下使抗體與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟； (b)在第二pH條件下從柱上洗脫在第一 pH條件下與柱結(jié)合的抗體的步驟； (c)收集被洗脫的抗體的步驟； (d)獲得編碼(C)中取得的抗體的基因的步驟； (e)使用(d)中得到的基因制備抗體的步驟， 其中所述藥品包括其在第一 PH下的結(jié)合活性高于第二 PH下的結(jié)合活性的抗體，其中第一 pH為6. 7-10. O和第二 pH為4. 0-6. 5，并且所述抗體為以下中的任一種(i)血漿中滯留性優(yōu)異的抗體； ( )當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能夠兩次以上與抗原結(jié)合的抗體； (iii)當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能結(jié)合的抗原數(shù)多于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體； (iv)在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗體； (v)與抗原結(jié)合并攝入細(xì)胞內(nèi)、并且以未與抗原結(jié)合的形式被釋放到細(xì)胞外的抗體；或 (vi)在血漿中抗原消除能力增加的抗體。
4.藥品的制備方法，該制備方法包括以下步驟 (a)在第一pH條件下使抗體文庫(kù)與固定有抗原的柱結(jié)合的步驟； (b)在第二pH條件下從柱上洗脫抗體的步驟； (c)擴(kuò)增編碼被洗脫的抗體的基因的步驟； (d)收集被洗脫的抗體的步驟； (e)獲得編碼(d)中取得的抗體的基因的步驟；和 (f)使用(e)中得到的基因制備抗體的步驟， 其中所述藥品包括其在第一 PH下的結(jié)合活性高于第二 pH下的結(jié)合活性的抗體，其中第一 pH為6. 7-10. O和第二 pH為4. 0-6. 5，并且所述抗體為以下中的任一種 (i)血漿中滯留性優(yōu)異的抗體； ( )當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能夠兩次以上與抗原結(jié)合的抗體； (iii)當(dāng)在包含表達(dá)FcRn的細(xì)胞的動(dòng)物中測(cè)量時(shí)能結(jié)合的抗原數(shù)多于其抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體； (iv)在細(xì)胞內(nèi)解離在細(xì)胞外結(jié)合的抗原的抗體； (v)與抗原結(jié)合并攝入細(xì)胞內(nèi)、并且以未與抗原結(jié)合的形式被釋放到細(xì)胞外的抗體；或 (vi)在血漿中抗原消除能力增加的抗體。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的制備方法，該制備方法進(jìn)一步包括用組氨酸取代抗體中的至少I個(gè)氨基酸或插入至少I個(gè)組氨酸到抗體中的步驟。
全文摘要
本發(fā)明是與多個(gè)分子的抗原反復(fù)結(jié)合的抗原結(jié)合分子。發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)與在血漿中的pH下的抗原結(jié)合活性相比在早期核內(nèi)體內(nèi)的pH下的抗原結(jié)合活性弱的抗體，其能夠以1分子的抗體與多個(gè)分子的抗原結(jié)合，血漿中半衰期長(zhǎng)，可與抗原結(jié)合的期間得到改善。
文檔編號(hào)A61K39/395GK103251948SQ20131016063
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2009年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月11日
發(fā)明者井川智之, 石井慎也, 前田敦彥, 中井貴士 申請(qǐng)人:中外制藥株式會(huì)社