專利名稱：雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從雞感染性糞便中分離、純化艾美耳球蟲(chóng)卵囊并制備活卵囊疫苗的技術(shù)，特別指雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
雞艾美耳球蟲(chóng)早熟弱毒疫苗的制備依賴于從感染性糞便中分離卵囊，而球蟲(chóng)卵囊的分離與純化是一項(xiàng)十分復(fù)雜的工作。現(xiàn)有的生產(chǎn)工藝移植于實(shí)驗(yàn)室的分離技術(shù)，應(yīng)用飽和鹽水漂浮法分離卵囊。其主要原理是:由于球蟲(chóng)卵囊的密度(1.103 1.064)介于水和飽和鹽水的密度之間，當(dāng)將含有雜質(zhì)的卵囊溶液放在水中離心機(jī)離心時(shí)，卵囊和少量的物質(zhì)比水密度大一起下沉，由于浮力作用，比水密度小的雜質(zhì)上浮，離心后，棄上清液，除去了比水密度小的雜質(zhì)；當(dāng)將含有雜質(zhì)的卵囊溶液放在飽和鹽水(蔗糖溶液、飽和硫酸鎂和飽和鉻硫酸)中離心時(shí)，由于浮力作用，卵囊和少量的物質(zhì)比飽和鹽水密度小一起上浮，離心后，棄沉淀，除去了比飽和鹽水密度大的雜質(zhì)。隨后，分離的卵囊用次氯酸鈉處理，去除細(xì)菌和卵囊表面的粘附物，配制疫苗。飽和鹽水漂浮法是實(shí)驗(yàn)室最常用的球蟲(chóng)卵囊分離技術(shù)，該技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，易于掌握，可重復(fù)性好，結(jié)果可靠。但用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)有嚴(yán)重缺陷，主要表現(xiàn)為:①篩分效率低，不能實(shí)現(xiàn)管道化連接和機(jī)械化生產(chǎn)；②離心物料量過(guò)大，離心機(jī)數(shù)量要求多，離心時(shí)間長(zhǎng)。這些原因是造成疫苗產(chǎn)能量小、產(chǎn)業(yè)化程度低的直接因素，并進(jìn)一步導(dǎo)致疫苗的成本上升，影響了疫苗的推廣與使用。艾美耳屬(Eimeria)球蟲(chóng)(Coccidium)是寄生于雞腸道的一類專性寄生原蟲(chóng)，弓丨起雞球蟲(chóng)病(Coccidiosis)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界已報(bào)道的雞球蟲(chóng)共有15種，其中，有5種具有明顯的致病性，它們是:柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(E.tenella)、毒害艾美耳球蟲(chóng)(E.necatrix)、巨型艾美耳球蟲(chóng)(E.maxima)、堆形艾美耳球蟲(chóng)(E.acervulina)及和緩艾美耳球蟲(chóng)(E.mitis)。這5種球蟲(chóng)中，有3種對(duì)雛雞具危害性，它們是:柔嫩艾美耳球蟲(chóng)、巨型艾美耳球蟲(chóng)和堆形艾美耳球蟲(chóng)。球蟲(chóng)病是一種普遍存在的感染性疫病，世界上凡是有雞的地方就會(huì)有雞球蟲(chóng)及雞球蟲(chóng)病的發(fā)生，而規(guī)?；u場(chǎng)是雞球蟲(chóng)病易發(fā)生的適宜場(chǎng)所，常常出現(xiàn)該病的爆發(fā)。雞球蟲(chóng)病是一種感染迅速，傳播快而廣泛，且致病率、致死率極高的烈性感染病，在防治不當(dāng)?shù)那闆r下，感染率和死亡率均高達(dá)50%以上。因此，雞球蟲(chóng)病對(duì)養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，全球每年因該病造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億元人民幣，我國(guó)每年因該病造成的損失也不少于百億元。在養(yǎng)雞業(yè)集約化不斷提高的今天，防治雞球蟲(chóng)病是養(yǎng)雞業(yè)疫病防控工作中不可缺少的環(huán)節(jié)。從上世紀(jì)80年代，雞球蟲(chóng)病的防控取得了重大進(jìn)展，主要得益于大量抗球蟲(chóng)藥物的出現(xiàn)，并取得令人滿意的成效。然而，大量的抗球蟲(chóng)藥物多為化學(xué)類產(chǎn)品(如氯苯胍、尼卡巴嗪、二硝托胺 、地克珠利、尼卡巴嗪和磺胺類藥物)和抗生素類產(chǎn)品(如莫能菌素、鹽霉素、拉沙菌素、那拉菌素、馬杜霉素、海南霉素)。這些產(chǎn)品的長(zhǎng)期使用必然導(dǎo)致抗藥性和藥物殘留現(xiàn)象的出現(xiàn)。而各種抗球蟲(chóng)藥物的使用均為伴料給藥。實(shí)際上在上世紀(jì)90年代抗藥現(xiàn)象已十分普遍，在這種情況下新藥的研制壓力聚增，養(yǎng)雞企業(yè)的防控難度日益加大。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，全球范圍內(nèi)化學(xué)藥品和抗生素的使用受到限制，食品安全制度受到越來(lái)越多的關(guān)注，發(fā)達(dá)國(guó)家已基本禁止了化學(xué)抗球蟲(chóng)藥物的使用，抗生素類抗球蟲(chóng)藥物的使用也受到明顯的限制。在美國(guó)、日本和歐共體已明令禁止此類產(chǎn)品出現(xiàn)在飼料中。在我國(guó)由于各種抗球蟲(chóng)藥物不加限制的應(yīng)用，抗藥性已普遍產(chǎn)生，有的產(chǎn)品(如莫能菌素)已無(wú)臨床使用價(jià)值。近年來(lái)我國(guó)的食品安全政策開(kāi)始實(shí)施，同時(shí)消費(fèi)者自身的健康意識(shí)日益增強(qiáng)，抗球蟲(chóng)藥物的市場(chǎng)日漸萎縮，而且，我國(guó)也將在近期實(shí)施禁止或限制使用抗球蟲(chóng)藥物的市場(chǎng)政策，這樣雞球蟲(chóng)病的防治形勢(shì)驟然緊張。為了有效防治雞球蟲(chóng)病，確保養(yǎng)雞業(yè)的健康發(fā)展，迫切需要尋找新的防治方法，這其中疫苗接種預(yù)防是具有前途的途徑之一。然而，傳統(tǒng)的疫苗制造技術(shù)不適用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，急切需要適于規(guī)?；a(chǎn)技術(shù)工藝。發(fā)明專利“雞艾美耳球蟲(chóng)卵囊批量制備方法”(專利號(hào):2011100291271.6)公開(kāi)了球蟲(chóng) 卵囊的批量分離純化技術(shù)，是雞球蟲(chóng)疫苗生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)之一，但不能解決疫苗制備的全部工藝，特別是疫苗固體制劑。雞球蟲(chóng)疫苗的生產(chǎn)有賴于從感染雞糞中分離卵囊，再將卵囊合理配比制備疫苗?，F(xiàn)有的疫苗生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)述如下:含卵囊雞糞一稀釋混合一60目篩分過(guò)濾一200目篩分過(guò)濾—離心粗分一飽和鹽水細(xì)分一離心脫鹽一卵囊消毒一孢子化一卵囊計(jì)數(shù)一卵囊配比一分裝該生產(chǎn)工藝實(shí)際上是移植于實(shí)驗(yàn)室的常用方法，其不足之處顯而易見(jiàn):①篩分過(guò)濾效率低下，篩分處理分為2個(gè)工序，費(fèi)時(shí)費(fèi)力；而且，非機(jī)械化篩分不能產(chǎn)生足夠的“篩分力”，篩分效果差。②離心處理所需設(shè)備數(shù)量過(guò)多或耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)，如前分析，常規(guī)的離心技術(shù)不適于處理大量物料，即使是使用超大容量離心設(shè)備也達(dá)不到連續(xù)流離心的效果。③缺乏對(duì)卵囊的微囊化處理，只能制備液體劑型，限制了疫苗的使用和效果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，這種生產(chǎn)工藝由高效混合、接力篩分、連續(xù)流離心粗分、飽和鹽水細(xì)分和卵囊微囊化處理等技術(shù)配套組成，使疫苗的制備效率成倍提高、制備成本大幅降低。本生產(chǎn)工藝用于雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒多價(jià)疫苗液體和固體制劑的生產(chǎn)，它是在已有技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)改進(jìn)卵囊篩分設(shè)備并與新工藝技術(shù)組合，不僅形成了完整的疫苗生產(chǎn)工藝，而且解決了固體制劑的生產(chǎn)技術(shù)。為使雞球蟲(chóng)疫苗的生產(chǎn)工藝符合產(chǎn)業(yè)化要求，提高產(chǎn)能量、降低產(chǎn)品成本,必須對(duì)現(xiàn)有技術(shù)工藝進(jìn)行升級(jí)，并實(shí)現(xiàn)管道化連接與機(jī)械化生產(chǎn)。本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題由如下方案來(lái)實(shí)現(xiàn):雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝由以下步驟完成:含卵囊雞糞一高效混合一接力篩分一連續(xù)流離心粗分離一飽和鹽水細(xì)分一離心脫鹽一卵囊消毒一孢子化一卵囊計(jì)數(shù)一卵囊配比一微囊化處理一分裝。具體步驟為:(I)含卵囊雞糞高效混合，取感染雞新鮮糞便于混合機(jī)內(nèi)，加3 4倍重量清水稀釋，攪拌混勻后再加入上述重量0.05 0.1 %的胃蛋白酶，繼續(xù)混合I 2min，靜置5 6min后再加入5 7倍重量的清水，繼續(xù)攪拌混勻成糞液；(2)接力篩分，篩分機(jī)分上下兩層，上篩網(wǎng)60目、下層篩網(wǎng)200目，打開(kāi)混合機(jī)出料口，自上層篩分機(jī)進(jìn)料口一次加入所述糞液25 35升，糞液經(jīng)篩分過(guò)濾后直接進(jìn)入下層篩分機(jī)進(jìn)行第2次篩分，第2次篩分的濾液進(jìn)入儲(chǔ)液罐，更換篩網(wǎng)，再加入25 35升糞液，繼續(xù)進(jìn)行篩分，如此直至所有糞液篩分完畢；(3)連續(xù)流離心粗分離，儲(chǔ)液罐加料裝置與離心機(jī)進(jìn)料裝置連接，開(kāi)啟離心機(jī)進(jìn)料開(kāi)關(guān)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為4000rpm，所述篩分完畢物料由進(jìn)料口進(jìn)入離心機(jī)，在分離系統(tǒng)中受到離心力的作用，通過(guò)過(guò)濾篩網(wǎng)截留卵囊，上清液穿過(guò)篩網(wǎng)進(jìn)入過(guò)濾倉(cāng)由出液口排出，所述篩分完畢物料在離心過(guò)程中連續(xù)導(dǎo)入，卵囊沉淀留在離心倉(cāng)內(nèi)，上清液則不斷排出，排出的上清液收集于容器中；(4)飽和鹽水細(xì)分，連續(xù)離心完成后，取出離心倉(cāng)，從離心倉(cāng)內(nèi)移出離心卵囊沉淀物稱量，加5倍重的飽和鹽水充分混勻，再加入離心管內(nèi)以3000rpm離心10分鐘；(5)離心脫鹽，前一工序離心完成后取出離心管，吸取離心管表面2 3cm液體，力口至另一同樣體積離心管中，再加入純水至原離心管刻度混勻，離心管裝入離心機(jī)轉(zhuǎn)子架，開(kāi)啟離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心15分鐘，離心停止后取出離心管，棄去上清液再加入純水至原離心管刻度，在同樣設(shè)置下進(jìn)行第2次離心，重復(fù)上述離心操作進(jìn)行第3次離心脫鹽，第3次離心脫鹽后的沉淀物即為卵囊；(6)卵囊除污、消毒，取出離心管棄去上清液，沉淀物卵囊中加1%次氯酸鈉溶液，混勻，作用5分鐘，離心管中再加入注射用水至離心管刻度，3000rpm離心15分鐘，洗去次氯酸鉀溶液，重復(fù)洗滌I 2次，除污消毒后的卵囊沉淀中加入2.5 %重鉻酸鉀水溶液，將卵囊含量調(diào)為5 X105/ml ；(7)孢子化，上述卵囊分裝于大平皿中，液面高度< 7mm，置于水平搖床載物臺(tái)上，啟動(dòng)搖床，在確保氧氣供·應(yīng)的前提下，至80%的卵囊完成孢子化即行停止，整個(gè)孢子化時(shí)間需24 72小時(shí)；(8)卵囊計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)孢子化卵囊數(shù)，計(jì)算每ml卵囊含量，孢子化卵囊2X5X105/ml ；(9)卵囊配比，如為多價(jià)疫苗，需按比例配制疫苗。以三價(jià)苗為例，按下表配制。雞艾美耳球蟲(chóng)三價(jià)早熟弱毒苗蟲(chóng)株配制比例
X 1000頭份/瓶 X 500頭份/瓶 蟲(chóng)株----
__卵囊量(個(gè)) 配量(ml)卵囊量(個(gè))配量(ml)
柔嫩艾美耳球蟲(chóng)早熟株 4.QX1Q5__0Λ__2.0X IO5__0.2
巨型艾美耳球蟲(chóng)早熟株 2.0X105__02_ 1.0X 1050.1
堆型艾美耳球蟲(chóng)早熟株 4.0 X IQ5__04__2.0 X IO5__0.2按卵囊數(shù)計(jì)算出各蟲(chóng)株的配液量，1000頭份包裝的裝量為IOml/瓶，卵囊液1ml，加2.5%重鉻酸鉀9ml ;500頭份包裝為5ml/瓶，卵囊液0.5ml加2.5%重鉻酸鉀4.5ml。每ml疫苗接種100只雞。(10)微囊化處理，第I步:卵囊混合將3%海藻酸鈉加入配液罐內(nèi)，按3%海藻酸鈉10:孢子化卵囊液1，v/v比例將卵囊加入海藻酸鈉中，邊加邊攪拌；第2步:反應(yīng)成囊15 20分鐘后，打開(kāi)配液罐排液口，利用壓力(或位差)使罐內(nèi)液體均勻加入另一個(gè)裝有5 %氯化鈣溶液的配液罐中，輕輕攪拌罐內(nèi)液體，使加入液體反應(yīng)形成微囊，微囊直徑2.0 3.0mm，每個(gè)囊內(nèi)包有卵囊約60 72個(gè)，平均66個(gè)；第3步:清洗用沉降法收集微包囊，用純水清洗，30°C風(fēng)吹干燥；第4步:計(jì)數(shù)與配制計(jì)算包囊形成數(shù)，并以玉米粉作為賦形劑，調(diào)整卵囊含量為15 16個(gè)/克，以10升孢子化卵囊液(10000羽份，Iml/羽)為例，卵囊總數(shù)為I X IO7個(gè)，經(jīng)上述配制后形成約15 16萬(wàn)個(gè)微包囊，可按比例加入賦形劑中，充分混勻；(11)分裝，完成微囊化處理后直接分裝。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):通過(guò)上述方案，本生產(chǎn)工藝大大提高了疫苗制造的效率，能夠滿足規(guī)模化生產(chǎn)的要求，并顯著降低了生產(chǎn)成本，有利于產(chǎn)品的推廣應(yīng)用。主要表現(xiàn)在以下幾方面:(I)應(yīng)用高效混合機(jī)和篩分機(jī)接力篩分感染性雞糞混合處理和接力篩分均使用了自動(dòng)化程度較高的設(shè)備，這比傳統(tǒng)的人工篩分提高工作效率2倍以上。使用機(jī)械化篩分不僅縮短了篩分時(shí)間，更重要的是提高了篩分效率，試驗(yàn)表明，使用篩分過(guò)濾機(jī)比人工篩網(wǎng)的卵囊收獲量提高30%以上，這是因?yàn)闄C(jī)械篩分產(chǎn)生的“篩分力”遠(yuǎn)大于人工方法。

(2)連續(xù)流離心技術(shù)和超大容量離心機(jī)的應(yīng)用在傳統(tǒng)的球蟲(chóng)卵囊分離技術(shù)中，離心分離是整體技術(shù)的核心，本生產(chǎn)工藝同樣離不開(kāi)離心分離。然而，傳統(tǒng)的離心方法受到技術(shù)和設(shè)備的限制，不能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求。以日處理300kg雞糞為單班產(chǎn)能的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)為例，混合后的糞液量可達(dá)3000升，經(jīng)60目和200目篩分后,90%的糞液成為濾液(糞洛< 10% ),全部濾液達(dá)2700升。目前國(guó)內(nèi)最大容量的離心機(jī)為6X2400ml，I次可離心處理11升濾液(按76.4%裝量計(jì))，要處理2700升濾液，I臺(tái)離心機(jī)需連續(xù)工作246次；如I臺(tái)離心機(jī)I天工作10次，則需要25臺(tái)大型離心機(jī)，這還不包括后續(xù)大量的離心純化、脫鹽和洗滌離心。因此，只有改進(jìn)離心分離技術(shù)，才是雞球蟲(chóng)疫苗規(guī)?；a(chǎn)的出路。本生產(chǎn)工藝使用I臺(tái)流速為100L/h的連續(xù)流離心機(jī)，27個(gè)小即時(shí)可處理2700升物料，若需在單班作業(yè)時(shí)間內(nèi)完成2700升物料的離心，則只需增加3臺(tái)設(shè)備。比較常規(guī)離心，連續(xù)流離心的效率提高6 10倍，單工序設(shè)備使用量減少20臺(tái)，操作人員減少40人，極大地降低了生產(chǎn)成本。經(jīng)過(guò)測(cè)算表明，以I個(gè)中等規(guī)模的疫苗(年產(chǎn)2 3億頭份)廠計(jì)，單位疫苗的生產(chǎn)成本可降低300%以上。此外，本生產(chǎn)工藝的飽和鹽水細(xì)分、脫鹽和脫次氯酸鈉洗滌中都使用了超大容量^X2400ml)離心機(jī)，此種離心機(jī)是在近幾年才面市的新機(jī)型，I次離心可處理10 12升物料，與常規(guī)離心機(jī)相比工作效率提高至少3倍。(3)卵囊微囊化處理雞球蟲(chóng)疫苗的臨床使用主要是通過(guò)與飼料、飲水混合后經(jīng)口攝入，但在實(shí)際使用中會(huì)遇到2個(gè)問(wèn)題:一是與飼料混合時(shí)，由于飼料量大性干，而疫苗量小性濕，無(wú)法做到均勻的混合，其結(jié)果導(dǎo)致一部分雞沒(méi)有攝入足夠的卵囊使免疫失敗，另一部分雞則攝入過(guò)多卵囊，出現(xiàn)感染甚至發(fā)??；二是進(jìn)行混飲時(shí)，卵囊由于重力作用而沉降于底部，使卵囊的攝入量大打折扣，從而影響了疫苗的免疫質(zhì)量。對(duì)卵囊實(shí)施微囊化處理主要有以下好處:①實(shí)現(xiàn)了疫苗的固體制劑形式，固體疫苗在與飼料混合時(shí)，二者的流動(dòng)性大大增加，易于混合均勻；②使卵囊的體積增大，增加了被主動(dòng)攝入的機(jī)率，如通過(guò)人工改變微包囊的顏色，更容易被攝入；③微包囊對(duì)卵囊產(chǎn)生保護(hù)作用，提高了疫苗的質(zhì)量。值得指出的是，固體疫苗使雞在攝入卵囊的同時(shí)，還攝入了海藻酸鈉，后者是一種粘性很大的高分子化合物，屬植物多糖類，也是一種典型的親水性溶膠，廣泛應(yīng)用于食品、印染、醫(yī)藥、造紙等行業(yè)。在制藥領(lǐng)域海藻酸鈉廣泛用作藥物制劑輔料，具有良好的穩(wěn)定性、溶解性、粘性和安全性，并具有濃縮溶液、形成凝膠和成膜的能力。該品無(wú)毒性，LD5tl值>5000mg/kg,不影響疫苗的質(zhì)量與安全性。


圖1為本生產(chǎn)工藝的流程圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例由以下步驟完成:含卵囊雞糞一高效混合一接力篩分一連續(xù)流離心粗分離—飽和鹽水細(xì)分一離心脫鹽一卵囊消毒一孢子化一卵囊計(jì)數(shù)一卵囊配比一微囊化處理一分裝(I)混合機(jī)高效混合①條件

采用自動(dòng)化程度較高的混合機(jī)代替原有的容器混合，不僅使混合效果更好，而且，混合機(jī)具有攪拌功能(攪拌轉(zhuǎn)速<60rpm),可防止卵囊沉降,混合罐內(nèi)帶有正壓(+0.4P)或具位差，可使混合好的糞液輸送至下一工序?；旌蠙C(jī)的工作容積不少于500升。②操作取感染雞新鮮糞便IOkg于混合均內(nèi)，加30Kg清水稀釋，開(kāi)動(dòng)攪拌器混勻，之后加入胃蛋白酶0.5g，繼續(xù)混合lmin，靜置5min后再加入60Kg糞量的清水，繼續(xù)攪拌混勻。(2)單層振動(dòng)篩分過(guò)濾機(jī)接力篩分①條件振動(dòng)電機(jī):電機(jī)產(chǎn)生的振動(dòng)力通過(guò)連接彈簧作用于篩面，使篩網(wǎng)產(chǎn)生振動(dòng)力，增加物料與篩網(wǎng)的接觸并防止網(wǎng)眼堵塞；不平衡重錘:將電機(jī)的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)變成水平、傾斜、垂直的三次元運(yùn)動(dòng)，再把這種運(yùn)動(dòng)傳遞給篩面，使物料在篩面上產(chǎn)生外擴(kuò)漸開(kāi)、漩渦和向中央集中的多種運(yùn)動(dòng)形式，最大限度地提高物料的運(yùn)行軌跡，從而提高網(wǎng)面利用率。通過(guò)調(diào)節(jié)上下兩端重錘的相位角，改變物料在篩網(wǎng)上的運(yùn)動(dòng)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)物料的精確分離。旋轉(zhuǎn):由于電機(jī)的轉(zhuǎn)動(dòng)，篩網(wǎng)隨之發(fā)生旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)，轉(zhuǎn)速控制在每分鐘60圈內(nèi)，此離心力的存在會(huì)導(dǎo)致物料向網(wǎng)面周邊擴(kuò)散堆積，改變篩網(wǎng)運(yùn)動(dòng)的重心夾角，使之產(chǎn)生向中央集中的動(dòng)力，防止物料堆積。篩分機(jī)直徑100cm(以篩網(wǎng)直徑計(jì))，上層篩網(wǎng)60目，下層篩網(wǎng)200目。②操作
打開(kāi)混合機(jī)出料口，自上層篩分機(jī)進(jìn)料口一次加入糞液30升，糞液經(jīng)篩分過(guò)濾后直接進(jìn)入下層篩分機(jī)進(jìn)第2次篩分，第2次篩分的濾液進(jìn)入儲(chǔ)液罐。第I次篩分結(jié)束后，更換篩網(wǎng)，再加入30升糞液，進(jìn)行第2次篩分，如此循環(huán)反復(fù)，至所有糞液篩分完畢。(3)連續(xù)流離心粗分離①條件儲(chǔ)液罐容量不低于500升，具自動(dòng)攪拌和加料功能；連續(xù)流離心機(jī)轉(zhuǎn)速不低于4000rpm,轉(zhuǎn)速控制精度±20rpm,流速> 50L/h。運(yùn)行時(shí)間控制多項(xiàng)選擇,最低連續(xù)離心時(shí)間4小時(shí)，自動(dòng)鎖蓋與內(nèi)鎖系統(tǒng)，不平衡保護(hù)，狀態(tài)自我診斷，多種電路保護(hù)。具程控功能和數(shù)字轉(zhuǎn)速顯示，可控溫。符合制藥GMP要求。②操作儲(chǔ)液罐加料裝與離心機(jī)進(jìn)料裝置連接，開(kāi)啟離心機(jī)進(jìn)料開(kāi)關(guān)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為4000rpm。物料由進(jìn)料口進(jìn)入離心機(jī)，在分離系統(tǒng)中受到離心力的作用，通過(guò)過(guò)濾篩網(wǎng)截留卵囊(包括與卵囊同體積的雜質(zhì))，液體穿過(guò)篩網(wǎng)進(jìn)入過(guò)濾倉(cāng)由出液口排出。這樣，物料在離心過(guò)程中連續(xù)導(dǎo)入，卵囊沉淀留在離心倉(cāng)內(nèi)，上清液則不斷排出。排出的上清液收集于容器中，可進(jìn)行再次連續(xù)離心，卵囊收獲量可增加10%。(4)飽和鹽水細(xì)分①條件飽和鹽水:90°C純水中加入化學(xué)級(jí)氯化鈉(NaCl)，邊加邊攪拌至出現(xiàn)沉淀為止，冷卻后使用。超大容量離心機(jī)技術(shù)參數(shù):工作容量彡2400ml X 6，水平轉(zhuǎn)子；最大轉(zhuǎn)速> 4000rpm, LED數(shù)碼管顯示與轉(zhuǎn)速設(shè)定；可控溫，具內(nèi)鎖、不平衡保護(hù)和狀態(tài)自檢功能；符合制藥GMP規(guī)范，轉(zhuǎn)子易清洗、消毒。②操作連續(xù)離心完成后，取出離心倉(cāng)，從離心倉(cāng)內(nèi)移出離心沉淀物，稱重為3.82Kg，加19.13Kg飽和鹽水充分混勻，等量加入離心管內(nèi)離心(3000轉(zhuǎn)10分鐘)。(5)離心脫鹽①條件超大容量離心機(jī)技術(shù)參數(shù):工作容量> 2400ml X 6，水平轉(zhuǎn)子；最大轉(zhuǎn)速> 4000rpm, LED數(shù)碼管顯示與轉(zhuǎn)速設(shè)定；可控溫，具內(nèi)鎖、不平衡保護(hù)和狀態(tài)自檢功能；符合制藥GMP規(guī)范，轉(zhuǎn)子易清洗、消毒。②操作前一工序離心完成后取出離心管，小心吸取離心管表面2cm液體，加至另一離心管中，再加入純水至原來(lái)體積，混勻。離心管裝入離心機(jī)轉(zhuǎn)子架，開(kāi)啟離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)，離心15分鐘。
離心停止后取出離心管，棄去上清液再加入純水至刻度，在同樣設(shè)置下進(jìn)行第2次離心。重復(fù)上述離心操作進(jìn)行第3次離心脫鹽。第3次離心脫鹽后的沉淀物，即為卵囊。(6)卵囊除污、消毒①條件原液濃度為5.25%次氯酸鈉，使用時(shí)用蒸餾水按1:9配制成0.5%水溶液備用。②操作取出離心管棄去上清液，沉淀物(卵囊)中加I %次氯酸鈉溶液，混勻，作用5分鐘。離心管中再加入注射用水至刻度，3000轉(zhuǎn)離心15分鐘洗去次氯酸鉀溶液，重復(fù)洗滌2次。除污消毒后的卵囊沉淀中加入2.5%重鉻酸鉀水溶液，將卵囊含量調(diào)為5X105/ml ο(7)孢子化①條件孢子化場(chǎng)所應(yīng)符合萬(wàn)級(jí)凈化條件，孢子化溫度22 28°C ;水平搖床主 要技術(shù)參數(shù):搖轉(zhuǎn)方式:水平360度旋轉(zhuǎn)；旋轉(zhuǎn)頻率:30 300rpm ；最大負(fù)載.》IOkg ；無(wú)級(jí)調(diào)速，數(shù)字顯示，符合制藥GMP標(biāo)準(zhǔn)。②操作上述卵囊分裝于大平皿中，液面高度< 7mm，置于水平搖床載物臺(tái)上，啟動(dòng)搖床，在確保氧氣供應(yīng)的前提下，至80%的卵囊完成孢子化即行停止，整個(gè)孢子化時(shí)間約48小時(shí)；(8)卵囊計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)孢子化卵囊數(shù)，計(jì)算每ml卵囊含量，孢子化卵囊2X5X105/ml ；(9)卵囊配比如為多價(jià)疫苗，需按比例配制疫苗。以三價(jià)苗為例，按下表配制。雞艾美耳球蟲(chóng)三價(jià)早熟弱毒苗蟲(chóng)株配制比例
權(quán)利要求
1.雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，其特征是由以下步驟完成含卵囊雞糞一高效混合一接力篩分一連續(xù)流離心粗分離一飽和鹽水細(xì)分一離心脫鹽一卵囊消毒一孢子化一卵囊計(jì)數(shù)一卵囊配比一微囊化處理一分裝，具體步驟為 (1)含卵囊雞糞高效混合，取感染雞新鮮糞便于混合機(jī)內(nèi)，加3 4倍重量清水稀釋，攪拌混勻后再加入上述重量O. 05 O. I %的胃蛋白酶，繼續(xù)混合I 2min，靜置5 6min后再加入5 7倍重量的清水，繼續(xù)攪拌混勻成糞液； (2)接力篩分，篩分機(jī)分上下兩層，上篩網(wǎng)60目、下層篩網(wǎng)200目，打開(kāi)混合機(jī)出料口，自上層篩分機(jī)進(jìn)料口一次加入所述糞液25 35升，糞液經(jīng)篩分過(guò)濾后直接進(jìn)入下層篩分機(jī)進(jìn)行第2次篩分，第2次篩分的濾液進(jìn)入儲(chǔ)液罐，更換篩網(wǎng)，再加入25 35升糞液，繼續(xù)進(jìn)行篩分，如此直至所有糞液篩分完畢； (3)連續(xù)流離心粗分離，儲(chǔ)液罐加料裝置與離心機(jī)進(jìn)料裝置連接，開(kāi)啟離心機(jī)進(jìn)料開(kāi)關(guān)，離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)定為4000rpm，所述篩分完畢物料由進(jìn)料口進(jìn)入離心機(jī)，在分離系統(tǒng)中受到離心力的作用，通過(guò)過(guò)濾篩網(wǎng)截留卵囊，上清液穿過(guò)篩網(wǎng)進(jìn)入過(guò)濾倉(cāng)由出液口排出，所述篩分完畢物料在離心過(guò)程中連續(xù)導(dǎo)入，卵囊沉淀留在離心倉(cāng)內(nèi)，上清液則不斷排出，排出的上清液收集于容器中； (4)飽和鹽水細(xì)分，連續(xù)離心完成后，取出離心倉(cāng)，從離心倉(cāng)內(nèi)移出離心卵囊沉淀物稱量，加5倍重的飽和鹽水充分混勻，再加入離心管內(nèi)以3000rpm離心10分鐘； (5)離心脫鹽，前一工序離心完成后取出離心管，吸取離心管表面2 3cm液體，加至另一同樣體積離心管中，再加入純水至原離心管刻度混勻，離心管裝入離心機(jī)轉(zhuǎn)子架，開(kāi)啟離心機(jī)，設(shè)定轉(zhuǎn)速為3000rpm，離心15分鐘，離心停止后取出離心管，棄去上清液再加入純水至原離心管刻度，在同樣設(shè)置下進(jìn)行第2次離心，重復(fù)上述離心操作進(jìn)行第3次離心脫鹽，第3次離心脫鹽后的沉淀物即為卵囊； (6)卵囊除污、消毒，取出離心管棄去上清液，沉淀物卵囊中加1%次氯酸鈉溶液，混勻，作用5分鐘，離心管中再加入注射用水至離心管刻度，3000rpm離心15分鐘，洗去次氯酸鉀溶液，重復(fù)洗滌I 2次，除污消毒后的卵囊沉淀中加入2. 5 %重鉻酸鉀水溶液，將卵囊含量調(diào)為5 X105/ml ； (7)孢子化，上述卵囊分裝于大平皿中，液面高度<7mm，置于水平搖床載物臺(tái)上，啟動(dòng)搖床，在確保氧氣供應(yīng)的前提下，至80%的卵囊完成孢子化即行停止，整個(gè)孢子化時(shí)間需24 72小時(shí)； (8)卵囊計(jì)數(shù),計(jì)數(shù)孢子化卵囊數(shù),計(jì)算每ml卵囊含量,孢子化卵囊2X5X105/ml ； (9)卵囊配比， 如為多價(jià)疫苗，需按比例配制疫苗。以三價(jià)苗為例，按下表配制。
雞艾美耳球蟲(chóng)三價(jià)早熟弱毒苗蟲(chóng)株配制比例
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒疫苗產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)工藝，由以下步驟完成含卵囊雞糞→高效混合→接力篩分→連續(xù)流離心粗分離→飽和鹽水細(xì)分→離心脫鹽→卵囊消毒→孢子化→卵囊計(jì)數(shù)→卵囊配比→微囊化處理→分裝。本生產(chǎn)工藝用于雞艾美耳球蟲(chóng)弱毒多價(jià)疫苗液體和固體制劑的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，大大提高了疫苗制造效率，能夠滿足規(guī)?；a(chǎn)的要求，有利于產(chǎn)品的推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61P33/02GK103251938SQ20131016057
公開(kāi)日2013年8月21日 申請(qǐng)日期2013年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月15日
發(fā)明者郝文華, 鄭潤(rùn)寬, 徐勇 申請(qǐng)人:內(nèi)蒙古神元生物工程股份有限公司