本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及一種引物組、錨定引物、文庫(kù)構(gòu)建方法及基因測(cè)序方法。

背景技術(shù)：

第二代高通量測(cè)序技術(shù)包括連接測(cè)序法和合成測(cè)序法。其中，所述連接測(cè)序法是基于連接酶在核酸片段之間進(jìn)行連接反應(yīng)的過(guò)程中的保真性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，以待測(cè)序核酸片段為模板，錨定引物（又稱(chēng)測(cè)序引物，其與待測(cè)序核酸片段所在鏈互補(bǔ)）和寡核苷酸探針（該探針的特定位置上帶有熒光標(biāo)記）進(jìn)行連接反應(yīng)，通過(guò)檢測(cè)連接產(chǎn)物上的熒光標(biāo)記從而確定寡核苷酸探針上帶有熒光標(biāo)記的特定位置對(duì)應(yīng)的序列的信息。所述合成測(cè)序法是基于聚合酶在延伸核酸鏈過(guò)程中的保真性來(lái)實(shí)現(xiàn)的，以待測(cè)序核酸片段為模板，錨定引物互補(bǔ)結(jié)合至待測(cè)序核酸片段上，通過(guò)檢測(cè)在延伸過(guò)程中產(chǎn)生的信號(hào)來(lái)確定待測(cè)序核酸片段上相應(yīng)位置的序列信息。第二代高通量測(cè)序技術(shù)因?yàn)槠涓咄亢偷统杀?，目前用于snp分型檢測(cè)。

現(xiàn)有技術(shù)中的一種利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)的snp分型方法，包括以下步驟：a、通過(guò)引物擴(kuò)增獲得待測(cè)snp位點(diǎn)的核酸序列；b、基于步驟a的產(chǎn)物構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)；c、將錨定引物錨定在測(cè)序文庫(kù)分子上，通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)待測(cè)snp位點(diǎn)的序列信息。為了加快待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)，減少測(cè)序的循環(huán)數(shù)，提高snp位點(diǎn)檢測(cè)效率，一般將錨定引物設(shè)計(jì)在待測(cè)snp位點(diǎn)的附近。但是這種設(shè)計(jì)方法，往往會(huì)因?yàn)閟np位點(diǎn)所在序列的特殊性，例如該snp位點(diǎn)附近序列存在特殊結(jié)構(gòu)——重復(fù)序列、發(fā)夾情況等，導(dǎo)致按照上述方法設(shè)計(jì)的錨定引物，無(wú)法準(zhǔn)確的錨定在預(yù)定位置，造成測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確或測(cè)序失敗；使得該方法無(wú)法大規(guī)模推廣。

因此需要一種新的適用范圍廣的引物組、錨定引物、試劑盒、文庫(kù)構(gòu)建及基因測(cè)序方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種新的適用范圍廣的引物組、錨定引物、試劑盒、文庫(kù)構(gòu)建及基因測(cè)序方法，旨在解決現(xiàn)有的高通量基因測(cè)序技術(shù)中錨定引物的非特異性錨定的技術(shù)問(wèn)題。

為了實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種引物組，包括第一引物對(duì)，所述第一引物對(duì)中的上游引物由第一通用區(qū)和第一互補(bǔ)區(qū)組成；所述第一互補(bǔ)區(qū)與所述第一通用區(qū)的3’末端連接，所述第一互補(bǔ)區(qū)與第一序列完全互補(bǔ)；所述第一序列為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列中的一段序列，處于待測(cè)snp位點(diǎn)的3’端，所述第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp；所述第一通用區(qū)不與第二序列互補(bǔ)；所述第二序列為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列上與第一序列的3’末端連接的一段序列。

優(yōu)選的，所述第一互補(bǔ)區(qū)序列長(zhǎng)度在6至12bp之間。

優(yōu)選的，所述第一通用區(qū)序列長(zhǎng)度在6至16bp之間。

優(yōu)選的，所述第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至3bp。

優(yōu)選的，所述引物組還包括第二引物對(duì)，所述第一引物對(duì)和第二引物對(duì)分別為對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增的內(nèi)引物對(duì)和外引物對(duì)。

優(yōu)選的，所述第一引物對(duì)中的下游引物由第二通用區(qū)和第二互補(bǔ)區(qū)組成；所述第二互補(bǔ)區(qū)與所述第二通用區(qū)的3’末端連接；所述第二互補(bǔ)區(qū)為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列中的一段序列，處于待測(cè)snp位點(diǎn)的5’端；所述第二通用區(qū)與第三序列不同；所述第三序列為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列上與第二互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接的一段序列。

優(yōu)選的，所述第一通用區(qū)中含有u。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種錨定引物，所述錨定引物與第四序列完全互補(bǔ)配對(duì)；所述第四序列為單鏈核酸分子，是上述任一種引物組中的第一引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物中的一段序列；所述第四序列包括第一序列和第一歸一化區(qū)，所述第一歸一化區(qū)與第一序列的3’末端連接，所述第四序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp；或所述第四序列包括第一互補(bǔ)區(qū)和第二歸一化區(qū)，所述第二歸一化區(qū)與第一互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接，所述第四序列的3’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp。

優(yōu)選的，所述第四序列包括第一序列和第一歸一化區(qū)，所述第一歸一化區(qū)與第一序列的3’末端連接，所述第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至3bp；或

所述第四序列包括第一互補(bǔ)區(qū)和第二歸一化區(qū)，所述第二歸一化區(qū)與第一互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接，所述第四序列的3’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至3bp。

優(yōu)選的，所述第一互補(bǔ)區(qū)序列長(zhǎng)度在6至12bp之間。

優(yōu)選的，所述第一歸一化區(qū)的長(zhǎng)度在8至14bp之間。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種試劑盒，包括上述的任一種引物組。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括上述的任一種錨定引物。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了另一種試劑盒，包括上述的任一種錨定引物。

優(yōu)選的，所述試劑盒還包括上述的任一種引物組。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟：

a、利用上述的任一種引物組，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；

b、將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物與接頭連接，形成待測(cè)序文庫(kù)分子。

優(yōu)選的，所述步驟b為：將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與接頭連接，形成待測(cè)序文庫(kù)分子，并通過(guò)微球可尋址的固定在固相載體上。

更優(yōu)選的，所述步驟b包括以下步驟：

b1、將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與固定在微球上的接頭連接，形成固定在微球上的待測(cè)序文庫(kù)分子；

b2、將步驟b1所得微球可尋址的固定在固相載體上。

更優(yōu)選的，所述步驟b1中的連接反應(yīng)是在切割-連接反應(yīng)體系中進(jìn)行的，所述切割-連接反應(yīng)體系包括：連接酶、斷裂劑、固定在微球上的第一接頭和連接緩沖液；所述第一通用區(qū)中含有u；所述斷裂劑用于特異性切割u，并使含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物形成第一粘性末端；所述第一接頭為核酸分子，含有與第一粘性末端完全互補(bǔ)配對(duì)的第二粘性末端。

更優(yōu)選的，步驟b1中所述連接緩沖液中含有peg。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明還提供了一種基因測(cè)序方法，包括以下步驟：

a、利用上述的任一種引物組，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；

b、將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物與接頭連接，形成待測(cè)序文庫(kù)分子；

c、利用上述的任一種錨定引物，對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行測(cè)序，獲得待測(cè)snp位點(diǎn)的序列信息。

優(yōu)選的，所述步驟c中的測(cè)序方法為連接測(cè)序法；所述步驟b、c之間還包括步驟d，采用上述任一種錨定引物，利用無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針替換有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行一次連接測(cè)序反應(yīng)。

優(yōu)選的，所述步驟d包括以下步驟：

d1、將所述錨定引物錨定在待測(cè)序文庫(kù)分子上；

d2、加入無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針、連接酶以及相應(yīng)的緩沖液，進(jìn)行連接反應(yīng)；

d3、變性去除連接產(chǎn)物。

由上可知，本發(fā)明通過(guò)對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增引物進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)，使得通過(guò)該擴(kuò)增引物擴(kuò)增的產(chǎn)物中的待測(cè)snp位點(diǎn)附近均包括第一通用區(qū)，降低不同待測(cè)snp位點(diǎn)附近區(qū)域的復(fù)雜度，然后基于第一通用區(qū)與待測(cè)snp位點(diǎn)之間的序列，可設(shè)計(jì)相應(yīng)的錨定引物，使錨定引物準(zhǔn)確的錨定在目標(biāo)位置，本發(fā)明的引物組、錨定引物、試劑盒、文庫(kù)構(gòu)建及基因測(cè)序方法適用于多種不同的snp位點(diǎn)的檢測(cè)，尤其適用于多snp位點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)，能在保證snp位點(diǎn)檢測(cè)效率的前提下，避免因?yàn)榇郎y(cè)snp位點(diǎn)附近序列的特殊性而導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確或測(cè)序失敗現(xiàn)象的出現(xiàn)。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明第一典型實(shí)施例中第一引物對(duì)中的上游引物與待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列之間的關(guān)系示意圖。

圖2是本發(fā)明一實(shí)施例中第一引物對(duì)中的下游引物與待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列之間的關(guān)系示意圖。

圖3是本發(fā)明第二典型實(shí)施例中的錨定引物與第一引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物之間的關(guān)系示意圖。

圖4是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中第一接頭的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖5是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中第一接頭的標(biāo)簽序列與樣本來(lái)源和snp位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系圖。

圖6是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)組測(cè)序流程圖。

圖7是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中第一對(duì)比實(shí)驗(yàn)的測(cè)序流程圖。

圖8是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中樣本2的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照?qǐng)D。

圖9是本發(fā)明第三對(duì)比實(shí)驗(yàn)中rs671和rs1801253位點(diǎn)的測(cè)序采圖結(jié)果。

圖10是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中rs671和rs1801253位點(diǎn)的測(cè)序采圖結(jié)果。

圖11是本發(fā)明第三對(duì)比實(shí)驗(yàn)中rs1799853位點(diǎn)的測(cè)序采圖結(jié)果。

圖12是本發(fā)明第一具體實(shí)施例中rs1799853位點(diǎn)的測(cè)序采圖結(jié)果。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明提出第一典型實(shí)施例，一種引物組，包括第一引物對(duì)，如圖1所示，所述第一引物對(duì)中的上游引物由第一通用區(qū)和第一互補(bǔ)區(qū)組成；所述第一互補(bǔ)區(qū)與所述第一通用區(qū)的3’末端連接，所述第一互補(bǔ)區(qū)與第一序列完全互補(bǔ)；所述第一序列為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列中的一段序列，處于待測(cè)snp位點(diǎn)的3’端，所述第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp；所述第一通用區(qū)不與第二序列互補(bǔ)；所述第二序列為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列上與第一序列的3’末端連接的一段序列。

需要說(shuō)明的是，所述引物組可用于對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增，所得擴(kuò)增產(chǎn)物可用于構(gòu)建含待測(cè)snp位點(diǎn)的測(cè)序文庫(kù)，進(jìn)而進(jìn)行待測(cè)snp位點(diǎn)的高通量測(cè)序檢測(cè)。本發(fā)明通過(guò)對(duì)第一引物對(duì)中的上游引物的特殊設(shè)計(jì)，使得基于第一引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物中，待測(cè)snp位點(diǎn)附近增加了一個(gè)含第一通用區(qū)的序列。所述第一通用區(qū)的序列既不是待測(cè)樣本的模板分子中待測(cè)snp位點(diǎn)附近的序列，也不是待測(cè)樣本的模板分子中待測(cè)snp位點(diǎn)附近的互補(bǔ)序列。所述第一通用區(qū)使得針對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的一端增加了一個(gè)歸一化序列。所述第一通用區(qū)不與第二序列互補(bǔ)，無(wú)重復(fù)序列，自身不會(huì)形成發(fā)夾。本方案尤其適用于待測(cè)樣本中的模板分子上的待測(cè)snp位點(diǎn)附近序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的待測(cè)樣本，能夠有效簡(jiǎn)化待測(cè)snp位點(diǎn)附近的序列結(jié)構(gòu)，降低錨定引物的設(shè)計(jì)難度，可有效保證錨定引物準(zhǔn)確的錨定在目標(biāo)位置，避免因?yàn)榇郎y(cè)snp位點(diǎn)附近序列的特殊性而導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確或測(cè)序失敗現(xiàn)象的出現(xiàn)，適用于各類(lèi)型待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)。針對(duì)不同的待測(cè)snp位點(diǎn)，該第一通用區(qū)序列可相同。

另外，第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp，使得基于所述第一引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物所得待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行高通量基因測(cè)序時(shí)，錨定引物的末端與待測(cè)snp位點(diǎn)之間的距離在1至7bp之間，當(dāng)利用連接測(cè)序法和t4連接酶進(jìn)行測(cè)序時(shí)，可保證僅通過(guò)一次錨定引物與特定位置含熒光標(biāo)記的探針的連接，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)，提高高通量基因測(cè)序的效率。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至3bp。

本方案可有效控制待測(cè)snp位點(diǎn)與第一通用序列之間的間距，使得錨定引物中含有一段足夠長(zhǎng)度的第一通用序列或第一通用序列的互補(bǔ)序列；這在同時(shí)檢測(cè)多個(gè)待測(cè)snp位點(diǎn)時(shí)，既保證各錨定引物均能準(zhǔn)確錨定在各自目標(biāo)位置上，又使得各錨定引物與目標(biāo)位置結(jié)合情況更為一致，歸一化，減小因?yàn)楦麇^定引物與目標(biāo)位置結(jié)合情況的差異，從而減小各待測(cè)snp位點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)的差異，提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。

為了保證利用第一引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增所得產(chǎn)物的純度，避免非特異性擴(kuò)增，本發(fā)明在第一典型實(shí)施例的基礎(chǔ)上，提出一實(shí)施例，所述第一互補(bǔ)區(qū)序列長(zhǎng)度在6至12bp之間。

本方案保證了第一引物對(duì)中的上游引物與含待測(cè)snp位點(diǎn)的模板序列的特異性集合，避免了非特異性擴(kuò)增，又保證了不同待測(cè)snp位點(diǎn)附近序列之間具有足夠的區(qū)分度。更優(yōu)選的，所述第一互補(bǔ)區(qū)序列長(zhǎng)度在7至10bp之間。

為了進(jìn)一步保證降低了不同待測(cè)snp位點(diǎn)附近區(qū)域的序列復(fù)雜度，本發(fā)明在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上提出另一實(shí)施例，所述第一通用區(qū)序列長(zhǎng)度在6至16bp之間。

本方案中，第一通用序列較大程度的避免了因?yàn)樾蛄羞^(guò)長(zhǎng)或序列過(guò)短導(dǎo)致的第一通用序列內(nèi)部形成二級(jí)結(jié)構(gòu)，或第一通用序列與其他序列之間形成二級(jí)結(jié)構(gòu)的可能性，降低了錨定引物的設(shè)計(jì)難度。

在上述任一實(shí)施例的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出另一實(shí)施例，所述引物組還包括第二引物對(duì)，所述第一引物對(duì)和第二引物對(duì)分別為對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增的內(nèi)引物對(duì)和外引物對(duì)。

本方案中，針對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)，可利用內(nèi)引物對(duì)和外引物對(duì)對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行巢式pcr擴(kuò)增，從而提高第一引物對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物中目標(biāo)分子的純度。

為了進(jìn)一步降低利用上述引物組擴(kuò)增所得產(chǎn)物之間的結(jié)構(gòu)差異，基于上述任一實(shí)施例，本發(fā)明提出另一具體實(shí)施例，如圖2所示，所述第一引物對(duì)中的下游引物由第二通用區(qū)和第二互補(bǔ)區(qū)組成；所述第二互補(bǔ)區(qū)與所述第二通用區(qū)的3’末端連接；所述第二互補(bǔ)區(qū)為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列中的一段序列，處于待測(cè)snp位點(diǎn)的5’端；所述第二通用區(qū)與第三序列不同；所述第三序列為待測(cè)snp位點(diǎn)所在序列上與第二互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接的一段序列。

需要說(shuō)明的是，所述第二通用區(qū)的序列既不是待測(cè)樣本的模板分子中待測(cè)snp位點(diǎn)附近的序列，也不是待測(cè)樣本的模板分子中待測(cè)snp位點(diǎn)附近的互補(bǔ)序列。所述第二通用區(qū)中無(wú)重復(fù)序列，自身不會(huì)形成發(fā)夾。基于本方案的第一引物對(duì)擴(kuò)增所得產(chǎn)物，在待測(cè)snp位點(diǎn)兩端各有一通用序列，針對(duì)不同的待測(cè)snp位點(diǎn)，該第一通用區(qū)和第二通用區(qū)序列可均相同；從而降低了不同待測(cè)snp位點(diǎn)附近區(qū)域的序列復(fù)雜度。同時(shí)也使得針對(duì)各待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增效率更為一致。

基于上述任一實(shí)施例，為了使得基于第一引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物能夠更快的完成測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建，本發(fā)明提出一實(shí)施例，所述第一通用區(qū)中含有可斷裂位點(diǎn)。所述可斷裂位點(diǎn)能被切割劑特異性切割，使得基于第一引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物形成第一粘性末端。

本方案中，基于第一通用區(qū)中的可斷裂位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物被切出第一粘性末端后，可與含有與第一粘性末端互補(bǔ)配對(duì)的第二粘性末端的接頭分子直接連接，提高連接效率。

優(yōu)選的，所述可斷裂位點(diǎn)為核糖核苷酸、rna序列或限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)。相應(yīng)的，所述斷裂劑為rnaseh、rnaseh或限制性?xún)?nèi)切酶。

當(dāng)所述可斷裂位點(diǎn)為u時(shí)，所述斷裂劑優(yōu)選為user酶。

優(yōu)選的，所述可斷裂位點(diǎn)與其所在鏈5’末端的距離為1至6個(gè)堿基。此時(shí)，第一粘性末端與接頭的第二粘性末端的互補(bǔ)配對(duì)連接反應(yīng)效率較高，更優(yōu)選為4或5bp，此時(shí)連接反應(yīng)的效率最高。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出第二典型實(shí)施例，如圖3所示，一種錨定引物，所述錨定引物與第四序列完全互補(bǔ)配對(duì)；所述第四序列為單鏈核酸分子，是上述任一種引物組中的第一引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物中的一段序列；如圖3a所示，所述第四序列包括第一序列和第一歸一化區(qū)，所述第一歸一化區(qū)與第一序列的3’末端連接，所述第四序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp；或如圖3b所示，所述第四序列包括第一互補(bǔ)區(qū)和第二歸一化區(qū)，所述第二歸一化區(qū)與第一互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接，所述第四序列的3’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至7bp。

需要說(shuō)明的是，所述第一歸一化區(qū)為第一通用區(qū)的互補(bǔ)序列中與第一序列的3’末端連接一段序列；所述第二歸一化區(qū)為第一通用區(qū)中與第一互補(bǔ)區(qū)的5’端連接的一段序列。本方案中的錨定引物基于上述任一方案中引物組的第一引物對(duì)的擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建的測(cè)序文庫(kù)而設(shè)計(jì)，針對(duì)不同的待測(cè)snp位點(diǎn)，這些錨定引物含有一個(gè)共同第一歸一化序列或第二歸一化序列，它們能準(zhǔn)確錨定在目標(biāo)位置上，避免因?yàn)榇郎y(cè)snp位點(diǎn)附近序列的特殊性而導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確或測(cè)序失敗現(xiàn)象的出現(xiàn)，又使得各錨定引物與目標(biāo)位置結(jié)合情況更為一致、歸一化，減小因?yàn)楦麇^定引物與目標(biāo)位置結(jié)合情況的差異，從而減小各待測(cè)snp位點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)的差異，提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。

基于上述實(shí)施例，本發(fā)明提出另一實(shí)施例，所述第四序列包括第一序列和第一歸一化區(qū)，所述第一歸一化區(qū)與第一序列的3’末端連接，所述第一序列的5’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至3bp；或所述第四序列包括第一互補(bǔ)區(qū)和第二歸一化區(qū)，所述第二歸一化區(qū)與第一互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接，所述第四序列的3’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1至3bp。

本方案中，錨定引物上用于延伸的一端與待測(cè)snp位點(diǎn)的距離為1至3bp，當(dāng)使用連接測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序時(shí)，可保證僅通過(guò)一次錨定引物與特定位置含熒光標(biāo)記的探針的連接，即實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)，提高高通量基因測(cè)序的效率，且1至3bp在t4連接酶的保真度范圍（1至7bp）中處于高保真的范圍，可有效提高待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)準(zhǔn)確度；當(dāng)使用合成測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序時(shí)，所述第四序列包括第一互補(bǔ)區(qū)和第二歸一化區(qū)，所述第二歸一化區(qū)與第一互補(bǔ)區(qū)的5’末端連接，所述第四序列的3’末端距待測(cè)snp位點(diǎn)1bp，此時(shí)僅需要延伸1個(gè)bp，即進(jìn)行1個(gè)循環(huán)的反應(yīng)，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)，檢測(cè)效率高。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一互補(bǔ)區(qū)序列長(zhǎng)度在6至12bp之間。本方案進(jìn)一步保證了錨定引物與待測(cè)snp位點(diǎn)附近的目標(biāo)位置結(jié)合的特異性。更優(yōu)選的，所述第一互補(bǔ)區(qū)序列長(zhǎng)度在7至10bp之間。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述第一歸一化區(qū)的長(zhǎng)度在8至14bp之間。本方案保證了針對(duì)不同待測(cè)snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)的錨定引物與目標(biāo)位置的結(jié)合效率的一致性。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出第三典型實(shí)施例，一種試劑盒，包括上述的任一種引物組。

本方案中的試劑盒可為擴(kuò)增試劑盒、文庫(kù)構(gòu)建試劑盒或測(cè)序試劑盒。當(dāng)所述試劑盒為擴(kuò)增試劑盒時(shí)，其還可包括pcr擴(kuò)增所需的其他試劑；當(dāng)所述試劑盒為文庫(kù)構(gòu)建試劑盒時(shí)，其還可包括文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中所需的其他試劑，也可包括pcr擴(kuò)增所需的試劑；當(dāng)所述試劑盒為測(cè)序試劑盒時(shí)，其可包括測(cè)序過(guò)程中所需的其他試劑，也可包括pcr擴(kuò)增所需的試劑，也可包括文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中所需的試劑。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒還包括上述的任一種錨定引物。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出第四典型實(shí)施例，一種試劑盒，包括上述的任一種錨定引物。

本方案中的試劑盒一般為測(cè)序試劑盒，其可包括測(cè)序過(guò)程中所需的其他試劑，也可包括pcr擴(kuò)增所需的試劑，也可包括文庫(kù)構(gòu)建過(guò)程中所需的試劑。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒還包括上述的任一種引物組。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出第五典型實(shí)施例，一種文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟：

a、利用上述的任一種引物組，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；

b、將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物與接頭連接，形成待測(cè)序文庫(kù)分子。

需要說(shuō)明的是，本方案中的待測(cè)序文庫(kù)分子是基于上述的任一種引物組對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增后所得的擴(kuò)增產(chǎn)物獲得的，因此，在待測(cè)snp位點(diǎn)附近增加了一個(gè)含第一通用區(qū)的序列。所述第一通用區(qū)不與第二序列互補(bǔ)，無(wú)重復(fù)序列，自身不會(huì)形成發(fā)夾。因此能夠有效簡(jiǎn)化待測(cè)snp位點(diǎn)附近的序列結(jié)構(gòu)，降低錨定引物的設(shè)計(jì)難度，尤其適用于待測(cè)樣本中的模板分子上的待測(cè)snp位點(diǎn)附近序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜的待測(cè)樣本，避免因?yàn)榇郎y(cè)snp位點(diǎn)附近序列的特殊性而導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確或測(cè)序失敗現(xiàn)象的出現(xiàn)，適用于各類(lèi)型待測(cè)snp位點(diǎn)的檢測(cè)。針對(duì)不同的待測(cè)snp位點(diǎn)，該第一通用區(qū)序列可相同。

另外，對(duì)于步驟b中，含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物與接頭的連接，以下將從多個(gè)方面進(jìn)行進(jìn)一步闡述。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物中僅有一端與接頭連接，進(jìn)而形成待測(cè)序文庫(kù)分子。該連接端可為含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的任一端。

在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的兩端均與接頭連接，進(jìn)而形成待測(cè)序文庫(kù)分子。

需要說(shuō)明的是，兩端連接的接頭的序列可相同或不同。

優(yōu)選的，兩端連接的接頭的序列不同，這樣可基于這兩個(gè)不同的接頭對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，驗(yàn)證庫(kù)分子結(jié)構(gòu)是否正確，也可基于這兩個(gè)不同的接頭對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行單分子擴(kuò)增，然后對(duì)單分子擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行第二代高通量基因測(cè)序，從而獲得待測(cè)snp位點(diǎn)的序列信息。

基于上述任一種實(shí)施例，本發(fā)明提出另一實(shí)施例，所述步驟b為：

將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與接頭連接，形成待測(cè)序文庫(kù)分子，并通過(guò)微球可尋址的固定在固相載體上。

本方案中，含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與接頭連接，可有效減少實(shí)驗(yàn)步驟，提高實(shí)驗(yàn)效率。

需要說(shuō)明的是所述步驟b可有多種實(shí)施方案，以下將通過(guò)多個(gè)實(shí)施例來(lái)進(jìn)行說(shuō)明。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟b包括以下步驟：

b1、將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與固定在微球上的接頭連接，形成固定在微球上的待測(cè)序文庫(kù)分子；

b2、將步驟b1所得微球可尋址的固定在固相載體上。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟b包括以下步驟：

b1、將將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與接頭連接，然后將連接產(chǎn)物固定在微球上，得固定在微球上的待測(cè)序文庫(kù)分子；

b2、將步驟b1所得微球可尋址的固定在固相載體上。

需要說(shuō)明的是，在上述兩個(gè)實(shí)施例中，所述接頭上含有修飾標(biāo)記，用于使其固定在微球上。所述修飾標(biāo)記可為生物素、親和素、鏈霉親和素、抗原、抗體、受體、配體、多聚組氨酸、納米金、碘乙酰、巰基、氨基、醛基、羧基、異硫氰基、硅烷基或丙烯酰胺，它們均能特異性的與相對(duì)應(yīng)的基團(tuán)或分子結(jié)合。

所述可尋址的固定，是指能夠確定位置信息的固定。即，固定載體上每一具體位置上所固定的待測(cè)序文庫(kù)分子與其它具體位置上所固定的待測(cè)序文庫(kù)分子是能夠明確區(qū)分的。

上述實(shí)施例中，所述接頭可采用多種形式，包括但不限于平末端接頭、突出末端接頭、分叉接頭或含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭。

所述平末端接頭是指雙鏈之間完全互補(bǔ)配對(duì)的雙鏈核酸接頭。優(yōu)選的，所述平末端接頭的兩條鏈的5’末端均不含磷酸基團(tuán)，其可避免連接過(guò)程中接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，減少對(duì)后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的干擾，提高基因檢測(cè)的準(zhǔn)確率。

所述突出末端接頭，是指雙鏈核酸分子中的至少一端帶有突出核苷酸序列，而其余核苷酸則完全互補(bǔ)的雙鏈核酸接頭。突出末端接頭可為單突出末端，也可以是含有兩個(gè)突出末端的雙突出末端，這兩個(gè)突出末端可在一條核苷酸鏈上或在不同的核苷酸鏈上。所述突出末端接頭能夠避免連接過(guò)程中接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，減少對(duì)后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的干擾，提高基因檢測(cè)的準(zhǔn)確率。在本實(shí)施例的具體實(shí)施方式中，所述接頭優(yōu)選為單突出末端接頭，且該突出末端為其所在鏈的3’末端，堿基為t；該接頭能夠與通過(guò)taq酶擴(kuò)增的含a尾的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接，提高連接效率。

所述分叉型接頭包括互補(bǔ)區(qū)和分叉區(qū)，互補(bǔ)區(qū)雙鏈的核苷酸互補(bǔ)配對(duì)，配對(duì)的核苷酸對(duì)數(shù)不限。互補(bǔ)區(qū)末端可為平末端或突出末端。所述分叉型接頭能夠避免連接過(guò)程中接頭自連現(xiàn)象的出現(xiàn)，減少對(duì)后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的干擾，提高snp分型檢測(cè)的準(zhǔn)確率。在本實(shí)施例的具體實(shí)施方式中，所述接頭優(yōu)選為互補(bǔ)區(qū)的3’末端為突出末端，且突出末端最后一個(gè)堿基為t的t末端分叉接頭；該接頭能夠與通過(guò)taq酶擴(kuò)增的含a尾的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接，提高連接效率。

所述帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭，有多種實(shí)施方案。在一實(shí)施例中，該接頭為單鏈核酸分子，該單鏈核酸分子依次包括第一互補(bǔ)配對(duì)區(qū)、莖環(huán)區(qū)和第二互補(bǔ)配對(duì)區(qū)，第一互補(bǔ)配對(duì)區(qū)能夠與第二互補(bǔ)配對(duì)區(qū)完全互補(bǔ)配對(duì)。在另一實(shí)施例中，帶莖環(huán)結(jié)構(gòu)的接頭還可帶有突出末端，該突出末端可位于單鏈核酸分子的3’端。突出末端4的存在能夠防止接頭自連現(xiàn)象的發(fā)生，減少對(duì)后續(xù)測(cè)序?qū)嶒?yàn)的干擾，提高snp分型檢測(cè)的準(zhǔn)確率。該突出末端優(yōu)選為t；該接頭能夠與通過(guò)taq酶擴(kuò)增的含a尾的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物直接連接，提高連接效率。

上述兩個(gè)實(shí)施例中，接頭被預(yù)先固定在微球上的實(shí)施例減少了連接產(chǎn)物與微球連接的步驟，實(shí)驗(yàn)效率更高。

因?yàn)楣潭ㄓ薪宇^的微球的密度可能會(huì)與步驟b反應(yīng)體系中的其他成分的密度不同，所以，在連接過(guò)程中，使整個(gè)反應(yīng)體系周期性震蕩，可有效提高固定在微球上的接頭與步驟a所得擴(kuò)增產(chǎn)物的連接效率，避免反應(yīng)體系中各成分分層而引起的連接效率低現(xiàn)象的出現(xiàn)。

另外，在本發(fā)明中，因?yàn)椴襟Ea所得的含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物直接與步驟b中的接頭連接，即不經(jīng)純化，直接進(jìn)行連接反應(yīng)，這使得反應(yīng)體系較大，dna分子濃度較低，連接效率不高。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，在所述步驟b的反應(yīng)體系中加入peg。

因?yàn)閜eg既能夠提高反應(yīng)體系中發(fā)生反應(yīng)的分子的有效密度，提高接頭與相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物之間接觸的概率；又能提高反應(yīng)體系的密度，防止固定有接頭的微球沉降；本方案從兩個(gè)方面有效提高了固定在微球上的接頭與相應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的連接效率。本方案中，peg的具體濃度可根據(jù)所述步驟b中微球的密度和原反應(yīng)體系的密度來(lái)計(jì)算，以使微球的密度與加入peg后的反應(yīng)體系的密度基本相同為宜。

基于上述實(shí)施例，本發(fā)明又提出一實(shí)施例，所述步驟b1中的連接反應(yīng)是在切割-連接反應(yīng)體系中進(jìn)行的，所述切割-連接反應(yīng)體系包括：連接酶、斷裂劑、固定在微球上的第一接頭和連接緩沖液；所述第一通用區(qū)中含有可斷裂位點(diǎn)；所述可斷裂位點(diǎn)能被切割劑特異性切割，使得基于第一引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物形成第一粘性末端；所述第一接頭為核酸分子，含有與第一粘性末端完全互補(bǔ)配對(duì)的第二粘性末端。

本方案中，基于第一通用區(qū)中的可斷裂位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物被斷裂劑切出第一粘性末端后，可與含有第二粘性末端的第一接頭直接連接，提高連接效率。

優(yōu)選的，所述可斷裂位點(diǎn)為核糖核苷酸、rna序列或限制性?xún)?nèi)切酶酶切位點(diǎn)。相應(yīng)的，所述斷裂劑為rnaseh、rnaseh或限制性?xún)?nèi)切酶。

當(dāng)所述可斷裂位點(diǎn)為u時(shí)，所述斷裂劑優(yōu)選為user酶。

為了更好的實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出第六典型實(shí)施例，一種基因測(cè)序方法，包括以下步驟：

a、利用上述任一種引物組，對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物；

b、將含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物與接頭連接，形成待測(cè)序文庫(kù)分子；

c、利用上述任一種錨定引物，對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行測(cè)序，獲得待測(cè)snp位點(diǎn)的序列信息。

需要說(shuō)明的是，上述步驟a、b為文庫(kù)構(gòu)建步驟，其可采用上述的任一種文庫(kù)構(gòu)建方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。以下主要通過(guò)對(duì)步驟c進(jìn)行進(jìn)一步闡述說(shuō)明。步驟c中的測(cè)序方法可為連接測(cè)序法也可為合成測(cè)序法。

本方案在測(cè)序過(guò)程中，錨定引物能準(zhǔn)確錨定在目標(biāo)位置上，避免因?yàn)榇郎y(cè)snp位點(diǎn)附近序列的特殊性而導(dǎo)致的測(cè)序結(jié)果不準(zhǔn)確或測(cè)序失敗現(xiàn)象的出現(xiàn)，又使得各錨定引物與目標(biāo)位置結(jié)合情況更為一致、歸一化，減小因?yàn)楦麇^定引物與目標(biāo)位置結(jié)合情況的差異，從而減小各待測(cè)snp位點(diǎn)檢測(cè)信號(hào)的差異，提高測(cè)序的準(zhǔn)確性。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟c中的測(cè)序方法為連接測(cè)序法，所述步驟b、c之間還包括步驟d，采用權(quán)利要求7至11中的任一種錨定引物，利用無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針替換有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行一次連接測(cè)序反應(yīng)。

需要說(shuō)明的是，所述無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與連接測(cè)序技術(shù)中所使用的有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針相比，序列完全相同，差別僅在于有無(wú)熒光標(biāo)記；即，所述無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針序列為（n-n-n……-n）n，所述n為a、g、c或t，n為正整數(shù)。

每一次連接測(cè)序反應(yīng)均包括以下步驟：錨定引物錨定，沖洗（除去多余的未錨定引物），探針連接，沖洗（除去多余探針、連接酶等），采圖（獲得探針上熒光標(biāo)記所對(duì)應(yīng)位置的序列信息），變性洗脫連接產(chǎn)物（以便下一次連接測(cè)序反應(yīng)中錨定引物的錨定）。步驟c中的連接測(cè)序反應(yīng)，因?yàn)槭褂玫氖菬o(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，因此可不進(jìn)行采圖步驟，以減少實(shí)驗(yàn)步驟，提高實(shí)驗(yàn)效率。當(dāng)然，如果進(jìn)行采圖步驟，可驗(yàn)證該次使用的熒光探針是否是無(wú)熒光標(biāo)記的，起到一個(gè)再次確認(rèn)的效果。

雖然，從理論上來(lái)說(shuō)，步驟d中錨定引物與無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸案子會(huì)被洗脫去除，無(wú)法起到封閉的作用，但是，本申請(qǐng)發(fā)明人在具體實(shí)驗(yàn)中對(duì)比發(fā)現(xiàn)，在連接測(cè)序前，增加一個(gè)使用無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針替換有熒光標(biāo)記的探針進(jìn)行一次連接測(cè)序反應(yīng)的步驟，有效的減少在后續(xù)的連接測(cè)序中出現(xiàn)的錯(cuò)誤信號(hào)，從而減少由測(cè)序初始結(jié)果到最終的序列信息的分析過(guò)程中的干擾信號(hào)，提高snp位點(diǎn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。具體原因可能是非錨定引物的目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)和/或非探針的目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)過(guò)步驟d后被封閉，使得在后續(xù)的連接測(cè)序?qū)嶒?yàn)中，錨定引物和/或探針能夠更多更準(zhǔn)確的結(jié)合在目標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)上，從而減少了錯(cuò)誤信號(hào)的產(chǎn)生，從而提高基因檢測(cè)過(guò)程中正確信號(hào)的比例，提高了對(duì)snp位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

優(yōu)選的，所述n在6-10之間；更優(yōu)選在7-9之間。

更優(yōu)選的，所述無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針與步驟d中的有熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針序列完全相同，差別僅在于有無(wú)熒光標(biāo)記。本方案可有效降低無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)難度。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所述步驟d包括以下步驟：

d1、將所述錨定引物錨定在待測(cè)序文庫(kù)分子上；

d2、加入無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針、連接酶以及相應(yīng)的緩沖液，進(jìn)行連接反應(yīng)；

d3、變性去除連接產(chǎn)物。

對(duì)于步驟d3中變性去除連接產(chǎn)物需要說(shuō)明的是，步驟d3所述連接產(chǎn)物為錨定引物與無(wú)熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針的連接產(chǎn)物，為單鏈核酸分子，可與待測(cè)序文庫(kù)分子互補(bǔ)配對(duì)。所述變性既可以通過(guò)物理的方法實(shí)現(xiàn)，例如提高雙鏈核酸分子（待測(cè)序文庫(kù)分子與連接產(chǎn)物）所處的溫度，也可以通過(guò)化學(xué)的方法實(shí)現(xiàn)，例如改變雙鏈核酸分子（待測(cè)序文庫(kù)分子與連接產(chǎn)物）所處的ph值。其中，采用化學(xué)方法，只需加入酸性或堿性的試劑即可，無(wú)需額外的加熱部件，能夠更簡(jiǎn)單有效的實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。

優(yōu)選的，所述步驟d3為：用0.05m-0.15mnaoh沖洗。

針對(duì)上述各技術(shù)方案，為進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明所記載技術(shù)方案的技術(shù)效果及優(yōu)越性，本發(fā)明給出下述具體實(shí)施例。

在第一具體實(shí)施例中，以10個(gè)正常人的血液基因組dna為模板，同時(shí)檢測(cè)cyp2c9基因*2（rs1799853）位點(diǎn)、aldh2基因rs671位點(diǎn)、adrb1基因rs1801253位點(diǎn)。

針對(duì)這些位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)外引物。具體如下所述：

rs1799853內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：1和seqidno：2；rs1799853外引物對(duì)為：seqidno：3和seqidno：4；rs671內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：5和seqidno：6；rs671外引物對(duì)為：seqidno：7和seqidno：8；rs1801253內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：9和seqidno：10；rs1801253外引物對(duì)為：seqidno：11和seqidno：12。

一、含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得。

1、第一次pcr擴(kuò)增

以血液基因組dna為模板，利用上述的外引物對(duì)，分別對(duì)各snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：f引物（10μm），0.4μl；r引物（10μm），0.4μl；dntp（各2.5mm），2μl；血液基因組dna，50ng；extaq（5u/μl），0.1μl；10×extaqbuffer，2μl；ddh2o加至20μl。

pcr反應(yīng)條件如下：94℃5min；94℃20s，57℃20s，72℃25s；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃3min。

所得產(chǎn)物即為第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

2、第二次pcr擴(kuò)增

以第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用上述的內(nèi)引物對(duì)，分別對(duì)各snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：f引物（10μm），0.4μl；r引物（10μm），0.4μl；dntp（各2.5mm），2μl；第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，0.2μl；extaq（5u/μl），0.1μl；10×extaqbuffer，2μl；ddh2o加至20μl。

pcr反應(yīng)條件如下：95℃5min；94℃20s，40℃20s，57℃25s；重復(fù)5個(gè)循環(huán)；94℃20s，57℃20s，72℃25s；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃3min。

所得產(chǎn)物即為第二次擴(kuò)增產(chǎn)物。

第二次擴(kuò)增完成后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有樣本的第二次擴(kuò)增產(chǎn)物中均含有目標(biāo)分子，且凝膠電泳圖顯示無(wú)雜帶，條帶單一；說(shuō)明第二次pcr擴(kuò)增成功獲得了所需的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

二、待測(cè)序文庫(kù)分子的構(gòu)建。

1、將第一接頭固定在微球上。

為了在同時(shí)檢測(cè)過(guò)程中能夠區(qū)分不同的樣本來(lái)源，本具體實(shí)施例在第一接頭上設(shè)計(jì)了標(biāo)簽序列，第一接頭的基本結(jié)構(gòu)如圖4所示（seqidno：13、seqidno：14），該接頭中的nnnn為標(biāo)簽序列，標(biāo)簽序列與樣本來(lái)源和snp位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)關(guān)系如圖5所示。

將上述各第一接頭分別與帶有鏈霉親和素修飾的myone磁珠（invitrogen）結(jié)合，使得上述各第一接頭被分別固定在磁珠表面，反應(yīng)體系及反應(yīng)過(guò)程為：將200ng第一接頭與4μl（約4×10⁷個(gè)磁珠）myone磁珠螺旋振蕩混勻，反應(yīng)30min，以適量te緩沖液（10mmtris-hcl，ph8.0；1mmedta）清洗兩次，離心分離，將得到的磁珠以4μl結(jié)合緩沖液（10mmtris-hcl，ph7.5；1mmedta；1mnacl；0.01%tritonx-100）重懸保存，得固定有第一接頭的磁珠。

2、第二次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物與固定在磁珠上的第一接頭的連接。

按按表2中的對(duì)應(yīng)關(guān)系分別配置下述反應(yīng)體系：步驟一所得擴(kuò)增產(chǎn)物20μl；user酶（1u/μl，neb，cat#m5505s），10μl；緩沖液，8μl；t4dna連接酶，2μl；固定有第一接頭的磁珠，0.4μl；加ddh2o至40μl。

其中，所述緩沖液為含400mmtris、100mmmgcl2、100mmdtt、5mmatp、25%peg6000，ph值7.8的溶液。

25℃反應(yīng)20分鐘，得連接產(chǎn)物，即待測(cè)序文庫(kù)分子。

反應(yīng)結(jié)束后，將30管連接產(chǎn)物合并成1管，2500g離心3min，磁鐵吸附磁珠，去上清，用50μlte洗滌二次，并最終懸浮于50μlte中，從而將待測(cè)序文庫(kù)分子固定在磁珠上。

3、固定在磁珠上的待測(cè)序文庫(kù)分子的可尋址固定。

將步驟2所得產(chǎn)物點(diǎn)樣至異硫氰基修飾的載樣片（玻片），于37℃固定1h，即完成固定在磁珠上的待測(cè)序文庫(kù)分子的可尋址固定。

三、測(cè)序。

對(duì)步驟二所得的固定在固相載體上的待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行測(cè)序。

在本具體實(shí)施例中采用深圳華因康基因科技有限公司的高通量基因測(cè)序儀pstariia測(cè)序儀，并采用連接測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序過(guò)程中，

針對(duì)rs1799853位點(diǎn)，所使用的錨定引物為seqidno：15；針對(duì)rs671位點(diǎn)，所使用的錨定引物為seqidno：16；針對(duì)rs1801253位點(diǎn)，所使用的錨定引物為seqidno：17。

另外，為了區(qū)分不同的樣本來(lái)源，還需對(duì)第一接頭上的標(biāo)簽序列進(jìn)行檢測(cè)，用于檢測(cè)標(biāo)簽序列的錨定引物為seqidno：18。

需要說(shuō)明的是，seqidno：15-18的的5’端均被磷酸化修飾。

整體的測(cè)序順序如圖6所示。其中，待測(cè)snp位點(diǎn)anchor混合物為seqidno：15-17這3種錨定引物按相同摩爾數(shù)混合所得的混合物。其中，base1用于封閉錨定引物或探針與待測(cè)序文庫(kù)分子上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，base2用于檢測(cè)待測(cè)snp位點(diǎn)，base3-6用于檢測(cè)標(biāo)簽序列。

另外，本實(shí)施例做了第一對(duì)比實(shí)驗(yàn)，同樣步驟二所得產(chǎn)物，以圖7中的測(cè)序順序進(jìn)行測(cè)序。即，未進(jìn)行圖6中的base1。

圖8示出了上述具體實(shí)施例中樣本2的待測(cè)snp位點(diǎn)——rs1799853、rs671、rs1801253在實(shí)驗(yàn)組和第一對(duì)比組中的初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，r=a/g，y=c/t，m=a/c，k=g/t，s=c/g，w=a/t，h=a/c/t，b=c/g/t，v=a/c/g，d=a/g/t,n=a/c/g/t；n表示信號(hào)太弱，無(wú)法判斷是a、c、g和t中的哪一個(gè)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，相同樣本在實(shí)驗(yàn)組和第一對(duì)比組中占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型均相同，但是它們的占比有明顯區(qū)別；實(shí)驗(yàn)組中占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型檢出數(shù)均在95%以上，而第一對(duì)比組中占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型檢出數(shù)基本在85%左右。

另外，本發(fā)明人還將第二次擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)sanger測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證，作為第二對(duì)比實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，上述實(shí)驗(yàn)組和第一對(duì)比組中占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型均與sanger測(cè)序結(jié)果完全一致。

為了證明本發(fā)明的引物組、錨定引物的技術(shù)效果，本實(shí)驗(yàn)發(fā)明人還做了第三對(duì)比實(shí)驗(yàn)，同樣以上述具體實(shí)施例中的正常人的血液基因組dna為模板，同時(shí)檢測(cè)cyp2c9基因*2（rs1799853）位點(diǎn)、aldh2基因rs671位點(diǎn)、adrb1基因rs1801253位點(diǎn)。

針對(duì)這些位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)了一對(duì)內(nèi)引物和一對(duì)外引物。具體如下所述：

rs1799853內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：19和seqidno：20；rs1799853外引物對(duì)為：seqidno：3和seqidno：4；rs671內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：21和seqidno：22；rs671外引物對(duì)為：seqidno：7和seqidno：8；rs1801253內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：23和seqidno：24；rs1801253外引物對(duì)為：seqidno：11和seqidno：12。

一、含待測(cè)snp位點(diǎn)的擴(kuò)增產(chǎn)物的獲得。

1、第一次pcr擴(kuò)增。

以血液基因組dna為模板，利用上述的外引物對(duì)，分別對(duì)各snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：f引物（10μm），0.4μl；r引物（10μm），0.4μl；dntp（各2.5mm），2μl；血液基因組dna，50ng；extaq（5u/μl），0.1μl；10×extaqbuffer，2μl；ddh2o加至20μl。

pcr反應(yīng)條件如下：94℃5min；94℃20s，57℃20s，72℃25s；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃3min。

所得產(chǎn)物即為第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

2、第二次pcr擴(kuò)增。

以第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用上述的內(nèi)引物對(duì)，分別對(duì)各snp位點(diǎn)所在序列進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：f引物（10μm），0.4μl；r引物（10μm），0.4μl；dntp（各2.5mm），2μl；第一次pcr擴(kuò)增產(chǎn)物，0.2μl；extaq（5u/μl），0.1μl；10×extaqbuffer，2μl；ddh2o加至20μl。

pcr反應(yīng)條件如下：95℃3min；94℃20s，57℃20s，72℃30s；重復(fù)30個(gè)循環(huán)；72℃3min。

所得產(chǎn)物即為第二次擴(kuò)增產(chǎn)物。

第二次擴(kuò)增完成后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所有樣本的第二次擴(kuò)增產(chǎn)物中均含有目標(biāo)分子，且凝膠電泳圖顯示無(wú)雜帶，條帶單一；說(shuō)明第二次pcr擴(kuò)增成功獲得了所需的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物。

二、待測(cè)序文庫(kù)分子的構(gòu)建。

采用上一具體實(shí)施例相同的方法構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)并將待測(cè)序文庫(kù)分子可尋址固定。

三、測(cè)序。

對(duì)步驟二所得的固定在固相載體上的待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行測(cè)序。

在第三對(duì)比實(shí)驗(yàn)中同樣采用深圳華因康基因科技有限公司的高通量基因測(cè)序儀pstariia測(cè)序儀，并采用連接測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序過(guò)程中，針對(duì)rs1799853位點(diǎn)，所使用的錨定引物為seqidno：25；針對(duì)rs671位點(diǎn)，所使用的錨定引物為seqidno：26；針對(duì)rs1801253位點(diǎn)，所使用的錨定引物為seqidno：27。

另外，為了區(qū)分不同的樣本來(lái)源，還需對(duì)第一接頭上的標(biāo)簽序列進(jìn)行檢測(cè)，用于檢測(cè)標(biāo)簽序列的錨定引物為seqidno：18。

需要說(shuō)明的是，seqidno：18、25-27的5’端均被磷酸化修飾。

然后參考上一具體實(shí)施例中的方法，更換錨定引物后，按照?qǐng)D6的順序進(jìn)行測(cè)序；另外，同樣以本具體實(shí)施例步驟二所得產(chǎn)物，更換錨定引物后，按照?qǐng)D7的順序進(jìn)行測(cè)序，作為對(duì)照。

其中，rs671和rs1801253位點(diǎn)的測(cè)序采圖結(jié)果如圖9（實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組）所示，由圖9可知，這兩個(gè)位點(diǎn)在兩次測(cè)序過(guò)程中均無(wú)熒光發(fā)生，測(cè)序失??；這與上一具體實(shí)施例中rs671和rs1801253的測(cè)序采圖結(jié)果（圖10實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組）存在明顯區(qū)別。而rs1799853位點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組測(cè)序采圖結(jié)果如圖11所示，與上一具體實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)組rs1799853位點(diǎn)的測(cè)序采圖結(jié)果（圖12）相比，同樣存在明顯區(qū)別，熒光信號(hào)明顯較弱。rs1799853位點(diǎn)的對(duì)照組測(cè)序采圖結(jié)果與上一具體實(shí)施例中對(duì)照組的測(cè)序采圖結(jié)果，與實(shí)驗(yàn)組類(lèi)似，熒光信號(hào)明顯較弱。

經(jīng)本發(fā)明人分析，rs671和rs1801253位點(diǎn)的在本具體實(shí)施例中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均測(cè)序失敗的原因可能是：rs671和rs1801253這兩個(gè)位點(diǎn)附近的序列中存在復(fù)雜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致錨定引物無(wú)法錨定，進(jìn)而無(wú)法實(shí)現(xiàn)錨定引物與探針的連接，所以采圖時(shí)無(wú)信號(hào)。

而rs1799853位點(diǎn)在本具體實(shí)施例中實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的測(cè)序采圖結(jié)果分別與上一具體實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的測(cè)序采圖結(jié)果相比，熒光信號(hào)都明顯較弱。原因可能是本具體實(shí)施例中，錨定引物與待測(cè)序文庫(kù)分子的結(jié)合效果，較上一具體實(shí)施例差。

在本發(fā)明的第二具體實(shí)施例中，直接用上述實(shí)施例中的rs1799853內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：1和seqidno：2；rs671內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：5和seqidno：6；rs1801253內(nèi)引物對(duì)為：seqidno：9和seqidno：10。對(duì)上述樣本1-10進(jìn)行pcr擴(kuò)增，然后進(jìn)行后續(xù)的步驟二、三，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果和第一具體實(shí)施例結(jié)果基本一致，實(shí)驗(yàn)組中占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型檢出數(shù)均在93%以上，而對(duì)照組中占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型檢出數(shù)基本在80%左右。整體來(lái)說(shuō)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的檢出數(shù)和檢出總數(shù)均較上一實(shí)施例低，且無(wú)論是在實(shí)驗(yàn)組還是在對(duì)照組中，占比最高的snp位點(diǎn)序列類(lèi)型檢出數(shù)所占比例有所降低。

需要說(shuō)明的是，上述具體實(shí)施例中，所述使用的引物中，可斷裂位點(diǎn)均為u，且均設(shè)計(jì)在上游引物上，斷裂序列（與第一粘性末端對(duì)應(yīng)）為cggu。當(dāng)然，也可將可斷裂位點(diǎn)設(shè)計(jì)在下游引物上。所述斷裂序列可根據(jù)需要進(jìn)行設(shè)計(jì)，只要能滿(mǎn)足后續(xù)的連接實(shí)驗(yàn)的要求即可，例如：gccu、aaau、cgcu、gcccu、cggcu、ttttu等。隨著所述斷裂序列的改變，所述第一接頭的相關(guān)序列需進(jìn)行相關(guān)調(diào)整。

另外，上述具體實(shí)施例中，測(cè)序文庫(kù)分子構(gòu)建完成后，均未采用單分子擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行擴(kuò)增，而是直接進(jìn)入到后續(xù)的測(cè)序步驟，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟。當(dāng)然，本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)單分子擴(kuò)增技術(shù)對(duì)待測(cè)序文庫(kù)分子進(jìn)行擴(kuò)增后再進(jìn)行測(cè)序，所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本相同。相對(duì)來(lái)說(shuō)，測(cè)序采圖所得信號(hào)會(huì)更高一點(diǎn)。

以上，本發(fā)明的方法能夠高效的同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品的多個(gè)snp位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，并得到準(zhǔn)確可信的結(jié)果，并且能夠有效的降低連接測(cè)序所得結(jié)果中的錯(cuò)誤信號(hào)，提高snp位點(diǎn)檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

應(yīng)當(dāng)說(shuō)明的是，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>盛司潼

<120>引物組、錨定引物、試劑盒、文庫(kù)構(gòu)建及基因測(cè)序方法

<130>

<160>27

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

cgguctcagcctcccaagttgaggac26

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

gtgagaaacagcacacaagtt21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

agcttcctctttcttgcctg20

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

tgagctaacaaccaggactca21

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

cgguctcagcctcccaagcatacact26

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

gtgagaaacagcattttcact21

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

aacccataacccccaagagt20

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

cagcaggtcctgaacttccag21

<210>9

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

cgguctcagcctcccaagccttccag26

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gtgagaaacagcaagagcagt21

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

tctgctggctgcccttcttcct22

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

acgacatcgtcgtcgtcgtcgt22

<210>13

<211>50

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(23)..(26)

<223>nisa,c,g,ort

<400>13

cctccctgcagtctctatgggcnnnnctgctagtcgctgaagtagtcggt50

<210>14

<211>42

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

ctacttcagcgactagcagacgtgcccatagagactgcaggg42

<210>15

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

gtcctcaacttgggagg17

<210>16

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

agtgtatgcttgggagg17

<210>17

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>17

ctggaaggcttgggagg17

<210>18

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>18

gcccatagagactgcag17

<210>19

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

cgguctcatgacgctgcggaat22

<210>20

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

gatatggagtagggtcacc19

<210>21

<211>26

<212>dna

<213>人工序列

<400>21

cgguactgctatgatgtgtttggagc26

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

agcaggtcccacactcacag20

<210>23

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

cggugtgcccgaccgcctcttc22

<210>24

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>24

gtctccgtgggtcgcgtg18

<210>25

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>25

gtcctcaatgctcctct17

<210>26

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>26

agtgtatgcctgcagcc17

<210>27

<211>17

<212>dna

<213>人工序列

<400>27

ctggaaggccttgcgga17