本發(fā)明屬于酶工程領(lǐng)域，具體涉及脂肪酶固定化載體、固定化脂肪酶及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：脂肪酶是一種工業(yè)中常用的生物催化劑，廣泛存在于動植物和微生物體內(nèi)。脂肪酶按其底物特異性可分為五類：(1)無特異性脂肪酶；(2)脂肪酸特異性脂肪酶；(3)位置特異性脂肪酶；(4)立體特異性脂肪酶；(5)底物特異性脂肪酶。具有位置特異性的脂肪酶優(yōu)先催化甘油三酯的sn-1和sn-3位，因此也被稱為sn-1,3專一性脂肪酶。cn1806044b描述了一種sn-1,3專一性脂肪酶粉末的制備方法，該方法通過噴霧干燥得到固定化酶，酶液在噴霧干燥前需要經(jīng)過超濾處理并調(diào)節(jié)ph值，制備過程復(fù)雜。經(jīng)噴霧干燥后還需用油脂浸漬或浸潤才能得到最終的固定化酶產(chǎn)品，對資源也造成極大的浪費(fèi)，提高了生產(chǎn)成本。cn103468668a描述了一種疏綿狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的固定化方法，該脂肪酶為sn-1,3專一性脂肪酶。該固定化方法的特點(diǎn)是利用白炭黑作為脂肪酶固定化的載體，但固定過程中需要用到蛋白交聯(lián)劑，過程較復(fù)雜且引入了化學(xué)試劑。并且通過該方法固定后，脂肪酶原有的sn-1,3專一性喪失。對脂肪酶的固定化不僅要考慮其固定化酶的活力大小，也要考慮其專一性的大小。目前市售的專一性(尤其是sn-1,3專一性)固定化脂肪酶品種少、價格昂貴。因此，需要一種價格低廉、酶活高并且專一性高的固定化專一性脂肪酶。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明利用種子加工過程中的副產(chǎn)品種子殘渣及價格非常低廉的粉末吸 附劑混合作為脂肪酶的載體，不僅提高了副產(chǎn)物的利用價值，并且能夠降低固定化脂肪酶的成本。所制備的固定化脂肪酶具有很高的活力和較高的專一性，尤其是sn-1,3專一性。具體而言，本發(fā)明提供一種顯著增加脂肪酶活性及選擇性的固定化脂肪酶的載體。同時，本發(fā)明也提供一種固定化脂肪酶，該固定化脂肪酶使用種子殘渣和粉末吸附劑作為載體。在某些實(shí)施方案中，所述固定化脂肪酶含有種子殘渣、粉末吸附劑和脂肪酶。在某些實(shí)施方案中，以固定化脂肪酶的重量計，所述粉末吸附劑以10％～70％的量存在，優(yōu)選以20％～50％的量存在。在某些實(shí)施方案中，以固定化脂肪酶的重量計，所述種子殘渣(干基)以20％～80％的量存在，優(yōu)選以40％～70％的量存在。在某些實(shí)施方案中，固定化脂肪酶可含有水分，以固定化脂肪酶的重量計，所述水分以3％～25％的量存在，優(yōu)選以7％～15％的量存在。在某些實(shí)施方案中，以固定化脂肪酶的重量計，所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，優(yōu)選以0.7％～2％的量存在。在某些實(shí)施方案中，以干物質(zhì)重量計，種子殘渣與粉末吸附劑的比例為1:10～10:1，優(yōu)選為1:5～6:1，更優(yōu)選為1:3～6:1，更優(yōu)選為1:2.2～5.5:1。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶為來自動物、植物或微生物的脂肪酶。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶固定化后表現(xiàn)出sn-1,3專一性。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶選自但不限于：豬胰脂肪酶；來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、米根霉(rhizopusoryzae)、南極假絲酵母(candidaantarctica)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiasp.)、皺褶假絲酵母(candidarugosa)和根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物；優(yōu)選為sn-1,3專一性脂肪酶，選自豬胰脂肪酶、疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根 毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣為植物種子粉碎、磨漿或榨油過程中的產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣選自但不限于橄欖果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕櫚仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻殘渣。在某些實(shí)施方案中，所述粉末吸附劑選自但不限于二氧化硅基粉末吸附劑和活性炭，優(yōu)選選自白炭黑、硅藻土、硅膠、活性炭、白土、沸石粉和硅酸鎂。本發(fā)明還涉及所述固定化脂肪酶的制備及其應(yīng)用。本發(fā)明制備所述固定化脂肪酶的方法包括將脂肪酶與種子殘渣和粉末吸附劑混合、分離出固體以及干燥所述固體的步驟。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括以下步驟：(1)將種子殘渣與粉末吸附劑按一定的比例混合；(2)將步驟(1)獲得的混合物與脂肪酶混合；(3)從步驟(2)獲得的混合物中分離出固體；和(4)將步驟(3)分離得到的固體干燥，得到所述固定化脂肪酶。在某些實(shí)施方案中，種子殘渣與粉末吸附劑的重量比為1:10～10:1，優(yōu)選為1:5～6:1，更優(yōu)選為1:3～6:1，更優(yōu)選為1:2.2～5.5:1。在某些實(shí)施方案中，步驟(1)中粉末吸附劑的用量足以使最終獲得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量計，所述粉末吸附劑以10％～70％的量存在，優(yōu)選以20％～50％的量存在。在某些實(shí)施方案中，步驟(1)中種子殘渣的用量足以使最終獲得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量計，所述種子殘渣(干基)以20％～80％的量存在，優(yōu)選以40％～70％的量存在。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣為植物種子粉碎、磨漿或榨油過程中的產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣選自但不限于橄欖果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕櫚仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻殘渣。在某些實(shí)施方案中，所述粉末吸附劑選自但不限于二氧化硅基粉末吸附劑 和活性炭，優(yōu)選選自：白炭黑、硅藻土、硅膠、活性炭、白土、沸石粉和硅酸鎂。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶為來自動物、植物或微生物的脂肪酶。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶固定化后表現(xiàn)出sn-1,3專一性。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶選自但不限于：豬胰脂肪酶；來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、米根霉(rhizopusoryzae)、南極假絲酵母(candidaantarctica)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiasp.)、皺褶假絲酵母(candidarugosa)和根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物；優(yōu)選sn-1,3專一性脂肪酶，選自豬胰脂肪酶、疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物。在某些實(shí)施方案中，步驟(2)中，脂肪酶以溶液或粉末的形式提供。在某些實(shí)施方案中，步驟(2)中，脂肪酶的量足以使最終獲得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量計，所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，優(yōu)選以0.7％～2％的量存在。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)步驟(4)所述的干燥后，所得固定化脂肪酶中水分的含量為3％～25％，優(yōu)選7％～15％。在某些實(shí)施方案中，步驟(3)所述的分離采用抽濾、過濾、離心和/或板框壓濾進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，步驟(4)所述的干燥包括自然干燥、真空干燥、流化床干燥和/或冷凍干燥。本發(fā)明還包括種子殘渣與粉末吸附劑的混合物作為脂肪酶的固定化載體的用途，以及種子殘渣與粉末吸附劑的混合物在制備固定化脂肪酶中的用途。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣為植物種子粉碎、磨漿或榨油過程中的產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣選自但不限于橄欖果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕櫚仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻殘渣。在某些實(shí)施方案中，所述粉末吸附劑選自但不限于二氧化硅基粉末吸附劑和活性炭，優(yōu)選選自：白炭黑、硅藻土、硅膠、活性炭、白土、沸石粉和硅酸鎂。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶為來自動物、植物或微生物的脂肪酶。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶固定化后表現(xiàn)出sn-1,3專一性。在某些實(shí)施方案中，所述脂肪酶選自但不限于：豬胰脂肪酶；來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、米根霉(rhizopusoryzae)、南極假絲酵母(candidaantarctica)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiasp.)、皺褶假絲酵母(candidarugosa)和根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物，優(yōu)選為sn-1,3專一性脂肪酶，選自豬胰脂肪酶、疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物。在某些實(shí)施方案中，所述混合物中種子殘渣(干基)與粉末吸附劑的重量比為1:10～10:1，優(yōu)選為1:5～6:1，更優(yōu)選為1:3～6:1，更優(yōu)選為1:2.2～5.5:1。本發(fā)明還包括采用上述方法制備得到的固定化脂肪酶。本發(fā)明還包括一種載體，含有種子殘渣與粉末吸附劑的混合物，或由該混合物組成。在某些實(shí)施方案中，所述種子殘渣選自但不限于橄欖果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕櫚仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻殘渣。在某些實(shí)施方案中，所述粉末吸附劑選自但不限于二氧化硅基粉末吸附劑和活性炭，優(yōu)選選自：白炭黑、硅藻土、硅膠、活性炭、白土、沸石粉和硅酸鎂。在某些實(shí)施方案中，所述混合物中種子殘渣(干基)與粉末吸附劑的重量 比為1:10～10:1，優(yōu)選為1:5～6:1，更優(yōu)選為1:3～6:1，更優(yōu)選為1:2.2～5.5:1。本發(fā)明還包括本發(fā)明的固定化脂肪酶在甘油三酯水解和油脂酯交換中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，所述應(yīng)用包括在選擇性水解三酰甘油的1位和3位中的應(yīng)用。在某些實(shí)施方案中，所述應(yīng)用包括：(1)酶法合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，改變甘油骨架上脂肪酸組成和/或位置分布，得到具特定分子結(jié)構(gòu)的三?；视停刺囟ǖ闹舅釟埢挥谔囟ǖ奈恢?；(2)母乳脂肪替代品的制備；(3)合成類可可脂的制備；和(4)合成甘油二酯。具體實(shí)施方式本發(fā)明涉及使用包含種子殘渣和粉末吸附劑的混合物作為脂肪酶的固定化載體，制備固定化脂肪酶。適用于本發(fā)明所述各方面(產(chǎn)品、方法和用途)的種子殘渣可以是各種植物的種子在粉碎、磨漿、榨油等加工過程中的產(chǎn)物。因此，本發(fā)明的種子殘渣可以是，例如橄欖果渣、花生粕、油菜籽粕、棉籽粕、核桃渣、棕櫚仁渣、豆渣、豆粕、玉米渣和芝麻殘渣等。尤其優(yōu)選的種子是大豆、玉米和芝麻。適用于本發(fā)明所述各方面(產(chǎn)品、方法和用途)的粉末吸附劑可以是本領(lǐng)域周知的各種粉末吸附劑，尤其是各種已知用來制備固定化脂肪酶的粉末吸附劑。更優(yōu)選的，使用本領(lǐng)域周知的各種二氧化硅基粉末吸附劑，包括但不限于白炭黑、硅藻土、硅膠、白土、沸石粉和硅酸鎂中的一種或任意多種的任意比例的混合物。除此之外，還可使用活性炭。優(yōu)選使用白炭黑和硅藻土。白炭黑和硅藻土是多孔性物質(zhì)，其組成都可用sio2·nh2o表示。硅膠的組成可用msio2·nh2o表示。可采用市售的白炭黑來實(shí)施本發(fā)明，例如可使用來自邱博工程材料有限公司的白炭黑產(chǎn)品。應(yīng)理解，一些顆粒型吸附劑經(jīng)粉碎成粉末也可用作粉末吸附劑。用于制備固定化脂肪酶時，包含種子殘渣與粉末吸附劑的混合物中，種子殘渣(干基)與粉末吸附劑的重量比通常為1:10～10:1，優(yōu)選為1:5～6:1，更優(yōu)選為1:3～6:1，更優(yōu)選為1:2.2～5.5:1。因此，本發(fā)明某些實(shí)施方案中提供一種載體，優(yōu)選是固定化脂肪酶用載體，含種子殘渣和粉末吸附劑，或由所述種子殘渣和粉末吸附劑組成。該固定化脂肪酶用載體中的種子殘渣和粉末吸附劑及其用量配比優(yōu)選如本文所述。適用于本發(fā)明所述各方面(產(chǎn)品、方法和用途)的脂肪酶可以是來自動物、植物的脂肪酶，如豬胰脂肪酶，也可以使用來自微生物的脂肪酶，如來自疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、米根霉(rhizopusoryzae)、南極假絲酵母(candidaantarctica)、伯克霍爾德氏菌(burkholderiasp.)、皺褶假絲酵母(candidarugosa)和根霉(rhizopussp.)等以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物。優(yōu)選的是，脂肪酶是sn-1,3專一性脂肪酶，可以選自豬胰脂肪酶、疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)、米黑毛霉(mucormiehei)、螢光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)、黑曲霉(aspergillusniger)、米黑根毛霉(rhizomucormiehei)、解脂假絲酵母(candidalipolytica)、根霉(rhizopussp.)以及它們的基因改造菌種的脂肪酶中的一種或多種的混合物。固定化脂肪酶本發(fā)明的固定化脂肪酶包含有種子殘渣、粉末吸附劑和脂肪酶。通常，以固定化脂肪酶的重量計，所述粉末吸附劑以10％～70％的量存在，優(yōu)選以20％～50％的量存在；所述種子殘渣(干基)以20％～80％的量存在，優(yōu)選以40％～70％的量存在；所述脂肪酶以0.2％～6％的量存在，優(yōu)選以0.7％～2％的量存在。通常，固定化脂肪酶還存在一定量的水分。例如，以固定化脂肪酶的重量計，所述水分以3％～25％的量存在，優(yōu)選以7％～15％的量存在。或者，以干物質(zhì)重量計，種子殘渣與粉末吸附劑的重量比為1:10～10:1，優(yōu)選1:5～6:1，更優(yōu)選1:3～6:1，例如1:2.2～5.5:1。優(yōu)選的是，本發(fā)明的固定化脂肪酶含有種子殘渣、粉末吸附劑、脂肪酶和水分，以固定化脂肪酶的重量計，所述粉末吸附劑以20％～50％的量存在；所述 種子殘渣(干基)以40％～70％的量存在；所述脂肪酶以0.7％～2％的量存在；所述水分以7％～15％的量存在；以干物質(zhì)重量計，種子殘渣與粉末吸附劑的重量比為1:2.2～5.5:1。進(jìn)一步優(yōu)選的是，種子殘渣為豆渣。固定化脂肪酶的制備本發(fā)明制備固定化脂肪酶的方法通常包括將脂肪酶與種子殘渣和粉末吸附劑混合、分離出固體以及干燥所述固體的步驟。應(yīng)理解，可先混合種子殘渣與粉末吸附劑，然后再將所得混合物與脂肪酶混合?；蛘?，也可先使脂肪酶與種子殘渣或粉末吸附劑混合，然后再將所得混合物與另外一種載體(粉末吸附劑或種子殘渣)混合?；旌线^程即為固定化過程。可以本領(lǐng)域常規(guī)的固定化的方式進(jìn)行，例如可在攪拌機(jī)中混合/固定。例如，在某些實(shí)施方案中，在氣浴搖床上混合，轉(zhuǎn)速為100～200rpm?；旌蠎?yīng)使得脂肪酶與種子殘渣和/或粉末吸附劑充分接觸，均勻混合。對混合時的溫度并無特殊限制，通常在室溫(例如23～28℃左右)下進(jìn)行混合。對混合的時間也無特殊限制，通常在1～8小時之間，例如3～5小時。在某些實(shí)施方案中，所述方法可包括以下步驟：(1)將種子殘渣與粉末吸附劑按一定的比例混合；(2)將步驟(1)獲得的混合物與脂肪酶混合；(3)從步驟(2)獲得的混合物中分離出固體；和(4)將步驟(3)分離得到的固體干燥，得到所述固定化脂肪酶。通常，種子殘渣(干基)與粉末吸附劑的重量比為1:10～10:1，1:5～6:1，更優(yōu)選1:3～6:1，更優(yōu)選1:2.2～5.5:1。本發(fā)明的方法中，粉末吸附劑的用量應(yīng)足以使最終獲得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量計，所述粉末吸附劑以10％～70％的量存在，優(yōu)選以20％～50％的量存在；種子殘渣的用量足以使最終獲得的固定化脂肪酶中，以固定化脂肪酶的重量計，所述種子殘渣(干基)以20％～80％的量存在，優(yōu)選以40％～70％的量存在。本發(fā)明方法中，脂肪酶可以溶液或粉末的形式提供。脂肪酶溶液可以為市售的脂肪酶溶液，也可以是自行發(fā)酵的脂肪酶溶液。脂肪酶粉末可以是市售的脂肪酶粉末，也可以是自行發(fā)酵的脂肪酶溶液干燥(例如，自行噴霧干燥或冷凍干燥等)后獲得的脂肪酶粉末。應(yīng)理解，若以粉末的形式提供脂肪酶時，通常先將其配制為溶液，然后再與所述種子殘渣和/或粉末吸附劑混合。若將脂肪酶粉末配制為脂肪酶溶液時，可將酶粉溶解于緩沖液中?；旌匣蚺渲瓶梢允羌夹g(shù)人員容易想到的各種方式：例如當(dāng)脂肪酶以粉末形式提供時，可在水存在的情況下直接將粉末形式的脂肪酶與種子殘渣和/或粉末吸附劑混合；也可以直接先將粉末形式的脂肪酶與種子殘渣和/或粉末吸附劑混合后，再加水使用。通常，與種子殘渣和/或粉末吸附劑混合的脂肪酶的加入量應(yīng)滿足：最終獲得的固定化脂肪酶中所含有的所述脂肪酶的重量百分比含量為0.2％～6％，優(yōu)選為0.7％～2％(以固定化脂肪酶的重量計)?？刹捎贸闉V、過濾、離心和/或板框壓濾將固體形式的固定化脂肪酶分離出來，然后進(jìn)行干燥。抽濾、過濾、離心和板框壓濾的具體實(shí)施條件都是常規(guī)的條件，在本領(lǐng)域技術(shù)人員所掌握的知識范圍之內(nèi)。干燥包括自然干燥、真空干燥、流化床干燥和/或冷凍干燥。干燥的條件，例如溫度、壓力和干燥時間等也都可由技術(shù)人員根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)制備情況并結(jié)合本領(lǐng)域公知技術(shù)予以確定。通常，干燥后，所得固定化脂肪酶中水分的含量為3％～25％，優(yōu)選7％～15％。本發(fā)明也包括采用上述方法制備獲得的固定化脂肪酶。固定化脂肪酶的性質(zhì)和用途本發(fā)明的固定化脂肪酶可用于甘油三酯的水解反應(yīng)，也可用于油脂的酯交換反應(yīng)。尤其是，當(dāng)本發(fā)明的脂肪酶是sn-1,3專一性脂肪酶時，該脂肪酶具有較高的sn-1,3專一性。本發(fā)明涉及的固定化脂肪酶，尤其是具有sn-1,3專一性的脂肪酶可以使用在各種需要選擇性地水解三酰甘油的1位和3位的應(yīng)用中，包括但不限于以下這些具體應(yīng)用：(1)酶法合成結(jié)構(gòu)脂質(zhì)，改變甘油骨架上脂肪酸組成和(或者)位置分布，得到具特定分子結(jié)構(gòu)的三酰基甘油，即特定的脂肪酸殘基位于 特定的位置；(2)母乳脂肪替代品的制備；(3)合成類可可脂的制備；(4)合成甘油二酯。本發(fā)明的固定化脂肪酶及其制備方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：(1)本發(fā)明利用種子加工過程中的副產(chǎn)品種子殘渣及價格非常低廉的粉末吸附劑混合作為脂肪酶的載體，提高了副產(chǎn)物的利用價值，降低了固定化脂肪酶的成本；(2)固定化過程簡單，省時省力；和(3)所制備的固定化脂肪酶具有很高的活力，同時具有較高的sn-1,3專一性，是種子殘渣或粉末吸附劑單獨(dú)作為載體所無法達(dá)到的。在本發(fā)明的下述實(shí)施例中，水分含量及干基的測定方法，烘箱干燥法參照gb5009.3-2010；固定化酶中酶蛋白的量測定方法，參照文獻(xiàn)l.mojovic,etal.immobilizationoflipasefromcandidarugosaonapolymersupport.applmicrobiolbiotechnol,1998。對于實(shí)施例所采用的各種方法、試劑和條件，除非另有說明，否則均為本領(lǐng)域常規(guī)的方法、試劑和條件。本發(fā)明中的種子殘渣或具體的比如玉米渣、豆渣等，若無特別說明，為泛指，可以是干種子殘渣、濕種子殘渣、種子殘渣的干燥物或是種子殘渣的潤濕物等。但具體實(shí)施例中的種子殘渣除特別說明外均使用含有一定水分的濕種子殘渣。但當(dāng)計算其重量百分比時，本發(fā)明通常采用干基/干重進(jìn)行計算，即種子殘渣除去水分后剩余的物質(zhì)的重量。實(shí)施例1：固定化脂肪酶制備1、將10g玉米渣(上海嘉里食品工業(yè)有限公司)與10g白炭黑(邱博工程材料有限公司)混合，將150ml自發(fā)酵的疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)脂肪酶溶液(41700u/ml，采用橄欖油乳化法測定)加入其中，氣浴搖床120rpm，25℃固定4h，抽濾收集固體，將固體分成三份分別進(jìn)行干燥，采用流化床進(jìn)風(fēng)溫度40℃，進(jìn)風(fēng)量0.6m3/min，流化時間35min，干燥得到固定化酶a，自然風(fēng)干5天得固定化酶b，-20℃冷凍干燥24h得固定化酶c。2、將100g豆渣(上海嘉里食品工業(yè)有限公司，含水量85％)與10g白炭黑混合(邱博工程材料有限公司)，將市售米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶溶液(諾維信公司)用水配成水解活力為40000u/ml(采用橄欖油乳化法測定)的脂肪酶溶液，取200ml加入以上豆渣與白炭黑混合物中，氣浴搖床120rpm，25℃固定4h，抽濾收集固體，將所得的固體進(jìn)行35℃真空干燥24h得固定化酶d。3、將33g豆渣(上海嘉里食品工業(yè)有限公司，含水量80％)與10g白炭黑(邱博工程材料有限公司)混合，將150ml自發(fā)酵的疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)脂肪酶液(41700u/ml，采用橄欖油乳化法測定)加入其中，200rpm機(jī)械攪拌，35℃固定2h，離心除去上清液，將固體放到通風(fēng)良好的地方進(jìn)行自然風(fēng)干5天，干燥后得固定化酶e。4、將12g橄欖果渣與10g硅藻土(邱博工程材料有限公司)混合，將100ml自發(fā)酵的疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)脂肪酶液(41700u/ml，采用橄欖油乳化法測定)和50ml米黑根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶溶液(43600u/ml，采用橄欖油乳化法測定)加入其中，200rpm機(jī)械攪拌，35℃固定2h，離心除去上清液，將固體放到通風(fēng)良好的地方進(jìn)行自然風(fēng)干5天，干燥后得固定化酶f。5、將200g玉米磨漿殘渣(含水量80％)與15g沸石粉(100～300目，輝煌保溫材料廠)混合。將市售的豬胰脂肪酶(sigma公司)粉末用水配制成水解活力為30000u/ml(采用橄欖油乳化法測定)的溶液，取200ml加入以上玉米磨漿殘渣和白炭黑的混合物中，100rpm機(jī)械攪拌，30℃固定5h，離心分離出固體，將所得到的固體進(jìn)行-20℃冷凍干燥36h得固定化酶g。比較例1、向150ml自行發(fā)酵的疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)脂肪 酶(41700u/ml，采用橄欖油乳化法測定)中加入134g豆渣(上海嘉里食品工業(yè)有限公司，含水量85％)，氣浴搖床120rpm，25℃吸附固定2h，抽濾收集固體，將固體進(jìn)行自然風(fēng)干4天得固定化酶h。2、向150ml自行發(fā)酵的疏綿狀嗜熱絲孢菌(thermomyceslanuginosus)脂肪酶(41700u/ml，采用橄欖油乳化法測定)中加入20g白炭黑(含水量85％)，氣浴搖床120rpm，25℃吸附固定4h，抽濾收集固體，將固體進(jìn)行自然風(fēng)干5天得固定化酶i。所制備的固定化脂肪酶各組分的含量如表1所示。表1：固定化酶各組分含量實(shí)施例2：固定化脂肪酶水解活力固定化脂肪酶的水解活力用橄欖油乳化法測定，具體方法參照文獻(xiàn)ytgargouri,etal.processbiochemistry,2011。結(jié)果如表2所示。表2：固定化脂肪酶水解活力酶號abcdefghi水解活力/ku/g661137089579350108由表2可見，本發(fā)明所述的固定化脂肪酶具有很好的水解活力。實(shí)施例3：固定化脂肪酶酯交換活力以精煉大豆油和辛酸乙酯作為反應(yīng)底物(質(zhì)量比1:2)，固定化脂肪酶添加量10w％，60℃下反應(yīng)4h。反應(yīng)結(jié)束取0.1g產(chǎn)物用1ml正己烷溶解，進(jìn)行薄層色譜法分析分離出甘三酯并將其刮下，添加1ml正庚烷和1mlnaoh-甲醇(2mol/l)混合2min甲酯化，離心取上清液進(jìn)行氣相色譜法(gc)檢測。表3為各個固定化脂肪酶產(chǎn)物辛酸插入率m，辛酸插入率越高說明固定化脂肪酶酯交換活力越高。表3：固定化脂肪酶酯交換產(chǎn)物辛酸插入率(％)由表3可見，本發(fā)明所述的固定化脂肪酶具有很好的酯交換活力。實(shí)施例4：固定化脂肪酶專一性測定實(shí)施例3固定化脂肪酶催化產(chǎn)物中2-位脂肪酸組成，方法參照gbt24894-2010，2-位脂肪酸組成中，辛酸的組成為n，并計算sn-1,3辛酸插入率。sn-1,3辛酸插入率(％)＝100*(3m-n)/2sn-1,3辛酸插入率反映了固定化脂肪酶sn-1,3專一性的大小，并且sn-1,3辛酸插入率越大表明sn-1,3專一性越強(qiáng)。表4為各固定化脂肪酶酯交換產(chǎn)物sn-1,3辛酸插入率。表4：固定化脂肪酶酯交換產(chǎn)物sn-1,3辛酸插入率(％)由表4可見，比較例中的固定化脂肪酶h和i幾乎沒有sn-1,3專一性，而本發(fā)明的固定化脂肪酶a～g均具有sn-1,3專一性。實(shí)施例5：固定化脂肪酶用于母乳脂肪替代物制備甘油三硬脂酸酯(嘉里特種油脂(上海)有限公司)與油酸(豐益油脂化學(xué)(上海)有限公司)按質(zhì)量比1:2的比例混合溶解配成反應(yīng)底物，固定化脂肪酶添加量10％，60℃水浴，150rpm反應(yīng)4h，制備母乳脂肪替代物1,3-二油酸-2-棕櫚酸甘油三酯(opo)。取樣進(jìn)行g(shù)c分析甘三酯組成。表5：固定化脂肪酶催化產(chǎn)物甘三酯組成中opo的含量由表5可見，本發(fā)明所涉及的固定化脂肪酶應(yīng)用于母乳脂肪替代物的合成制備中，所得母乳脂肪替代物opo的含量相較于比較例有顯著的提高。當(dāng)前第1頁12