本發(fā)明屬于葡萄糖酸或葡萄糖酸鹽的制備技術(shù)領(lǐng)域，尤其是無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶在催化氧化葡萄糖酸或鹽中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葡萄糖酸或鹽，是一類重要的有機(jī)化學(xué)品，在食品、醫(yī)藥、化工等行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用。如葡萄糖酸鈣在臨床和醫(yī)藥領(lǐng)域有著廣泛用途；葡萄糖酸鈉可用于涂鍍特殊金屬前鋼坯的清洗，以增強(qiáng)鍍層金屬和鋼鐵表面的結(jié)合力；葡萄糖酸是五羥基己酸，可作為食品添加劑、醫(yī)藥中間體或清洗劑，用途廣泛。

目前國內(nèi)外生產(chǎn)葡萄糖酸主要是葡萄糖為底物轉(zhuǎn)化制備葡萄糖酸，其生產(chǎn)方法有化學(xué)催化法、電解氧化法、發(fā)酵法和酶法。化學(xué)法生產(chǎn)葡萄糖酸或鹽，成本昂貴，且催化劑制備工藝復(fù)雜，制約其工業(yè)化應(yīng)用；電解法副產(chǎn)物少，但是耗能多、工藝復(fù)雜，也很難用于工業(yè)化生產(chǎn)；發(fā)酵法生產(chǎn)葡糖酸或鹽過程中由于會產(chǎn)生副產(chǎn)物，増加了提取難度，降低了葡萄糖的轉(zhuǎn)化率。而酶催化的生產(chǎn)方法，反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物單一，不僅節(jié)省時間和降低成本，而且可以提高轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物純度，已經(jīng)收到廣泛關(guān)注。

交聯(lián)酶聚體一種無載體固定化方法，指利用雙功能試劑酶聚集進(jìn)行交聯(lián)而得到固定化酶的方法，不需要不溶性材料作為載體。與載體固定化相比，交聯(lián)酶聚體優(yōu)勢明顯：(1)交聯(lián)酶聚體比表面積大，催化效率和酶活回收率更高；(2)交聯(lián)后美的結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。交聯(lián)酶聚體的制備分為沉淀和交聯(lián)兩步，首先利用蛋白質(zhì)沉淀劑(中性鹽、水溶性有機(jī)溶劑、非離子型高聚物等)將溶解狀態(tài)的酶進(jìn)行物理沉淀得到酶沉淀聚體，隨后用交聯(lián)劑(常為戊二醛與酶聚體分子上的氨基發(fā)生schiffbase反應(yīng)，從而制得顆粒大小為1～200μm的水不溶性交聯(lián)酶聚集體。理論上，cleas的方法固定的酶全部可以發(fā)揮催化作用，酶活回收率可以超過100％。由此可見，cleas技術(shù)有可能發(fā)展成為一種從宏觀上提高酶活及選擇性的修飾方法。目前對cat/gox固定化大多是樹脂或其他載體進(jìn)行先吸附后交聯(lián)，關(guān)于交聯(lián)酶聚集體研究相對較少，因此制備cat/gox交聯(lián)酶聚體，并對其性質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行研究，具有重要的理論和現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體。

本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體的制備方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)中載體固定化成本高、酶活回收率低的缺點。

本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體在制備葡萄糖酸或葡萄糖酸鹽中的應(yīng)用。

為解決以上技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體的制備方法，包括以下步驟：

(1)將葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶溶于水中，按照葡萄糖氧化酶、過氧化氫酶的酶活比為1：1～20的比例混合，得到酶混合溶液；

(2)向步驟(1)得到的酶混合溶液中加入蛋白保護(hù)劑，得到溶液a，所述的蛋白保護(hù)劑為：伴刀豆蛋白a(cona)、聚賴氨酸(epl)、peg-nh2、牛血清蛋白(bsa)、海藻糖或聚乙二醇，

聚賴氨酸的分子量為3000，peg-nh2的分子量為6000，聚乙二醇的分子量為10000；

(3)向步驟(2)得到的溶液a中加入沉淀劑和交聯(lián)劑，得到溶液b，所述的沉淀劑為無水乙醇或異丙醇；所述的交聯(lián)劑為戊二醛、香草醛、peg-cho中的一種或幾種的混合物；

(4)向步驟(3)得到的溶液b中加入還原劑，所述的還原劑為硼氫化鈉或氰基硼氫化鈉，反應(yīng)，收集固形物，用磷酸緩沖液洗滌，既得到葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體。

不但可以提高交聯(lián)效率，同時對于提高酶活回收率有重要影響，本發(fā)明中加入的蛋白保護(hù)劑為：伴刀豆蛋白a、聚賴氨酸、peg-nh2、牛血清蛋白、海藻糖或聚乙二醇。

伴刀豆蛋白a(cona)作為一種凝集素，對含有甘露糖或者葡萄糖的糖蛋白具有特異性的親和力，實現(xiàn)酶的定向固定化，使酶在載體表面按照一定的方向排列，使底物易進(jìn)入到酶的活性位點，從而改善酶的酶學(xué)性質(zhì)。

聚乙二醇(peg)分子末端有兩個能被活化的-oh基團(tuán)，能夠與水形成氫鍵，使其具有良好的水溶性，是一種被廣泛使用的化學(xué)修飾材料。peg分子鏈上含有大量的羥基，多羥基的醇類能夠與水分子結(jié)合，降低介質(zhì)的介電常數(shù)，提高酶分子的疏水特性，從而提高酶的穩(wěn)定性。

聚賴氨酸、peg-nh2、牛血清蛋白富含賴氨酸，可以提供交聯(lián)過程中所需游離氨基，不僅可以降低交聯(lián)過程中對必需酶的構(gòu)象的傷害，而且可以增加交聯(lián)的強(qiáng)度，提高cleas的穩(wěn)定性，有益于cleas的重復(fù)使用。

步驟(2)中，所述的蛋白保護(hù)劑的終濃度為0.5～10mg/ml，優(yōu)選2mg/ml。

步驟(3)中，沉淀劑與溶液a的體積比為1～5:1，優(yōu)選2:1。

步驟(3)中，交聯(lián)劑與溶液a的質(zhì)量比為0.5～5:100，優(yōu)選3.5:100。

步驟(3)中，加入沉淀劑和交聯(lián)劑后反應(yīng)的溫度為4～25℃，優(yōu)選10℃，反應(yīng)時間為1～5h，優(yōu)選3.5h。

步驟(4)中，還原劑的終濃度為10～100mmol/l，加入還原劑后的反應(yīng)時間為10～60min。

上述葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體的制備方法制備得到的葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體。

上述葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體在制備葡萄糖酸或葡萄糖酸鹽中的應(yīng)用，所述葡萄糖酸鹽包括葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鈉、葡萄糖酸亞鐵。

葡萄糖酸的生產(chǎn)過程如下：將葡萄糖溶液、葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體加入反應(yīng)器中，反應(yīng)溫度30～45℃，以0.1～10ml/min的速度通入氧氣，氧化至反應(yīng)液中無殘?zhí)菚r終止反應(yīng)，得到葡萄糖酸。

葡萄糖酸鹽的生產(chǎn)過程如下：將葡萄糖溶液、葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體加入反應(yīng)器中，反應(yīng)溫度30～45℃，以0.1～10ml/min的速度通入氧氣，在雙酶協(xié)同作用下將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，同時流加一定濃度的碳酸鈣溶液、氧化鋅懸液、氫氧化鈉溶液或氫氧化亞鐵溶液，最終生成葡萄糖酸鈣、葡萄糖酸鋅、葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸亞鐵。

其中，所述的葡萄糖溶液中葡萄糖的質(zhì)量濃度為10％～50％，葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體的加入量為100～500mg。

有益效果：使用本發(fā)明制備得到葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶的交聯(lián)酶聚體，催化生產(chǎn)葡萄糖酸或葡萄糖酸鹽，交聯(lián)酶聚體顆粒細(xì)小，傳質(zhì)阻力相對較小，且改交聯(lián)酶聚體重復(fù)使用20次后葡萄糖轉(zhuǎn)化率仍保持在90％以上，且無任何副產(chǎn)物產(chǎn)生。

附圖說明

圖1添加各種保護(hù)劑制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的酶活回收率。

圖2添加各種保護(hù)劑制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)重復(fù)使用第20批次的葡萄糖轉(zhuǎn)化率。

圖3添加聚賴氨酸制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的粒徑分布圖。

圖4添加聚賴氨酸制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的紅外圖譜；combi-cleas為不添加保護(hù)劑制備的交聯(lián)酶聚體，combi-cleas(epl)為添加聚賴氨酸為保護(hù)劑制備的交聯(lián)酶聚體。

圖5添加聚賴氨酸制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的熱分析圖譜；combi-cleas為不添加保護(hù)劑制備的交聯(lián)酶聚體，combi-cleas(epl)為添加聚賴氨酸為保護(hù)劑制備的交聯(lián)酶聚體。

具體實施方式

根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

本發(fā)明中葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶均購自諾維信生物技術(shù)有限公司。

實施例1：

牛血清白蛋白(bsa)為保護(hù)劑的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的制備：

取1mlgox與1mlcat混合，酶活力比1：3；向上述混合酶液中加入1mlbsa(0.5mg/ml)溶液，混合均勻；然后加入6ml異丙醇和1ml戊二醛(25％,v/v)，異丙醇作為沉淀劑、戊二醛作為交聯(lián)劑，4℃恒溫培養(yǎng)箱100rmp沉淀交聯(lián)3h后加入200μl氰基硼氫化鈉溶液(50mmol/l)，繼續(xù)反應(yīng)30min后將此混合溶液4℃、8000rmp離心10min，舍棄上清，用磷酸緩沖液清洗沉淀5次，得到combi-cleas(cat/gox)，酶活回收率為127％，如圖1所示。

實施例2：

聚賴氨酸(epl，mw3000)為保護(hù)劑的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的制備：

取1mlgox與1mlcat混合，酶活力比1：5；向上述混合酶液中加入1mlepl(0.2mg/ml)溶液，混合均勻；然后加入6ml異丙醇作為沉淀劑和1mlpeg-cho(分子量2000kda，0.5mg/ml)，異丙醇作為沉淀劑、peg-cho作為交聯(lián)劑，4℃沉淀交聯(lián)3h后加入200μl氰基硼氫化鈉溶液(50mmol/l)，30min后將此混合溶液離心10min，舍棄上清，用磷酸緩沖液清洗沉淀5次，得到combi-cleas(cat/gox)，酶活回收率為133％，如圖1所示。圖3添加聚賴氨酸制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的粒徑分布圖，通過粒度分布儀進(jìn)行檢測，由圖知，cleas可以分布均勻，顆粒直徑主要集中在100～300nm。圖4添加聚賴氨酸制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的紅外圖譜：由圖可知，添加保護(hù)劑epl后，-c＝o峰強(qiáng)度增加，說明交聯(lián)程度增加，有利于提高無載體固定化酶的機(jī)械穩(wěn)定性；-nh2峰強(qiáng)度增加，說明無載體固定化酶表面游離氨基數(shù)目增加，提高了無載體固定化酶的耐酸性，更有利于氧化葡萄糖生產(chǎn)葡萄糖酸的反應(yīng)。圖5添加聚賴氨酸制備的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的熱分析圖譜；由圖可知，添加epl后，失重總量由于epl的增加而增加，但失重溫度并沒有明顯變化。

實施例3：

peg-nh2(分子量6000)為保護(hù)劑的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的制備：

取1mlgox與1mlcat混合，酶活力比1：15；向上述混合酶液中加入1mlpeg-nh2(0.2mg/ml)溶液，混合均勻；然后加入6ml無水乙醇作為沉淀劑和1ml香草醛(1g/l)，無水乙醇作為沉淀劑、香草醛作為交聯(lián)劑，4℃沉淀交聯(lián)3h后加入200μl氰基硼氫化鈉溶液(50mmol/l)，30min后將此混合溶液離心10min，舍棄上清，用磷酸緩沖液清洗沉淀5次，得到combi-cleas(cat/gox)，酶活回收率為100％，如圖1所示。

實施例4：伴刀豆蛋白(cona)為保護(hù)劑的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的制備：

取1mlgox與1mlcat混合，酶活力比1：2；向上述混合酶液中加入1mlcona(1mg/ml)溶液，混合均勻；然后加入6ml無水乙醇作為沉淀劑和1ml戊二醛(2.5％，w/w)，無水乙醇作為沉淀劑、戊二醛作為交聯(lián)劑，4℃沉淀交聯(lián)3h后加入500μl氰基硼氫化鈉溶液(50mmol/l)，30min后將此混合溶液離心10min，舍棄上清，用磷酸緩沖液清洗沉淀5次，得到combi-cleas(cat/gox)，酶活回收率為123％，如圖1所示。

實施例5：海藻糖為保護(hù)劑的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的制備：

取1mlgox與1mlcat混合，酶活力比1：10；向上述混合酶液中加入1ml海藻糖(2mg/ml)溶液，混合均勻；然后加入6ml異丙醇作為沉淀劑和1ml戊二醛(2.5％，w/w)，異丙醇作為沉淀劑、戊二醛作為交聯(lián)劑，4℃沉淀交聯(lián)3h后加入500μl氰基硼氫化鈉溶液(50mmol/l)，30min后將此混合溶液離心10min，舍棄上清，用磷酸緩沖液清洗沉淀5次，得到combi-cleas(cat/gox)，酶活回收率為115％，如圖1所示。

實施例6：peg10000為保護(hù)劑的無載體共固定化葡萄糖氧化酶/過氧化氫酶combi-cleas(cat/gox)的制備：

取1mlgox與1mlcat混合，酶活力比1：5；向上述混合酶液中加入1mlpeg10000(0.2％，w/v))溶液，混合均勻；然后加入6ml無水乙醇作為沉淀劑和1ml戊二醛(2.5％，w/w)，無水乙醇作為沉淀劑、peg-cho為交聯(lián)劑，4℃沉淀交聯(lián)3h后加入200μl氰基硼氫化鈉溶液(50mmol/l)，30min后將此混合溶液離心10min，舍棄上清，用磷酸緩沖液清洗沉淀5次，得到combi-cleas(cat/gox)，酶活回收率為120％，如圖1所示。

實施例7：

配制質(zhì)量濃度為10％的葡萄糖溶液，在裝有攪拌槳的圓底燒瓶中加入葡萄糖溶液1l，加入上述制備的combi-cleas(cat/gox)，進(jìn)行生產(chǎn)葡萄糖酸的反應(yīng)。反應(yīng)過程中控制氧化溫度30～45℃，反應(yīng)液ph為6.0～7.5，氧氣流速為5～100ml/min，反應(yīng)時間為10～22h，至葡萄糖反應(yīng)完全后氧化結(jié)束，離心回收combi-cleas(cat/gox)。上述添加不同保護(hù)劑制備的combi-cleas(cat/gox)在重復(fù)使用20次后，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率仍保持在90％以上，如圖2所示。

實施例8：

配制質(zhì)量濃度為10％的葡萄糖溶液，在裝有攪拌槳的圓底燒瓶中加入葡萄糖溶液1l及110g碳酸鈣，加入上述制備的combi-cleas(cat/gox)，進(jìn)行生產(chǎn)葡萄糖鈣的反應(yīng)。反應(yīng)過程中控制氧化溫度30～45℃，反應(yīng)液ph為6.0～7.5，氧氣流速為5～100ml/min，反應(yīng)時間為10～22h，反應(yīng)至反應(yīng)液澄清，即caco3完全溶解，葡萄糖剩余量小于0.1％時終止反應(yīng)，離心回收combi-cleas(cat/gox)。

實施例9：

配制質(zhì)量濃度為30％的葡萄糖溶液，在裝有攪拌槳的圓底燒瓶中加入葡萄糖溶液1l和上述制備的combi-cleas(cat/gox)，葡萄糖氧化酶在過氧化氫酶的協(xié)同作用下將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，反應(yīng)過程中向反應(yīng)體系中緩慢流加100g/l的氧化鋅懸液，以維持體系正常的ph環(huán)境，保證葡萄糖酸鋅的最終生成。反應(yīng)過程中控制氧化溫度30～45℃，反應(yīng)液ph為6.0～7.5，氧氣流速為5～100ml/min，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖剩余量小于0.1％時終止反應(yīng)，離心回收combi-cleas(cat/gox)。

實施例10：

配制質(zhì)量濃度為50％的葡萄糖溶液，在裝有攪拌槳的圓底燒瓶中加入葡萄糖溶液1l和上述制備的combi-cleas(cat/gox)，葡萄糖氧化酶在過氧化氫酶的協(xié)同作用下將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，氧化過程中向反應(yīng)體系中緩慢流加1mol/lnaoh溶液控制體系ph的恒定，定時測定反應(yīng)液中底物和產(chǎn)物的質(zhì)量濃度。反應(yīng)過程中控制氧化溫度30～45℃，反應(yīng)液ph為6.0～7.5，氧氣流速為5～100ml/min，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖剩余量小于0.1％時終止反應(yīng)，離心回收combi-cleas(cat/gox)。

實施例11：

配制質(zhì)量濃度為20％的葡萄糖溶液，在裝有攪拌槳的圓底燒瓶中加入葡萄糖溶液1l和上述制備的combi-cleas(cat/gox)，葡萄糖氧化酶在過氧化氫酶的協(xié)同作用下將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，氧化過程中向反應(yīng)體系中緩慢流加制備的氫氧化亞鐵或碳酸亞鐵溶液中和葡萄糖酸得到葡萄糖酸亞鐵，定時測定反應(yīng)液中底物和產(chǎn)物的質(zhì)量濃度。反應(yīng)過程中控制氧化溫度30～45℃，反應(yīng)液ph為6.0～7.5，氧氣流速為5～100ml/min，當(dāng)反應(yīng)液中葡萄糖剩余量小于0.1％時終止反應(yīng)，離心回收combi-cleas(cat/gox)。