本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及提高比活的α-淀粉酶basamy突變體及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：α-淀粉酶是一種十分重要的酶制劑，能夠從淀粉分子內(nèi)部隨機切開α-1,4糖苷鍵生成糊精和還原糖。α-淀粉酶廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵和紡織品工業(yè)。α-淀粉酶分布十分廣泛，遍及微生物至高等植物。相對于其他來源的α-淀粉酶，微生物來源的α-淀粉酶作用溫度廣，ph值范圍廣，生產(chǎn)成本低，因此微生物來源的α-淀粉酶被廣泛的應(yīng)用于各個工業(yè)領(lǐng)域。作為微生物α-淀粉酶中最重要的一類，芽孢桿菌α-淀粉酶是目前研究和應(yīng)用最為廣泛。沙漠芽胞桿菌(bacillussonorensis)α-淀粉酶簡稱basamy，是一種中溫α-淀粉酶，其作用ph廣，適用于食品、造紙、飼料等工業(yè)領(lǐng)域。相對于其他芽孢桿菌α-淀粉酶，basamy比活低，生產(chǎn)成本高，限制了其在食品、造紙、飼料等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，提高basamy的比活，降低其生產(chǎn)成本，是basamy工業(yè)化應(yīng)用急需解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明對來源于索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶basamy進行分子改造，從而提高basamy的比活，降低生產(chǎn)成本，為α-淀粉酶basamy的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明的目的是提供提高比活的α-淀粉酶basamy突變體。本發(fā)明的再一目的是提供提高比活的α-淀粉酶basamy突變體的編碼基因。索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶basamy的核苷酸序列和氨基酸序列分別如seqidno.1和seqidno.6所示。本發(fā)明采用定點飽和突變的方法對seqidno.6所示的α-淀粉酶basamy的第29位、第267位、第270位、第275位和第350位進行分子改造，經(jīng)過高通量篩選確定了第29位、第267位、第270位、第275位和第350位這5個位點的最優(yōu)突變氨基酸。其中29位由l突變?yōu)閍最好，267位則是s突變?yōu)閝，270位則是s突變?yōu)閜，275位則是a突變?yōu)閥，350位則是d突變?yōu)間。同時采用易錯pcr技術(shù)對seqidno.1所示的α-淀粉酶basamy的核苷酸序列進行改造，從而獲得一系列的突變位點。經(jīng)過高通量篩選獲得了6個有效突變體分別為a112r，l269f，k274s，q278s，s279q和l412c。在上述有效突變位點的基礎(chǔ)上，分別一一進行組合，最終得到了四個提高比活的bsamy突變體分別命名為basamy-1、basamy-2、basamy-3和basamy-4。這四個突變體的相對比活分別是basamy的130％，160％，180％和125％。basamy-1、basamy-2、basamy-3和basamy-4突變體的核苷酸序列如seqidno.2到seqidno.5所示，氨基酸序列如seqidno.7到seqidno.10所示。其中basamy-1包含的突變位點為l29a，a112r，s267q，k274s，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-2包含的突變位點為l29a，l269f，s270p，a275y，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-3包含的突變位點為l29a，a112r，l269f，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。其中basamy-4包含的突變位點為s267q，l269f，s270p，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。本發(fā)明通過蛋白理性改造和高通量篩選技術(shù)對索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶basamy進行分子改造，得到了四個比活提高的突變體。為索諾拉沙漠芽胞桿菌的α-淀粉酶的工業(yè)化應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。附圖說明圖1原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的最適反應(yīng)ph圖2原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的ph穩(wěn)定性圖3原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的最適反應(yīng)溫度圖4原始α-淀粉酶和突變體basamy-1至basamy-4的熱穩(wěn)定性具體實施方式以下實施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實驗方法，均參照《分子克隆實驗指南》(第三版)j.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書進行；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。實驗材料和試劑：1、菌株與載體索諾拉沙漠芽胞桿菌(bacillussonorensis)的α-淀粉酶購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號為10848、大腸桿菌菌株topl0、畢赤酵母x33、載體ppiczαa，載體pgapzαa，zeocin購自invitrogen公司。2、酶與試劑盒q5高保真taq酶mix購自neb公司，質(zhì)粒提取，膠純化，限制性內(nèi)切酶、試劑盒購自上海生工公司。3、培養(yǎng)基大腸桿菌培養(yǎng)基為lb(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％nacl，ph7.0)。lbz為lb培養(yǎng)基加25ug/mlzeocin。酵母培養(yǎng)基為ypd(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母篩選培養(yǎng)基為ypdz(ypd+100mg/lzeocin)。酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基bmgy(i％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％ynb、0.00004％biotin、1％甘油(v/v))和bmmy(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與bmgy相同)。實施例1、索諾拉沙漠芽胞桿菌(bacillussonorensis)的α-淀粉酶的克隆將索諾拉沙漠芽胞桿菌接入lb培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時后，提取其基因組dna。根據(jù)已報道索諾拉沙漠芽胞桿菌α-淀粉酶的序列(genebank:aofm01000005.1)設(shè)計兩條引物(r：5'-ctgaattcatggtttacaaatgcaaacgg-3'和f：5'-cttctagactatcgttggacataaatcga-3')用于擴增索諾拉沙漠芽胞桿菌α-淀粉酶基因。將擴增的pcr產(chǎn)物純化回收，分別連接到表達載體ppiczαa和ppgapzαa，得到表達載體ppiczαa-basamy和pgapzαa-basamy。實施例2、理性定點突變以上述ppiczαa-basamy為模板，以表中的引物進行pcr擴增，具體地擴增反應(yīng)體系如下：q5高保真taq酶mix23ul對應(yīng)突變體引物1ul對應(yīng)突變體引物1ulppiczαa-basamy(20ng)2ul加水至50ul反應(yīng)程序如下：瓊脂糖電泳檢測pcr擴增結(jié)果，純化回收pcr產(chǎn)物。用限制性內(nèi)切酶dpni將原始質(zhì)粒分解，將分解完的產(chǎn)物才用熱激法轉(zhuǎn)入大腸桿菌top10，通過菌液pcr驗證重組轉(zhuǎn)化子，提取驗證正確的轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進行測序，從而確定相應(yīng)的突變體。將測序正確的突變體，用saci線性化，轉(zhuǎn)入畢赤酵母x33。實施例3、高通量篩選高比活突變菌株將實施例2中的酵母重組轉(zhuǎn)化子用牙簽逐個挑至24孔板，每個孔中加入1ml含有bmgy培養(yǎng)基，30℃，220rpm培養(yǎng)24h左右，離心去上清。再分別加入1.6mlbmmy培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后，離心取上清，將上述上清液分別取出200μl至96孔板，進行α-淀粉酶酶活測定。α-淀粉酶酶活檢測參照中華人民共和國國家標準《gb/t24401-2009》進行測定。經(jīng)過高通量篩選得到5個有效突變位點分別為l29a，s267q，s270p，a275y和d350g。這5個突變體的相對比活如表1所示。表1原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶相對比活編號相對比活(％)原始α-淀粉酶100l29a115s267q120s270p125a275y119d350g128實施例4、易錯pcr非理性改造以上述pgapzαa-basamy為模板，進行易錯pcr隨機突變擴增，具體地擴增方法是：第一輪擴增：以載體啟動子引物aox5-f和aox3-r為引物進行pcr擴增，反應(yīng)體系如下：反應(yīng)程序如下：回收第一輪pcr產(chǎn)物，去1μl稀釋50-100倍用作第二輪pcr的模板；第二，第三輪易錯pcr以α-淀粉酶特異性引物r及f替代引物aox5-f和aox3-r為反應(yīng)引物，重復(fù)pcr反應(yīng)。取第二、三輪的產(chǎn)物用xbai和ecori進行雙酶切，連接至pgapzαa載體上的ecori和xbai位點之間。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化x33，在ypdz平板培養(yǎng)篩選突變菌株。經(jīng)過高通量篩選獲得了6個有效突變體分別為a112r，l269f，k274s，q278s，s279q和l412c。這6個突變體的相對比活如表2所示。表2原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶相對比活編號相對比活(％)原始α-淀粉酶100a112r121l269f130k274s126q278s131s279q123l412c125實施例5、組合突變進行組合突變，通過實驗最終得到4個組合突變分別命名為basamy-1、basamy-2、basamy-3、basamy-4。其中basamy-1包含的突變位點為l29a，a112r，s267q，k274s，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-2包含的突變位點為l29a，l269f，s270p，a275y，q278s，s279q，d356g和l412c。其中basamy-3包含的突變位點為l29a，a112r，l269f，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。其中basamy-4包含的突變位點為s267q，l269f，s270p，k274s，a275y，q278s，s279q和l412c。實施例6、原始α-淀粉酶及α-淀粉酶突變體的比活分析分別將原始α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶進行純化，純化方法為鎳柱純化。將純化好的α-淀粉酶和突變體α-淀粉酶分別測定相應(yīng)的酶活并計算出比活。以突變體比活除以原始α-淀粉酶比活，來計算突變體的相對比活。最終basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的相對比活分別為130％，160％，180％和125％。實施例7、原始α-淀粉酶及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)ph及ph穩(wěn)定性參照國標方法測定原始α-淀粉酶basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)ph。basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)ph如圖1所示。由圖1可知，突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適ph值幾乎和baamy一樣，均為6.0。將basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4分別在ph4-8條件下室溫處理2小時，然后參照國標的方法測定酶活，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知突變體basamy-1、basamy-2、basamy-3和basamy-4的ph穩(wěn)定性與basamy一致。實施例8、原始α-淀粉酶及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性參照國標方法測定basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)溫度，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的最適反應(yīng)溫度均為60℃。將basamy及突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4分別在50℃-90℃條件下水浴處理30分鐘，然后參照國標的方法測定酶活，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，突變體basamy-1，basamy-2，basamy-3和basamy-4的熱穩(wěn)定性與basamy一致。當前第1頁12