本發(fā)明提供了一種采用化學(xué)合成的方法-fmoc法合成cox52-69多肽的工藝，采用該方法所合成的cox52-69多肽在動物體內(nèi)體外實驗，證明其具有生物活性；并且本發(fā)明中還提供了所述cox52-69多肽的用途，屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

短肽cox52-69是一條含有18個氨基酸的多肽，最初是從豬的小腸中分離純化出來的，經(jīng)氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)其與細胞色素氧化酶ⅷ的第52至69完全重疊，所以命名cox52-69。其序列為llpagwvlshldsykkre。用生化分離純化得到的cox52-69多肽做功能實驗發(fā)現(xiàn)該多肽能夠抑制葡萄糖引起的胰島素的分泌，該發(fā)現(xiàn)目前已于2013年10月11日申請中國發(fā)明專利，申請?zhí)枮?01310471571.9。在該專利申請中通過從生物組織(豬腸道)中分離純化獲得cox52-69多肽，但是從生物組織中分離純化獲得cox52-69多肽是一個高成本的過程。為此需要尋求一種非生化分離的方法以獲取有活性的該肽，并能夠提高了產(chǎn)量和降低了成本。然而在本領(lǐng)域中，雖然通過化學(xué)合成或生物工程的方法獲得一個多肽是件容易的事，但是這些獲得的多肽通常是沒有生物活性的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供了一種具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法，并且利用化學(xué)合成的cox52-69多肽在動物體內(nèi)體外實驗，均發(fā)現(xiàn)化學(xué)合成的cox52-69多肽有抑制葡萄糖引起的胰島素分泌的功能和減輕體重的作用，即具有生物活性。

實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為：

一種具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法，該多肽的氨基酸序列如seqidno.1所示：llpagwvlshldsykkre，所述固相合成方法包括以下步驟：

(1)、縮合反應(yīng)：使用dmf預(yù)溶脹樹脂，濾去溶劑備用；向反應(yīng)柱中加入脫保護試劑，反應(yīng)后脫去樹脂上的的fmoc保護基團，抽干，繼續(xù)采用dmf清洗后抽干，并檢測；

稱取第一個fmoc-氨基酸fmoc-glu(tbu)-oh，同時稱取hobt備用，將二者同時加入反應(yīng)柱中，并且溶于dcm中，然后加入dic并攪拌；稱取dmap投入反應(yīng)柱中；氨基酸與反應(yīng)試劑一同反應(yīng)，反應(yīng)完畢后抽干并用dmf清洗；向反應(yīng)柱中加入脫保護試劑，反應(yīng)后，脫去樹脂上的的fmoc保護基團，抽干，繼續(xù)采用dmf清洗后抽干，并檢測；

接下來的按照cox52-69多肽的順序重復(fù)添加肽鏈上的下一氨基酸，直至整條肽鏈18個氨基酸全部添加完成并檢測通過；全部完成后，使用無水甲醇清洗并使用抽濾瓶將其抽干；

(2)、肽鏈的切割：在抽干的合成肽樹脂中加入切割液，在通風(fēng)櫥中室溫攪拌裂解，使用砂芯漏斗過濾除去樹脂，收集濾液，濾液經(jīng)乙醚萃取后放置于干燥瓶內(nèi)進行干燥，直至其成為白色粉末，即制得多肽粗品；

(3)、粗肽的檢測和純化：利用高效液相色譜檢測合成的多肽粗品，并分析合成產(chǎn)物中多肽的純度；

(4)、肽的質(zhì)譜鑒定：用質(zhì)譜檢測多肽粗品的分子量，確定合成的多肽是否是目標產(chǎn)物，最后將收集的樣品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入樣品杯中，冷凍過夜，次日用真空干燥劑冷凍干燥，最后獲得的白色粉末狀物質(zhì)即為純品cox52-69多肽。

步驟(1)中所述脫保護及縮合反應(yīng)的檢測方法如下：檢測時分別取三滴5％茚三酮無水乙醇溶液和三滴80％苯酚無水乙醇溶液與待檢測樹脂顆粒充分混勻，105℃加熱5min，觀察顏色變化，若變藍色或紫色，則說明游離氨基存在，脫保護完全；若為亮黃色或無色則表示縮合完全，能夠繼續(xù)進行下一個縮合反應(yīng)。

步驟(1)中在合成每一個氨基酸時，反應(yīng)過程中維持溫度在25℃～28℃。

步驟(2)中萃取的步驟為：在濾液中按1：10的體積比加入事先4℃下預(yù)冷的乙醚，進行萃取，再以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心2分鐘，并使用乙醚清洗離心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分鐘離心。

步驟(3)中高效液相色譜檢測的方法為：取多肽粗品置于ep管，加入三氟乙酸和水，于超聲振蕩機中震蕩使多肽粗品溶解，用c18分析柱進行hplc，流動相：a相：乙腈，0.1％tfa；b相：水，0.1％tfa，洗脫梯度：b相的濃度從90％到0，洗脫速度1ml/min，洗脫時間25min，檢測波長220nm。

步驟(4)中質(zhì)譜分析采用esi正離子模式，離子電壓為8000v，碰撞氣體為n2，脫溶劑氣溫度350e，注射泵進樣速度為10ul/min。

本發(fā)明同時還提供了上述利用化學(xué)合成的方法-fmoc法所合成cox52-69多肽得新的用途，用于制備抵抗高胰島素血癥和減輕體重的藥物中。

本發(fā)明中公開了可以用非生化分離的方法獲得正確的有生物活性的cox52-69多肽，簡化了獲得該多肽的生化繁瑣程序，而且還能夠根據(jù)目的需要對序列中的氨基酸或化學(xué)鍵進行目的性的修飾。經(jīng)過以上合成制備及修飾或優(yōu)化后，該多肽開發(fā)成藥物的成本就大大降低，效果也會更高。為后續(xù)藥物開發(fā)提供了簡潔可行的方法。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：1、本領(lǐng)域中通過化學(xué)合成或生物工程的方法獲得的多肽通常是沒有生物活性的，然而采用本申請所提供的固相合成方法，能夠制備出具有生物活性的cox52-69多肽。2、本發(fā)明中通過人工合成具有生物活性的cox52-69多肽，大大的簡化了其制備步驟，降低了生產(chǎn)成本，能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模制備。3、本發(fā)明中還提供了該多肽的新的用途，即能夠用于制備抵抗高胰島素血癥和減輕體重的藥物中。4、由于本申請中為采用人工合成的方法所制備的，因此能夠極方便的根據(jù)目的需要對序列中的氨基酸或化學(xué)鍵進行目的性的修飾，以做進一步的研究開發(fā)。

附圖說明

圖1為本實施例中所制備的cox52-69多肽的hplc色譜圖；

圖2為本實施例中所制備的cox52-69多肽的質(zhì)譜分析圖；

圖3為本發(fā)明實施例中動物大鼠腹腔注射cox52-69后引起胰島素濃度的變化圖；

圖4為實施例中實驗組和對照組的體重變化對比圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做詳細具體的說明，但是本發(fā)明的保護范圍并不局限于以下實施例。

本實施例中所提供的具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法中所采用的試劑如下：

1.實用王樹脂(wangresin，0.47mmol/g)購自天津南開和成科技有限公司；

2.fmoc-tyr(tbu)-oh等其他使用fmoc保護的氨基酸均購自上海吉爾生化；

3.縮合試劑n’-四甲基脲六氟磷酸酯(hbtu)購自上海吉爾生化(分析純)；

4.1-羥基-苯丙-三氮唑(hobt)購自上海吉爾生化(分析純)；

5.二異丙基乙胺(diea)購自上海吉爾生化(分析純)；

6.二甲氨基吡啶(dmap)購自蘇州昊帆生物科技公司(分析純)；

7.二異丙基碳二亞胺(dic)購自上海吉爾生化(分析純)；

9.二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)購自上海吉爾生化(分析純)；

10.2，6-二氯苯甲酰氯(dcb)購自上海吉爾生化(分析純)；

11.二甲基甲酰胺(dmf)購自上海吉爾生化(分析純)；

12.二氯甲烷(dcm)購自上海吉爾生化(分析純)；

13.哌啶(pip)購自上海吉爾生化(分析純)；

14.甲醇(meoh)購自上海吉爾生化(分析純)；

15.四氫呋喃(thf)購自上海吉爾生化(分析純)；

16.吡啶(py)購自上海吉爾生化(分析純)；

17.三氟乙酸(tfa)

18.乙腈。

實驗試劑的配制如下：

脫保護試劑：哌啶：dmf溶液＝1:5(體積比)

切割溶液：tfa：edt：苯甲硫醚：苯酚：水＝86:5:5:2:2(體積比)

肽沉淀溶液：乙醚

游離氨基檢測試劑kaiser的配制：

溶液a：6g水合茚三酮溶于100ml無水乙醇中，稍加熱或攪拌促溶

溶液b：8g熔融苯酚溶解在10ml無水乙醇中

溶液c：2％0.001m的kcn的吡啶溶液

具體的合成包括以下步驟：

縮合反應(yīng)

(1)溶脹樹脂：選取取代率為0.47mmol/g的wang樹脂，并計算使用量。計劃合成10mg多肽，分子量為2112，并且按照5％的收率來算，應(yīng)投入10/5％/2112/0.47＝0.2g，使用dmf預(yù)溶脹樹脂30分鐘，并且濾去溶劑備用；

(2)脫保護反應(yīng)：向反應(yīng)柱中加入脫保護試劑4ml，反應(yīng)15分鐘，脫去樹脂上的的fmoc保護基團，抽干，dmf洗3遍，抽干，并檢測；

(3)連接反應(yīng)：稱取第一個fmoc-氨基酸fmoc-glu(tbu)-oh，分子量是425.48，按照2倍投料量計算，0.2*0.47*425.48*2＝79.99mg，稱取0.08g谷氨酸備用，同時計算hobt(分子量135)用量為0.2*0.47*135*2＝25.38mg，稱取0.025ghobt備用，將二者同時加入反應(yīng)柱中，并且溶于dcm中，然后加入dic，攪拌10分鐘；第一個氨基酸與樹脂的鏈接需要dmap為之提供弱堿環(huán)境，其分子量為122，計算其所用量為0.2*0.47*122*2＝22.94mg，稱取0.023gdmap投入反應(yīng)柱中。氨基酸與反應(yīng)試劑一同反應(yīng)3h，并且抽干，用dmf洗3遍；

(4)脫保護反應(yīng)：向反應(yīng)柱中加入脫保護試劑4ml，反應(yīng)15分鐘，脫去樹脂上的的fmoc保護基團，抽干，dmf洗3遍，抽干，并檢測；

(5)反檢，用kaiser試劑檢測；

(6)接下來的每一步均為重復(fù)添加肽鏈上的下一氨基酸，按照2、3、4、5的順序依次重復(fù)，直至整條肽鏈18個氨基酸全部添加完成并檢驗通過，因為隨著肽鏈的延長，氨基酸的掛靠連接就愈加困難，所需的反應(yīng)條件也愈發(fā)苛刻，每一步反應(yīng)過程中盡量做到維持溫度在25℃-28℃之間。全部完成后，使用無水甲醇清洗兩次，并使用抽濾瓶將其抽干；

脫保護及縮合反應(yīng)的檢測

利用游離的氨基酸除個別氨基酸(如酪氨酸與茚三酮反應(yīng)不顯色或顯色極淺)和茚三酮反應(yīng)顯色的原理，在每步脫保護和縮合反應(yīng)完全后，從反應(yīng)柱中取少許樹脂顆粒檢測反應(yīng)是否完全。檢測時分別取三滴5％茚三酮無水乙醇溶液和三滴80％苯酚無水乙醇溶液與待檢測樹脂顆粒充分混勻，105℃加熱5min，觀察顏色變化，若變藍色或紫色，則說明游離氨基存在，脫保護完全；若為亮黃色或無色，則縮合完全，可繼續(xù)進行下一個縮合反應(yīng)。

肽鏈的切割

稱取抽干的合成的肽樹脂，采用tis裂解法，按1g：8ml比例加入切割液，在通風(fēng)櫥中室溫攪拌裂解3h，為取下含有多肽的酸溶液，使用砂芯漏斗過濾除去樹脂，收集濾液。濾液按1ml：10ml的比例加入事先4℃預(yù)冷的乙醚，對多肽溶液進行萃取，以每分鐘3000轉(zhuǎn)的速度離心2分鐘，并使用乙醚清洗離心管，清洗3次，每次清洗都配合有2分鐘離心，將萃取好的多肽溶液放置于干燥瓶內(nèi)進行干燥，直至其成為白色粉末，即我們所需要的多肽鏈粗品。

粗肽的檢測及純化

利用高效液相色譜(hplc)檢測合成的多肽，并分析合成產(chǎn)物中多肽的純度，取少量多肽樣品置于1.5mlep管，加入三氟乙酸和水，于超聲振蕩機中震蕩使多肽樣品溶解，用c18分析柱進行hplc。流動相：a相：乙腈，0.1％tfa；b相：水，0.1％tfa，洗脫梯度：b的濃度從90％到0，洗脫速度是1ml/min，洗脫時間是25min，檢測波長是220nm。檢測結(jié)果如圖1所示，從圖1中可以看出合成的多肽在將近9分鐘時出峰，而且只出現(xiàn)一個單峰，純度較高，經(jīng)峰面積歸一法得到多肽的純度達到了98.37％。

肽的質(zhì)譜鑒定

質(zhì)譜分析采用esi正離子模式，離子電壓為8000v，碰撞氣體為n2，脫溶劑氣溫度350e，注射泵進樣速度為10ul/min，質(zhì)譜鑒定能夠很準確的鑒定出合成多肽的分子量。最后將收集的樣品用三氟乙酸和水溶解制成溶液倒入樣品杯中，-80℃冷凍過夜，次日用真空干燥劑冷凍干燥，最后獲得的白色粉末狀物質(zhì)即為純品cox52-69。質(zhì)譜分析的結(jié)果如圖2所示，從圖中可以看出合成的多肽的分子量為2113.23，這與所計算的多肽分子量的理論值相吻合，即為本申請中所要的cox52-69多肽。

多肽生物活性檢測

將本實施例中所制備出的cox52-69多肽對動物大鼠進行腹腔注射，并觀察實驗組和空白組的胰島素濃度變化狀況，結(jié)果如圖3所示，從圖3中可以看出，未注射多肽時，實驗組和空白組的胰島素的濃度并無差異，但在30min時，也就是注射完多肽30min后(2.5mg/kg))，即葡萄糖(2g/kg)灌胃結(jié)束，實驗組的胰島素濃度低于空白組(注射同體積的不含多肽的溶劑)具有差異性，在120min，也就是灌完胃90min后，實驗組的胰島素濃度仍然低于空白組，具有差異性。

然后選擇同窩中相對肥胖的小鼠分為實驗組和對照組。兩組的初始體重沒有差異。實驗組(cox52-69)腹腔注射多肽cox52-69(2.5mg/kg)，對照組(ns)注射同體積的溶劑。實驗結(jié)果如圖4所示，結(jié)果顯示20天后實驗組較對照組有體重減輕(p<0.05)。

<110>：中南民族大學(xué)

<120>：一種具有生物活性的cox52-69多肽的固相合成方法及其用途

<160>：1

<210>：1

<211>：18

<212>：prt

<213>：家豬(susscrofadomestica）

<400>：1

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