本發(fā)明一株抗馬布特羅單克隆抗體雜交瘤細胞株gz03及其應用，屬于食品安全免疫學檢測領域，涉及雜交瘤細胞株gz03及其產生的抗馬布特羅單克隆抗體。

背景技術：

β-腎上腺受體興奮劑是一類能夠促進瘦肉生長的飼料添加劑，包括鹽酸克倫特羅、溴布特羅、馬布特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺、鹽酸多巴胺、硫酸特布他林、苯乙醇胺a、班布特羅、鹽酸齊帕特羅、鹽酸氯丙那林、西布特羅、酒石酸阿福特羅、富馬酸福莫特羅等15種藥物。其中鹽酸克倫特羅最早被用作飼料添加劑，適用范圍也最為廣泛。馬布特羅（mab）的化學結構與克倫特羅（cl）非常相似，很有可能成為克倫特羅的替代品。β-腎上腺受體興奮劑這類藥物在醫(yī)學上具有松弛支氣管平滑肌，降低血管通透性，發(fā)揮平喘的作用，也可以加強心肌收縮性，加快心律，提高心臟的興奮性，若將這類藥物加入到飼料中去，則能夠顯著提高豬、牛、羊等牲畜的瘦肉生長率，從而使體重也得以增加。且這類藥物性質穩(wěn)定、不易破壞，能通過進食攝取危害人體健康，導致明顯的生理毒性，例如心悸、戰(zhàn)栗、惡心嘔吐、頭暈目眩、神經過敏、血管舒張、心跳加速等，特別是對三高病人和甲亢患者有較為明顯的危害，嚴重的甚至有可能導致死亡。歐盟、美國、中國等眾多國家和地區(qū)均相應立法嚴令禁止使用β-激動劑作為動物飼料添加劑。我國農業(yè)部也先后頒布了176號、193號、235號、1519號等一系列公告，明確提出不得將以上15種β-腎上腺受體興奮劑作為動物飼料及其飲用水的添加劑。

目前檢測溴布特羅、克倫特羅和馬布特羅的方法主要是氣相色譜法（gc），液相色譜法（hplc），分光光度法、分子印跡法、毛細管電泳、氣質聯(lián)用法、電化學免疫傳感器等方法，但是這些方法存在操作繁瑣，耗時，費用比較貴等缺點，不能實現(xiàn)大量樣品的快速檢測。因此建立一種快速簡便的檢測方法具有重要意義。酶聯(lián)免疫法（elisa）是一種極為高效、敏感、快速的檢測方法，檢測時對樣本的純度要求不高而且操作簡便，適用于大量樣本的現(xiàn)場快速檢測。然而得到高特異性和高靈敏度的單克隆單體是免疫學檢測的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種對馬布特羅具有較好特異性和檢測靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株的制備方法。

本發(fā)明提供一種抗馬布特羅單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株制備的抗體對馬布特羅具有較好特異性和檢測靈敏度，可以用來建立馬布特羅的免疫學檢測方法。

本發(fā)明的技術方案：一株抗馬布特羅單克隆抗體雜交瘤細胞株gz03，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號為cgmccno.13091。

抗馬布特羅單克隆抗體，它由所述保藏編號為cgmccno.13091的抗馬布特羅單克隆抗體雜交瘤細胞株gz03分泌產生。

抗馬布特羅單克隆抗體的應用，可用于食品中馬布特羅的殘留檢測。

本發(fā)明提供的細胞株gz03的制備基本步驟為：

1）免疫原的合成：稱取15.62mg馬布特羅于小玻璃瓶中，加入135μl的1mhcl溶液，再加入1ml超純水至完全溶解，4℃預冷30min；在溶液中加入13μl的30%nano2溶液，冰水浴反應1h，得到活化液；用cb緩沖液稀釋三份等量klh蛋白10mg；將活化液按照體積比1︰2︰3分別緩慢滴加到各份載體蛋白klh中，偶聯(lián)蛋白構建免疫原。邊滴加活化液，邊調節(jié)ph至9.0，直至反應液顏色變深黃色停止滴加活化液；4℃冰浴反應4h后，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；

2）包被原的合成：由于沙丁胺醇和馬布特羅都具有叔丁胺基結構，所以本實驗采用異源包被檢測，稱沙丁胺醇100mg（0.42mmol）溶于無水乙醇中；再加5.1mgdmap（4-二甲基氨基吡啶）和0.5ml無水吡啶，4℃冰浴反應，將63mg琥珀酸酐分成5等份，每隔0.5h加一份到反應液體系中，冰浴環(huán)境下邊攪拌邊反應5h；過濾反應液，將白色沉淀物質收集，用乙醇洗滌白色沉淀物，烘干，得到化合物a。稱取9.4mg化合物a于棕色小瓶中，加入400μl的無水dmf和600μl的ph4.7、0.1mmes緩沖溶液溶解；將15.9mgedc和9.5mgnhs固體加入到溶解后的化合物a的反應瓶中，攪拌6～8h，得到活化液；稱取牛血清蛋白bsa溶解于cb溶液中，將活化液加入到蛋白質溶液中，用1mnaoh溶液調節(jié)ph至9.0，室溫反應過夜。整個過程避光進行。通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，并通過紫外吸收掃描方法鑒定；

3）小鼠的免疫：馬布特羅完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。最后一次用馬布特羅完全抗原（不含佐劑）沖擊免疫；通過間接elisa檢測血清效價和抑制；

4）細胞融合與細胞株建立：通過聚乙二醇（peg1500）法將小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤細胞融合，通過hat培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接elisa檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭elisa法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行三次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株gz03；

5）雜交瘤細胞株gz03性質的鑒定：通過elisa法測定靈敏度和特異性。

本發(fā)明的有益效果：（1）本發(fā)明獲得的抗馬布特羅單克隆抗體細胞株gz03，對馬布特羅有較好的檢測靈敏度和特異性（ic50值為0.41ng/ml），可以用于食品中馬布特羅的殘留檢測；（2）一種新的半抗原合成的思路，在用異原包被進行檢測，得到靈敏度很好的單克隆抗體細胞株。

生物材料樣品保藏：單克隆細胞株gz03，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13091，保藏日期2016年10月31日。

附圖說明

圖1.馬布特羅免疫原合成紫外鑒定圖。

圖2.gz03分泌的單克隆抗體的抑制標準曲線。

具體實施方式

本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。

本發(fā)明通過將馬布特羅完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接elisa和間接競爭elisa篩選細胞上清，最終得到了對馬布特羅有較好特異性和靈敏度的單克隆抗體雜交瘤細胞株。

實施例1：雜交瘤細胞株gz03的制備

1、完全抗原的合成

稱取7.81mg馬布特羅于小玻璃瓶中，加入68μl的1mhcl溶液，再加入1ml超純水至完全溶解，4℃預冷30min；在溶液中加入13μl的30%nano2溶液，冰水浴反應1h，得到活化液；用cb緩沖液稀釋klh蛋白10mg；將活化液緩慢滴加到載體蛋白klh中，邊滴加活化液，邊調節(jié)ph至9.0，直至反應液顏色變深黃色停止滴加活化液；4℃冰浴反應4h后，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子，并通過紫外吸收掃描方法鑒定。

2、動物免疫

選擇健康的6～8周齡的balb/c小鼠進行免疫。取馬布特羅完全抗原與等量弗氏佐劑混合乳化后，通過背部皮下注射免疫balb/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐劑，之后都用不完全弗氏佐劑。首免與加強免之間間隔一個月，加強免之間間隔21天。三免后7天采血，使用間接競爭elisa方法測定小鼠血清效價和抑制，選擇效價高抑制好的小鼠，在四免后18天沖擊免疫，不使用佐劑，腹腔注射。

3、細胞融合

在沖擊免疫3天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1500）方法進行細胞融合，具體步驟如下：（1）無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；（2）收集sp2/0細胞，懸浮于rpmi-1640基礎培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；（3）將脾細胞和sp2/0細胞按照計數(shù)比1︰10的比例混合，離心后用50%peg融合，時間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4、細胞篩選與細胞株建立在細胞融合的第3天對融合細胞進行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第5天進行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第7天取細胞上清進行篩選。篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用馬布特羅為標準品，用間接競爭elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選擇對馬布特羅標準品有較好抑制的細胞孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復三次，獲得細胞株gz03。

5、單克隆抗體的制備與鑒定

取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶雜交瘤細胞gz03，從第7天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。

使用間接競爭elisa，測定單克隆抗體馬布特羅的ic50為：0.41ng/ml，說明對馬布特羅有很好的靈敏度，可用于馬布特羅免疫分析檢測。

6、抗體應用

將雜交瘤細胞株gz03通過體內腹水制備的單克隆抗體應用于馬布特羅的elisa添加回收試驗，具體步驟如下：

（1）包被：將包被原sal-bsa用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液從2μg/ml開始倍比稀釋，100μl/孔，37℃反應2h；

（2）洗滌：將板內溶液傾去，甩干，并用洗滌液洗滌3次，每次3min；

（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃反應2h，洗滌后烘干備用；

（4）加樣：在烘干后的板中加入pbs溶液和標準品溶液，50μl/孔，將抗血清從1︰1000開始倍比稀釋，并加入到各稀釋度的包被孔中，50μl/孔，37℃反應30min；充分洗滌后，加入1︰3000稀釋的hrp-羊抗鼠igg，100μl/孔，37℃反應30min；

（5）顯色：將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的tmb顯色液，37℃避光反應15min；

（6）終止和測定：每孔加入50μl2mh2so4終止液以終止反應，然后用酶標儀測定各孔的od450值；

（7）結果判讀：以od450值大于或等于陰性對照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所對應的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的elisa效價。

溶液的配置：

碳酸鹽緩沖液（cbs）：稱取na2co31.59g，nahco32.93g，分別溶于少量雙蒸水后混合，加雙蒸水至約800ml混勻，調ph值至9.6，加雙蒸水定容至1000ml，4℃貯存?zhèn)溆茫?/p>

磷酸鹽緩沖液（pbs）：8.00gnacl，0.2gkcl，0.2gkh2po4，2.9gna2hpo4·12h2o，溶于800ml純水中，用naoh或hcl調ph到7.2～7.4，定容至1000ml；

pbst：含0.05%吐溫-20的pbs；

tmb顯色液：a液：na2hpo4·12h2o18.43g，檸檬酸9.33g，純水定容至1000ml；b液：60mgtmb溶于100ml乙二醇中；a、b液按體積比1︰5混合即為tmb顯色液，現(xiàn)用現(xiàn)混。

綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內容所作的等效變化與修飾，都應為本發(fā)明的技術范疇。