本發(fā)明涉及一株分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株zxl-1及其應用，涉及潮霉素b單克隆抗體的制備方法，以及動物源食品中潮霉素b的間接競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立，屬于免疫檢測技術領域。
背景技術：
潮霉素b，即hygromycinb（hb）是一種由吸水鏈霉菌產(chǎn)生的氨基糖苷類抗生素，它可以通過抑制蛋白質合成殺死細菌、真菌和高級真核細胞。具有一定的驅蟲活性，在豬禽飼料中長期添加，具有良好的驅線蟲效果。
動物源性食品中獸藥殘留問題是近年來國際社會研究的公共衛(wèi)生熱點一，受到人們的普遍關注。由于臨床已證明hb具有耳毒性和腎毒性，因此歐盟規(guī)定禁止使用hb作為家畜的生長促進劑。鑒于這類抗生素在臨床應用方面的副作用及易使細菌產(chǎn)生耐藥性，美國食品與藥品管理局（foodanddrugadministration）對動物源性食品中氨基糖苷類獸藥殘留也極為關注。我國農(nóng)業(yè)部235公告中規(guī)定hb可做畜禽類動物治療用藥，但不得在相關動物性食品中檢出。
目前，hb的最常用的檢測方法為高效液相色譜法等儀器檢測方法，該種檢測方法耗時長，操作需要掌握相關的專業(yè)技術，樣品前處理繁瑣等。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈敏、對技術人員要求低等特點，因此適用于大量樣品的現(xiàn)場快速篩查。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種能夠分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的細胞株制備方法，建立檢測潮霉素b的免疫學檢測方法。
本發(fā)明的技術方案：一株分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株zxl-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，保藏編號cgmccno.13097，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細胞株。
潮霉素b特異性單克隆抗體，其是由所述保藏編號cgmccno.13097的雜交瘤細胞株zxl-1分泌產(chǎn)生。
所述潮霉素b特異性單克隆抗體的應用，用于動物源食品中潮霉素b的快速免疫檢測。
提供的潮霉素b雜交瘤細胞株的制備方法基本步驟為：
1、免疫原和包被原的制備：采用戊二醛法，將hb與牛血清蛋白（bsa）偶聯(lián)得到的免疫原h(huán)b-bsa；采用碳化二亞胺法，與雞蛋清白蛋白（ova）偶聯(lián)得到的hb-ova作為包被抗原。
hb-bsa的具體合成步驟如下：
a、稱取10mghb，溶于1ml0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，再逐滴加入稀釋10倍后的質量分數(shù)為25%的戊二醛溶液100μl，室溫攪拌30min后，得到活化液；
b、稱取50mgbsa，溶于5ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應3～4h后，將反應液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-bsa。
hb-ova的具體合成步驟如下：
a、稱取20mgova，溶于3ml0.1mph6.0的一水合2-（n-嗎啡啉）乙磺酸（mes）溶液中；不斷攪拌下，先加入24mgn-羥基琥珀酰亞胺，15min后，再加入31mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺）；在室溫下，攪拌2h，得到活化液；
b、稱取5mghb，溶于1ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中；在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應4h后，將反應液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-ova。
2、動物免疫與效價測定：采用小劑量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μghb-bsa與等量弗氏完全佐劑混勻后進行皮下注射，間隔3周后，再用100μghb-bsa與等量弗氏不完全佐劑加強免疫，此后每隔3周用半量hb-bsa加強免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用hb與雞蛋清白蛋白（ova）的偶聯(lián)物hb-ova作為包被抗原，通過間接競爭elisa檢測血清效價和抑制；
其具體elisa程序如下：
（1）包被：將包被抗原用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h；
（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；
（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃孵育2h；洗滌后烘干備用；
（4）加樣：酶標板上半部分加入0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液，50μl/孔（上半部分稱為0標），下半部分加入不同濃度的用0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋的hb標準品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50μl/孔（下半部分稱為加標），上下部分對應加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；
（5）顯色：將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的顯色液（tmb與底物液體積比例1:5），37℃避光反應15min；
（6）終止和測定：取出酶標板，每孔加入50μl終止液（2mol/l的硫酸）終止反應，然后用酶標儀測定各孔的吸光值od450；
（7）結果判讀：以od值大于或等于陰性血清對照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所對應的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的elisa效價；上下部分對照，加標od值為0標一半的即是所加的標準品濃度；
3、細胞融合與篩選：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1450）方法進行細胞融合，具體步驟如下：
a、無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；
b、收集sp2/0細胞，懸浮于rpmi-1640基礎培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；
c、將脾細胞和sp2/0細胞按照10:1（數(shù)量比）的比例混合，離心后用50%peg融合，時間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃、5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細胞融合的第三天對融合細胞進行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第9天取細胞上清進行篩選；
篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用hb標準品，用間接競爭elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選出對hb具有較好抑制的孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復三次，即可得到能穩(wěn)定分泌hb單克隆抗體的細胞株。
4、單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明將得到的特異性分泌hb抗體的雜交瘤細胞株zxl-1經(jīng)過腹水制備以及純化，即可得到抗hb單克隆抗體。該抗體可用于動物源食品中hb殘留的免疫檢測，使用間接競爭elisa和間接elisa，測定單克隆抗體對hb的半數(shù)抑制率ic50為9.26ng/ml；為動物源食品中hb的快速免疫檢測提供了可能，滿足目前市場上對hb快速免疫檢測產(chǎn)品的需求。
生物材料樣品保藏：分泌潮霉素b特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株zxl-1，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱cgmcc，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13097，保藏日期2016年10月31日，分類命名單克隆細胞株。
附圖說明
圖1是本發(fā)明獲得的單克隆抗體檢測潮霉素b的elisa標準曲線。
具體實施方式
本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍，下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
本發(fā)明通過將完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，hat選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過間接elisa和間接競爭elisa篩選細胞上清，將篩選得到的對hb抑制較好的細胞株擴大培養(yǎng)，并經(jīng)過腹水制備以及純化，最終得到了具有較好靈敏度的hb單克隆抗體。
實施例1hb單克隆抗體的制備
1、免疫原和包被原的制備：采用戊二醛法，將hb與牛血清蛋白（bsa）偶聯(lián)得到的免疫原h(huán)b-bsa；采用碳化二亞胺法，與雞蛋清白蛋白（ova）偶聯(lián)得到的hb-ova作為包被抗原。
hb-bsa的具體合成步驟如下：
a、稱取10mghb，溶于1ml0.1mph7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，再逐滴加入稀釋10倍后的質量分數(shù)為25%的戊二醛溶液100μl，室溫攪拌30min后，得到活化液；
b、稱取50mgbsa，溶于5ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中，在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應3～4h后，將反應液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-bsa。
hb-ova的具體合成步驟如下：
a、稱取20mgova，溶于3ml0.1mph6.0的一水合2-（n-嗎啡啉）乙磺酸（mes）溶液中；不斷攪拌下，先加入24mgn-羥基琥珀酰亞胺，15min后，再加入31mg1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基-碳二亞胺）；在室溫下，攪拌2h，得到活化液；
b、稱取5mghb，溶于1ml0.1mph9.0碳酸鹽緩沖溶液中；在不斷攪拌下，逐滴加入活化液，室溫下，反應4h后，將反應液用0.01mph7.4的磷酸鹽緩沖液透析，即可得到hb-ova。
2、動物免疫：采用小劑量短周期方案免疫健康balb/c雌性小鼠，首次免疫用100μghb-bsa與等量弗氏完全佐劑混勻后進行皮下注射，間隔3周后，再用100μghb-bsa與等量弗氏不完全佐劑加強免疫，此后每隔3周用半量hb-bsa加強免疫一次；沖刺免疫劑量減半，與等體積的生理鹽水混合后采用腹腔免疫，用hb與雞蛋清白蛋白（ova）的偶聯(lián)物hb-ova作為包被抗原，通過間接競爭elisa檢測血清效價和抑制；
其具體elisa程序如下：
（1）包被：將包被抗原用0.05mph9.6碳酸鹽緩沖液梯度稀釋，100μl/孔，37℃孵育2h；
（2）洗滌：將板內(nèi)溶液傾去，每孔注入200μlpbst溶液，置于搖床上振蕩3min，甩干，洗滌3次；以下洗滌方法相同；
（3）封閉：拍干后，加入200μl/孔封閉液，37℃孵育2h。洗滌后烘干備用；
（4）加樣：酶標板上半部分加入0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液，50μl/孔（上半部分稱為0標），下半部分加入不同濃度的用0.01mph7.4磷酸鹽緩沖溶液稀釋的hb標準品，將抗血清從1:1000開始梯度稀釋，50μl/孔（下半部分稱為加標），上下部分對應加入不同稀釋梯度包被抗原的孔中，37℃孵育30min；充分洗滌后，加入1:3000稀釋的鼠二抗，100μl/孔，37℃孵育30min，洗滌后拍干；
（5）顯色：將酶標板取出，充分洗滌后，每孔加入100μl的顯色液（tmb與底物液比例1:5），37℃避光反應15min；
（6）終止和測定：取出酶標板，每孔加入50μl終止液（2mol/l的硫酸）終止反應，然后用酶標儀測定各孔的吸光值od450；
（7）結果判讀：以od值大于或等于陰性血清對照孔的2.1倍（即p/n≥2.1）所對應的血清最高稀釋倍數(shù)即為血清的elisa效價。上下部分對照，加標od值為0標一半的即是所加的標準品濃度；
3、細胞融合：在沖擊免疫三天后，按照常規(guī)peg（聚乙二醇，分子量為1450）方法進行細胞融合，具體步驟如下：
（1）無菌取小鼠脾臟，研磨并通過200目細胞篩網(wǎng)得到脾細胞懸液，并進行細胞計數(shù)；
（2）收集sp2/0細胞，懸浮于rpmi-1640基礎培養(yǎng)液中，進行細胞計數(shù)；
（3）將脾細胞和sp2/0細胞按照10:1（數(shù)量比）的比例混合，離心后用50%peg融合，時間1min，之后按照從慢到快，加入rpmi-1640基礎培養(yǎng)液，離心后懸浮于含20%胎牛血清、2%的50×hat的rpmi-1640篩選培養(yǎng)液中，加到96孔細胞培養(yǎng)板，置于37℃，5%co2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
4、細胞篩選與細胞株建立：在細胞融合的第三天對融合細胞進行rpmi-1640篩選培養(yǎng)液半換液，第6天進行用含20%胎牛血清、1%的100×ht的rpmi-1640過渡培養(yǎng)液進行全換液，在第9天取細胞上清進行篩選；
篩選分兩步：第一步先用間接elisa篩選出陽性細胞孔，第二步選用hb標準品，用間接競爭elisa對陽性細胞進行抑制效果測定。選出對hb標準品均具有較好抑制的孔，采用有限稀釋法進行亞克隆，用同樣的方法進行檢測。重復三次，即可得到能穩(wěn)定分泌hb單克隆抗體的細胞株。
5、單克隆抗體的制備與鑒定：取8～10周齡balb/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蠟油1ml；7天后每只小鼠腹腔注射1×106雜交瘤細胞，從第七天開始收集腹水，將腹水通過辛酸-硫酸銨法純化，獲得的單抗置于-20℃保存。
使用間接競爭elisa和間接elisa，測定單克隆抗體對hb的半數(shù)抑制率ic50為9.26ng/ml；為動物源食品中hb的快速免疫檢測提供了可能。
綜上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并非用來限定本發(fā)明的實施范圍。即凡依本發(fā)明申請專利范圍的內(nèi)容所作的等效變化與修飾，都應為本發(fā)明的技術范疇。