本發(fā)明涉及一種含有peg和/或phpma的兩親性嵌段共聚物及其制備方法和應用，該共聚物能作為藥物載體，與藥物形成聚合物-藥物偶聯(lián)物，應用于靶向尤其是腫瘤靶向給藥體系，屬于藥物輔料材料技術領域。

背景技術：

腫瘤一直是威脅人類健康的重大疾病，傳統(tǒng)的治療方法存在死亡率高，治愈率低和預后不佳等情況。然而隨著納米技術的發(fā)展，納米載藥體系能夠為抗腫瘤藥物帶來更長的血液循環(huán)時間和更低的系統(tǒng)毒性，因此通過納米藥物載體對抗腫瘤藥物進行輸送的靶向治療技術已經(jīng)成為研究人員廣泛關注的熱點問題(collinsi.,natchembiol,2006,2:689-700)。

目前，大量具有不同化學結(jié)構(gòu)或響應能力(溫度、ph、氧化還原以及酶等)的新型納米載藥體系獲得廣泛的研究(gantas.,j.controlrelease,2008,126:187-204)。但是其中多數(shù)研究只關注了納米載藥體系在腫瘤組織或腫瘤細胞內(nèi)部的藥物釋放和傳遞過程，而對藥物在血液中的運輸以及在腫瘤當中的特異性富集給予的關注略顯不足。

從實際應用來看，納米載藥體系能夠順利進入腫瘤細胞需要經(jīng)過血液運輸、血管外滲、瘤內(nèi)運輸、腫瘤細胞攝取以及細胞內(nèi)釋放等步驟(petrakk.,drugdiscov.today,2005,10:1667-1673)。對納米載藥體系在體內(nèi)的整個傳輸過程進行分析，會發(fā)現(xiàn)在整個運輸環(huán)節(jié)中，納米載藥體系在血液中的長循環(huán)和有效地腫瘤富集是實現(xiàn)納米載藥體系各種功能的前提，只有當載藥體系能夠特異性富集于腫瘤組織時才能夠有效發(fā)揮納米載藥體系的各種復雜功能。

聚合物-藥物偶聯(lián)物所構(gòu)成的膠束載藥體系作為一種常見的藥物載體，是由兩親性共聚物在水溶液中自組裝形成的具有“核-殼”結(jié)構(gòu)的分子聚集 體，其尺寸一般為10-200nm(kataokak.,adv.drugdeliver.rev.,2001,47:113-131)。通過化學鍵合載藥后，疏水性藥物在水中的溶解度提高，藥物穿過體內(nèi)某些屏障的能力也得到增強，同時藥物在體內(nèi)的分布也得到極大的改善。應用某些兩親性聚合物膠束作為藥物載體可以延長靜脈注射類藥物在人體中的循環(huán)時間。

聚乙二醇(peg)和聚n-(2’-羥基)丙基甲基丙烯酰胺(phpma)作為最常用的水溶性大分子，具有明顯的優(yōu)點：兩者都是水溶性聚合物；具有較好的生物相容性，一般不會誘導人體發(fā)生免疫反應；大分子量的peg及phpma具有epr(增強的滲透和滯留)效應，有利于提高藥物在腫瘤部位的聚集(maedah.,j.controlrelease,2000,65:271-284)。

但在利用peg和phpma制備載藥聚合物膠束時，如何提高載藥膠束防止蛋白非特異性吸附的能力，延長載藥膠束的體內(nèi)循環(huán)時間，以及提高載藥膠束的腫瘤富集能力，仍是目前領域里需要解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明在peg和phpma聚合物的基礎上，通過調(diào)整聚合物單體的種類、聚合順序和聚合度，合成了一類新的兩親性嵌段聚合物，由這類聚合物形成的膠束，在防止蛋白非特異性吸附、體內(nèi)循環(huán)時間、腫瘤富集能力上，都有較大提高。以該聚合物作為載體，進一步結(jié)合藥物、靶向分子和/或示蹤分子等，能夠形成具有生物相容性，高載藥率，控制釋放或靶向釋放的給藥系統(tǒng)或檢測試劑。

本發(fā)明提供一種兩親性嵌段聚合物，所述聚合物的結(jié)構(gòu)式如式ⅰ、式ⅱ或式iii所示：

式i聚合物的數(shù)均分子量為10000～100000；其中，鍵合藥物部分(b嵌段)的分子量為4000-15000；親水段(h嵌段)分子量為6000-96000，hpma部分占h嵌段的摩爾含量b為80-100％，magg部分占h嵌段的摩爾含量c為0-20％，azma部分占h嵌段的摩爾含量d為0-4％；并且h嵌段分子量為b嵌段分子量的1-20倍。

式i中，x和y獨立地為具有可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(raft)聚合活性、氮氧自由基聚合活性、原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合活性或開環(huán)聚合活性的引發(fā)劑基團，或者供聚合物修飾用的官能團；且當x和y同時為引發(fā)劑基團時，x與y不為同一種類型的引發(fā)劑基團。

z為-(ch2)n-，其中n為1-12的整數(shù)，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或12；或者z為一種可斷裂化學鍵。

r為可鍵合藥物的基團。

對所述式i聚合物，優(yōu)選式i聚合物數(shù)均分子量為40000-100000，進一步優(yōu)選為60000-98000，更優(yōu)選為70000-95000，最優(yōu)選為80000-90000。

優(yōu)選式i聚合物的分子量分布指數(shù)d<1.3。

優(yōu)選鍵合藥物部分(b嵌段)的分子量為4500-14000，進一步優(yōu)選為5000-13000，更優(yōu)選為5200-8000，最優(yōu)選為5500-6500。

優(yōu)選親水段(h嵌段)分子量為10000-95000，進一步優(yōu)選為 40000-94000，更優(yōu)選為70000-90000，最優(yōu)選為75000-85000。

優(yōu)選h嵌段分子量為b嵌段分子量的2-19倍，進一步優(yōu)選為4-18倍，更優(yōu)選為8-16倍。

優(yōu)選hpma部分占h嵌段的摩爾含量為81-97％，進一步優(yōu)選為82-96％，更優(yōu)選為85-95％，最優(yōu)選為90-95％。

優(yōu)選magg部分占h嵌段的摩爾含量為1-15％，進一步優(yōu)選為3-12％，最優(yōu)選為5-10％。

優(yōu)選azma部分占h嵌段的摩爾含量為2-4％。

優(yōu)選所述引發(fā)劑基團，可以是含有一個或一個以上二硫代酯基(dithioester)的基團、三硫代碳酸酯(trithiocarbonate)、磺酸酯(xanthate)或二硫代氨基甲酸酯(dithiocarbamate)的各種基團，也可以是鹵素原子，如氯原子(cl)或溴原子(br)，更優(yōu)選是含二硫代酯基或三硫代酯基的基團或溴原子。

優(yōu)選所述聚合物修飾用官能團可以是氨基、巰基、羧基、羥基、氰基、疊氮基、酰胺基、肼基等。

優(yōu)選n為2，3或4，更優(yōu)選為2，即z為-ch2-ch2-。

優(yōu)選可斷裂化學鍵是環(huán)境響應性化學鍵，例如：氧化還原響應性化學鍵、氧化響應性化學鍵、ph響應性化學鍵、酶響應性化學鍵，包括但不限于二硫鍵(-s-s-、-ch2-s-s-ch2-)(還原響應性)、-ch2-o-c(ch3)2-o-ch2-(ph響應性)、gflg四肽(gly-phe-leu-gly)以及plgiag六肽(pro-leu-gly-ile-ala-gly)(酶響應性)、-s-(氧化響應性)等。

優(yōu)選r基團為如下結(jié)構(gòu)i-v之一：

在本發(fā)明的一個實施例中，式i聚合物為ch3(ch2)11sc(＝s)s-pbhmagg6k-s-s-p(hpma-co-magg-co-azma)80k-br。

式ⅱ或式iii的聚合物，數(shù)均分子量為10000～80000；其中，peg部分的分子量為2000-10000；鍵合藥物部分(b嵌段)的分子量為4000-15000；親水段(h嵌段)分子量為4000-74000，hpma部分占h嵌段的摩爾含量b為80-100％，magg部分占h嵌段的摩爾含量c為0-20％，azma部分占h嵌段的摩爾含量d為0-4％；并且h嵌段分子量為b嵌段分子量的1-20倍。

式ii或式iii中，x為具有可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移(raft)聚合活性、氮 氧自由基聚合活性、原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合活性或開環(huán)聚合活性的引發(fā)劑基團，或者供聚合物修飾用的官能團。

r為可鍵合藥物的基團。

對所述式ii或式iii聚合物，優(yōu)選式ii或式iii聚合物的數(shù)均分子量為30000-80000，進一步優(yōu)選為40000-80000，例如可以為40000-41000，42000-45000，46000-50000，60000-65000，70000-75000，或者76000-80000等等。

優(yōu)選式ii或式iii聚合物的分子量分布指數(shù)d<1.3。

優(yōu)選peg部分的分子量為3000-9000，進一步優(yōu)選為3500-8000，更優(yōu)選為4000-7000，最優(yōu)選為4500-5500。

優(yōu)選鍵合藥物部分(b嵌段)的分子量為5000-14000，進一步優(yōu)選為5000-12000，更優(yōu)選為5000-10000，例如可以為：5000，5500，6000，6500，7000，7500，8000，8500，9000，9500，10000等等。

優(yōu)選親水段(h嵌段)分子量為10000-73000，進一步優(yōu)選為20000-72000，更優(yōu)選為25000-70000，例如可以為：25000，30000，35000，40000，45000，50000，55000，60000，65000等等。

優(yōu)選h嵌段分子量為b嵌段分子量的2-19倍，進一步優(yōu)選為3-18倍，更優(yōu)選為6-16倍。

優(yōu)選hpma部分占h嵌段的摩爾含量為81-97％，進一步優(yōu)選為82-96％，更優(yōu)選為85-95％，最優(yōu)選為90-95％。

優(yōu)選magg部分占h嵌段的摩爾含量為1-15％，進一步優(yōu)選為3-12％，最優(yōu)選為5-10％。

優(yōu)選azma部分占h嵌段的摩爾含量為2-4％。

優(yōu)選所述引發(fā)劑基團可以是含有一個或一個以上二硫代酯基(dithioester)的基團、三硫代碳酸酯(trithiocarbonate)、磺酸酯(xanthate)或二硫代氨基甲酸酯(dithiocarbamate)的各種基團，也可以是鹵素原子，如氯原子(cl)或溴原子(br)，更優(yōu)選是含二硫代酯基或三硫代酯基的基團或溴原子。

優(yōu)選所述聚合物修飾用官能團可以是氨基、巰基、羧基、羥基、氰基、 疊氮基、酰胺基、肼基等。

優(yōu)選r基團為如下結(jié)構(gòu)i-v之一：

在本發(fā)明的實施例中，式ii或式iii聚合物為：peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3、peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3、peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3、peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3、peg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-b-pbhmagg9k-sc(＝s)s(ch2)11ch3。

在本發(fā)明中，hpma代表：

magg代表：

azma代表：

式i、式ii和式iii的聚合物整體為嵌段共聚物，而在hpma、magg(drobnikj.,macromol.chem.phys.,1976,177:2833-2848)和azma(mortenf.e.,polym.chem.-uk,2013,51:5091-5099)鏈段間為無規(guī)共聚物。

對于優(yōu)選的r基團，其中結(jié)構(gòu)ⅰ為bhmagg(bredihhina.,tetrahedron,2008,64:6788-6793)含有boc基團保護的肼鍵，可以用來鍵合如阿霉素(doxorubicin)、表阿霉素(epirubicin)、吡柔比星(pirarubicin)等含有羰基的化療藥物。結(jié)構(gòu)ⅱ與結(jié)構(gòu)ⅲ(nickyc.,chem.commun.,2013,49:7534-7536)都是以hema為基礎通過酯鍵來鍵合藥物，兩種結(jié)構(gòu)的區(qū)別在于結(jié)構(gòu)ⅲ包含二硫鍵，會更有利于藥物的釋放。結(jié)構(gòu)ⅳ(kopecekj.,uspatent,5037,883)則是以gflg為基礎通過酯鍵鍵合藥物?？赏ㄟ^酯鍵鏈接的藥物包括但不限于喜樹堿(camptothecin)、紫杉醇(paclitaxel)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和7-乙基-10-羥基喜樹堿(sn38)等。結(jié)構(gòu)v可通過羥基鍵合帶有羥基或羧基的化合物，例如具有光熱性質(zhì)的近紅外染料分子(ir825)或者螯合鋅離子的原卟啉分子(protoporphyrinix)等，可分別用于光熱治療和光動力治療過程。

結(jié)構(gòu)i-v的r基團鍵合藥物之后相應的結(jié)構(gòu)式如下：

其中drug代表藥物分子。

由于不同藥物的化學結(jié)構(gòu)及抑瘤機理不同，負載不同藥物后本發(fā)明聚合物形成的載藥膠束的治療效果也不同。

本發(fā)明針對之前的共聚物體內(nèi)循環(huán)時間較短且腫瘤富集量較低的缺陷，通過將b嵌段和h嵌段單體分別聚合構(gòu)建兩親性嵌段共聚物，在此基礎上調(diào)節(jié)p、b和h嵌段的分子量和嵌段間排列順序，使形成的新聚合物相比以往的以peg和hmpa為成分的聚合物，在防止蛋白非特異性吸附、延長體內(nèi)循環(huán)時間、提高腫瘤富集能力上都得到很大改善。

在利用本發(fā)明聚合物作為藥物載體負載藥物時，可以將藥物分子通過 共價鍵直接連接到聚合物b嵌段的r基團上，除此之外，還可以利用聚合物形成膠束核層疏水段與藥物分子的疏水相互作用或者靜電作用，在聚合物膠束形成的過程中自動將藥物包覆到膠束中，即利用非共價鍵作用負載藥物，或者兩種方式結(jié)合使用。

能通過疏水作用或靜電作用包覆到膠束中，或者通過共價鍵連接到本發(fā)明聚合物上的藥物，都適用于本發(fā)明，包括小分子化合物、寡肽或蛋白質(zhì)、dna或rna等，優(yōu)選為能用于腫瘤治療的藥物，更優(yōu)選為含有羰基、羧基和/或羥基的腫瘤治療藥物，例如阿霉素、表阿霉素、吡柔比星、喜樹堿、紫杉醇、鬼臼毒素、7-乙基-10-羥基喜樹堿、protoporphyrinix、ir825等。

相較于沒有響應性化學鍵的藥物載體而言，基于式i中聚合物的帶有響應性化學鍵的藥物載體能夠在腫瘤細胞內(nèi)外環(huán)境的刺激下發(fā)生化學結(jié)構(gòu)變化，從而刺激腫瘤細胞內(nèi)吞并促進抗腫瘤藥物在細胞內(nèi)的釋放，會有更好的應用前景。例如，含有可斷裂鍵(如二硫鍵)鏈接主鏈的聚合物在形成膠束進入腫瘤細胞后，由于細胞內(nèi)環(huán)境中還原性比胞外環(huán)境高，二硫鍵易斷裂，從而使膠束解體，進而促進藥物的釋放。

此外，所述式i、式ii或式iii的聚合物可以利用其上的羧基、疊氮基等通過共價鍵連接將功能分子鍵合到聚合物h段、b段或者端基上，所述功能分子包括靶向分子和示蹤分子。

因此，本發(fā)明還保護如下的化合物：式i-藥物分子偶聯(lián)物，式ii-藥物分子偶聯(lián)物，式iii-藥物分子偶聯(lián)物。其中式i、式ii和式iii是如前所述的式i、式ii和式iii的聚合物分子，藥物分子通過共價鍵結(jié)合在聚合物分子b嵌段的r基團上。優(yōu)選結(jié)合藥物后的r基團轉(zhuǎn)換為前述的結(jié)構(gòu)i’-v’。

本發(fā)明還保護如下的化合物：式i-功能分子偶聯(lián)物，式ii-功能分子偶聯(lián)物，式iii-功能分子偶聯(lián)物。其中式i、式ii和式iii是如前所述的式i、式ii和式iii的聚合物分子，功能分子通過共價鍵結(jié)合在聚合物b嵌段的r基團上、h嵌段的magg末端羧基上、h嵌段的azma末端疊氮基上、和/或聚合物端基上，所述功能分子為靶向分子和/或示蹤分子。

進一步，本發(fā)明還保護如下的化合物：藥物分子-式i-功能分子偶聯(lián)物，藥物分子-式ii-功能分子偶聯(lián)物，藥物分子-式iii-功能分子偶聯(lián)物。其中式i、式ii和式iii是如前所述的式i、式ii和式iii的聚合物分子，藥物分子通過共價鍵結(jié)合在聚合物分子b嵌段的r基團上，功能分子通過共價鍵結(jié)合在聚合物h嵌段的magg末端羧基上、h嵌段的azma末端疊氮基上、和/或聚合物端基上，所述功能分子為靶向分子和/或示蹤分子。

所述藥物分子能通過共價鍵連接到本發(fā)明聚合物r基團上，包括小分子化合物、寡肽或蛋白質(zhì)、dna或rna等，優(yōu)選為含有羰基、羧基和/或羥基的藥物，更優(yōu)選為含有羰基、羧基和/或羥基的腫瘤治療藥物，例如阿霉素、表阿霉素、吡柔比星、喜樹堿、紫杉醇、鬼臼毒素、7-乙基-10-羥基喜樹堿、protoporphyrinix、ir825等。

所述靶向分子，可以是例如環(huán)狀rgd、葉酸、低密度脂蛋白、核酸適配體和穿膜肽等，能夠提高載藥體系的腫瘤富集能力和進入腫瘤的效率；可以是生物活性因子，如egf(上皮細胞生長因子)、vegf(血管上皮細胞生長因子)和gpcr(g蛋白偶聯(lián)受體配體)等；也可以是抗體，例如單克隆抗體，比如貝伐單抗、曲妥珠單抗等。利用配體和受體、抗體與抗原之間的特異性結(jié)合，使由上述化合物形成的載藥體系具有對細胞分子水平上的識別能力，提高靶向作用。

引入示蹤分子，可以實現(xiàn)實時跟蹤監(jiān)測的目的。所述示蹤分子包括：同位素示蹤劑、酶標示蹤劑、熒光標記示蹤劑、自旋標記示蹤劑等，例如羅丹明、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7、異硫氰酸熒光素等。

在本發(fā)明的一類實施方式中，共價結(jié)合藥物分子的本發(fā)明聚合物的結(jié)構(gòu)，即，式i-藥物分子偶聯(lián)物，式ii-藥物分子偶聯(lián)物，式iii-藥物分子偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如下：

進一步，優(yōu)選上述結(jié)構(gòu)式中藥物分子可以是阿霉素，阿霉素通過阿霉素上的羰基與b嵌段hmagg上的肼基形成腙鍵相連接。

在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方式中，共價結(jié)合了阿霉素的本發(fā)明聚合物為：peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-b-pbhmagg9k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；ch3(ch2)11sc(＝s)s-pbhmagg6k-s-s-p(hpma-co-magg-co-azma)80k-br；

其中阿霉素通過阿霉素上的羰基與b嵌段hmagg上的肼基形成腙鍵連接在上述聚合物上。

在本發(fā)明的一類實施方式中，式i-功能分子偶聯(lián)物，式ii-功能分子偶聯(lián)物，式iii-功能分子偶聯(lián)物為式i-環(huán)狀rgd，式ii-環(huán)狀rgd，式iii-環(huán)狀rgd，其中環(huán)狀rgd通過共價鍵連接在聚合物h嵌段magg末端羧基上。

在本發(fā)明的另一類實施方式中，結(jié)合了熒光物質(zhì)cy7的本發(fā)明聚合物結(jié)構(gòu)式，即，式i-功能分子偶聯(lián)物，式ii-功能分子偶聯(lián)物，式iii-功能分子偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)分別如下：

其中x、y、z和r基團的定義如前述。

進一步的，r基團優(yōu)選選自前述結(jié)構(gòu)i-v之一，偶聯(lián)藥物后r基團相應轉(zhuǎn)換為前述結(jié)構(gòu)i’-v’之一。

在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方式中，共價結(jié)合了cy7的本發(fā)明聚合物為：peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-b-pbhmagg9k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；ch3(ch2)11sc(＝s)s-pbhmagg6k-s-s-p(hpma-co-magg-co-azma)80k-br；其中cy7通過三唑基團與h嵌段azma的末端共價連接。

在本發(fā)明另一類優(yōu)選的實施方式中，藥物分子-式i-功能分子偶聯(lián)物，藥物分子-式ii-功能分子偶聯(lián)物，藥物分子-式iii-功能分子偶聯(lián)物的結(jié)構(gòu)如下：

優(yōu)選上述結(jié)構(gòu)式中藥物分子可以是阿霉素，阿霉素通過阿霉素上的羰基與b嵌段hmagg上的肼基形成腙鍵相連接。

在本發(fā)明另一優(yōu)選實施方式中，共價結(jié)合了阿霉素和cy7的本發(fā)明聚合物為：

peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；peg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-b-pbhmagg9k-sc(＝s)s(ch2)11ch3；ch3(ch2)11sc(＝s)s-pbhmagg6k-s-s-p(hpma-co-magg-co-azma)80k-br；其中阿霉素通過阿霉素上的羰基與b嵌段hmagg上的肼基形成腙鍵連接在上述聚合物上，cy7通過三唑基團與h嵌段azma的末端共價連接。

進一步，本發(fā)明提供式i、式ii或式iii的聚合物的制備方法。

嵌段共聚物的合成方法有多種，如自由基聚合、陰離子聚合、陽離子聚合、開環(huán)歧化聚合、活性自由基聚合等，或者將已經(jīng)制備好的嵌段以共價鍵偶聯(lián)，或者對嵌段聚合物進行化學改性。本領域中用于合成嵌段共聚物的方法，都能用于本發(fā)明聚合物的制備。

優(yōu)選制備本發(fā)明聚合物的方法為活性自由基聚合和開環(huán)聚合，特別是可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移聚合(raft)、氮氧自由基聚合、原子轉(zhuǎn)移自由基(atrp)聚合和開環(huán)聚合，這些方法能有效控制聚合物分子量分布。

在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，采用可逆加成-斷裂轉(zhuǎn)移聚合(raft)方法，通過對聚合物中各組分的組成比以及聚合物的分子量等因素的調(diào)節(jié)，得到聚合物組成可調(diào)、分子量可控、分子量分布窄(d<1.3)的本發(fā)明聚合物。

例如：

式i聚合物的制備方法可優(yōu)選采用下述步驟：

步驟1：在n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)的催化作用下，制備x和y之間通過-z-連接的異端官能化引發(fā)劑。

x、y和-z-的定義如前所述。

優(yōu)選所述異端官能化引發(fā)劑，一端為raft反應鏈轉(zhuǎn)移劑、另一端為atrp反應引發(fā)劑，或者一端為氮氧自由基活性(nmp)、另一端為引發(fā)開環(huán)聚合(rop)反應的引發(fā)劑。

步驟2：在氬氣或氮氣氣氛下的有機相介質(zhì)中，利用步驟1制得的異端官能化引發(fā)劑與相關單體magg、hpma、azma等進行聚合反應合成h嵌段，再在此基礎上進一步與b嵌段的單體進行聚合；或者利用步驟1制得的異端官能化引發(fā)劑與b嵌段單體進行聚合反應合成b嵌段，再在此基礎上進一步與h嵌段的單體進行聚合。

若需將鏈末端基團x或y轉(zhuǎn)化為其它可修飾用官能團，可以進一步含有步驟3，將鏈末端基團x或y轉(zhuǎn)化為其它可修飾用官能團：以raft鏈轉(zhuǎn)移劑為例，首先利用硼氫化鈉脫除鏈末端二硫代酯或三硫代酯基團，使得端基暴露出巰基，然后采用含有雙鍵的小分子功能化試劑與巰基進行michael加成反應以得到所需端基官能化的聚合物。對于端基為溴原子的聚合物而言，其轉(zhuǎn)化可通過疊氮鈉直接反應轉(zhuǎn)化為疊氮基團以進行后續(xù)修飾。

通過調(diào)整聚合先后順序可以調(diào)控聚合物的拓撲結(jié)構(gòu)。

步驟1中所述異端官能化引發(fā)劑兩端的引發(fā)分子結(jié)構(gòu)為不同聚合類型的引發(fā)劑，通過不同聚合方法實現(xiàn)-z-兩端不同聚合物嵌段的合成。

優(yōu)選步驟1中所述反應的反應溫度為室溫，反應時間為72-96小時。

步驟1所述反應在溶劑中進行，所述溶劑優(yōu)選為甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷或四氫呋喃。

優(yōu)選步驟2中所述異端官能化引發(fā)劑與所述聚合物單體的摩爾比為1:(10-1000)。

優(yōu)選步驟2中所述聚合反應的反應溫度為65-70℃，反應時間為24-48小時。

優(yōu)選步驟2中有機相介質(zhì)為dmso或dmf。

式ii或式iii聚合物的制備方法優(yōu)選可以包括下述步驟：

步驟1：在n,n’-二環(huán)己基碳二亞胺(dcc)和4-二甲氨基吡啶(dmap)的催化作用下，使末端基團為羥基或氨基的peg與含羧基的可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移試劑進行反應，得到peg大分子鏈轉(zhuǎn)移劑；

步驟2：在氬氣或氮氣氣氛下的有機相介質(zhì)中，以4,4’-偶氮二(4-腈基戊酸)(v501)為引發(fā)劑，使所述peg大分子鏈轉(zhuǎn)移劑與式ii或式iii聚合物中的單體進行活性自由基聚合反應(raft聚合)，可以先與h嵌段的單體進行聚合反應合成h嵌段，在此基礎上進一步與b嵌段的單體進行聚合；也可以先與b嵌段單體進行聚合反應合成b嵌段，在此基礎上進一步與h嵌段的單體進行聚合。

若需將鏈末端基團x轉(zhuǎn)化為其它可修飾用官能團，可以進一步含有步驟3，將鏈末端基團x轉(zhuǎn)化為其它可修飾用官能團：以raft鏈轉(zhuǎn)移劑為例，首先利用硼氫化鈉脫除鏈末端二硫代酯或三硫代酯基團，使得端基暴露出巰基，然后采用含有雙鍵的小分子功能化試劑與巰基進行michael加成反應以得到所需端基官能化的聚合物。

其中，步驟1中所述末端基團為羥基或氨基的peg，優(yōu)選一末端基團為羥基或氨基、另一末端基團為不易水解的基團的peg；優(yōu)選所述不易水解的基團為甲基、乙基、叔丁基。

優(yōu)選步驟1中所述含羧基的可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移試劑為十二烷基三硫代碳酸酯衍生物，例如2-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-2-甲基丙酸、4-(十二烷基三硫代碳酸酯基)-4-氰基戊酸等。

優(yōu)選步驟1中所述反應的反應溫度為室溫，反應時間為72-96小時。

優(yōu)選步驟1所述反應在無水溶劑中進行，所述溶劑可為甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷或四氫呋喃。

優(yōu)選步驟1所述末端基團為羥基或氨基的peg與含羧基的可逆加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移試劑的摩爾比為1:(3-5)。

優(yōu)選步驟2中所述有機相介質(zhì)為dmso或dmf。

優(yōu)選步驟2中所述peg大分子鏈轉(zhuǎn)移劑與所述聚合物單體的摩爾比可為1:(10-1000)。

優(yōu)選步驟2所述聚合反應的反應溫度為65-70℃，反應時間為24-48小時。

在利用共價鍵將藥物連入式i、式ii或式iii的聚合物時，可以根據(jù)藥物結(jié)構(gòu)以及聚合物上可鍵合藥物的基團，選擇適當?shù)幕瘜W反應。

以阿霉素(dox)為例，以鍵合藥物的基團r為結(jié)構(gòu)i為例，連接步驟可以如下：首先將聚合物溶于三氟乙酸中，室溫攪拌10-60分鐘，優(yōu)選30分鐘，脫除bhmagg側(cè)鏈的叔丁氧羰基(boc)，暴露出肼鍵；然后將脫除boc基團的聚合物溶于dmso中，在乙酸的催化下加入1-10倍摩爾量，優(yōu)選2-4倍摩爾量的dox，肼鍵與dox的羰基形成對酸敏感的腙鍵，反應條件為20-40℃，優(yōu)選30℃，避光攪拌48-72小時。

此外，可以采用本領域中常規(guī)的化學反應，在本發(fā)明的聚合物上引入功能分子。不作為對本發(fā)明保護范圍的限制，例舉兩種引入方式。

第一種是通過magg的端羧基引入功能分子。

以引入主動靶向分子環(huán)狀rgd為例，合成步驟可以如下：首先將聚合物溶解于dmf中，加入5-20倍摩爾量，優(yōu)選9-12倍摩爾量的edc·hcl與nhs攪拌，室溫下活化12-48h，優(yōu)選24h；在丙酮中沉淀，收集沉淀聚合物后再用dmf溶解，加入1-10倍摩爾量，優(yōu)選2-4倍摩爾量的環(huán)狀rgd及少量三乙胺室溫下反應36-72h，優(yōu)選48h，產(chǎn)物在水溶液中透析純化。

第二種方法是通過對聚合物主鏈端基的修飾使其轉(zhuǎn)化為可反應基團，再引入功能分子。

例如，在低溫下加入正丁基鋰，再沖入干燥的二氧化碳，將br轉(zhuǎn)化為羧基，然后在端基引入功能分子。此外，端基br還可以通過與疊氮鈉反應轉(zhuǎn)化為疊氮基團，通過點擊化學反應引入功能分子。

例如花氰染料cy7的引入方法可以如下：將聚合物與cy7溶于dmso 中，在氬氣或氮氣氣氛下凍融2-5次，優(yōu)選3次；然后在冷凍狀態(tài)及氬氣或氮氣保護下加入硫酸銅及l(fā)-抗壞血酸鈉，再次抽真空除氧，然后溶解后在30-50℃，優(yōu)選40℃，避光攪拌36-72h，優(yōu)選48h。

在端基引入功能分子對膠束的粒徑影響較小，同時膠束的形成方式使功能分子能更多的暴露在膠束表面，從而能更好地與細胞表面接觸發(fā)揮其生物功能。本領域技術人員可以根據(jù)需要，選擇引入方式。

除上述h段引入功能分子的方法之外，還可以利用本領域中常用的反應方法，在b段引入功能分子，如此一來，聚合物在體內(nèi)循環(huán)時，功能分子被保護于膠束內(nèi)部，對聚合物的循環(huán)性能產(chǎn)生更小的影響。當?shù)竭_腫瘤部位后，h段在腫瘤微環(huán)境響應下脫除，使得功能分子重新暴露出來實現(xiàn)其功能。

進一步，本發(fā)明提供所述式i、式ii或式iii的聚合物在制備藥物載體或檢測試劑中的應用，以及所述式i、式ii或式iii的聚合物作為藥物載體或檢測試劑的應用，以及式i、式ii或式iii的聚合物作為藥物載體在制備藥物中的應用。

所述藥物載體優(yōu)選是靶向藥物載體，更優(yōu)選是抗腫瘤藥物靶向藥物載體。

所述檢測試劑優(yōu)選為體內(nèi)腫瘤檢測試劑，更優(yōu)選為體內(nèi)早期腫瘤檢測試劑。

在制備藥物載體或作為藥物載體制備藥物應用時，可以將藥物分子通過共價鍵和/或非共價鍵的方式負載到本發(fā)明聚合物上。藥物分子通過共價鍵負載到本發(fā)明聚合物上的方式是，通過前述的化學反應，將藥物分子共價連接到聚合物b嵌段的r基團上。藥物分子通過非共價鍵負載到本發(fā)明聚合物上的方式是，利用聚合物形成膠束核層疏水段與藥物分子的疏水相互作用或者靜電作用，在聚合物膠束形成的過程中自動將藥物包覆到膠束中。藥物分子還可以通過所述的共價鍵和非共價鍵這兩種負載方式結(jié)合使用，負載到本發(fā)明聚合物上。

在制備或作為抗腫瘤靶向藥物載體或腫瘤檢測試劑應用時，可以將本 發(fā)明所述式i、式ii或式iii的聚合物與腫瘤靶向特異性分子反應，制備得到共價結(jié)合靶向分子的聚合物。所述靶向分子包括但不限于環(huán)狀rgd、葉酸、低密度脂蛋白、穿膜肽、核酸適配體、egf、vegf和單克隆抗體等與腫瘤細胞或血管具有特異性識別能力的功能性分子。

在制備或作為檢測試劑使用時，在聚合物中引入示蹤分子，便于跟蹤和檢測。所述示蹤分子例如：同位素示蹤劑、酶標示蹤劑、熒光標記示蹤劑、自旋標記示蹤劑等。

所述功能分子(包括靶向分子和示蹤分子)通過共價鍵，鍵合到所述式i、式ii或式iii的聚合物的h段、b段或者端基上。例如，可以通過magg的端羧基共價結(jié)合功能分子。

也可以通過對聚合物主鏈端基的修飾使其轉(zhuǎn)化為可反應基團，再引入功能分子。例如，將聚合物主鏈端基上的br轉(zhuǎn)化為羧基，而后再共價結(jié)合功能分子；或者端基br還可以通過與疊氮鈉反應轉(zhuǎn)化為疊氮基團，通過點擊化學反應引入功能分子。

在端基引入功能分子對膠束的粒徑影響較小，同時膠束的形成方式使功能分子能更多的暴露在膠束表面，從而能更好地與細胞表面接觸發(fā)揮其生物功能。在b段引入功能分子，聚合物在體內(nèi)循環(huán)時，功能分子被保護于膠束內(nèi)部，對聚合物的循環(huán)性能產(chǎn)生更小的影響，當?shù)竭_腫瘤部位后，h段在腫瘤微環(huán)境響應下脫除，使得功能分子重新暴露出來實現(xiàn)其功能。本領域技術人員可以根據(jù)需要，選擇在h段、b段或者端基上引入功能分子及相應的引入方式。

進一步，本發(fā)明提供一種藥物組合物或檢測試劑，所述藥物組合物或檢測試劑含有本發(fā)明所述的式i、式ii或式iii的聚合物，或者本發(fā)明的式i-藥物分子偶聯(lián)物，式ii-藥物分子偶聯(lián)物，或式iii-藥物分子偶聯(lián)物，或者本發(fā)明的式i-功能分子偶聯(lián)物，式ii-功能分子偶聯(lián)物或式iii-功能分子偶聯(lián)物，或者本發(fā)明的藥物分子-式i-功能分子偶聯(lián)物，藥物分子-式ii-功能分子偶聯(lián)物或藥物分子-式iii-功能分子偶聯(lián)物。

所述藥物組合物中，藥物分子共價和/或非共價結(jié)合在本發(fā)明所述的式 i、式ii或式iii的聚合物上。其中共價結(jié)合是，藥物分子共價連接在聚合物b嵌段的r基團上。非共價結(jié)合是利用聚合物形成膠束核層疏水段與藥物分子的疏水相互作用或者靜電作用，在聚合物膠束形成的過程中自動將藥物包覆到膠束中。藥物分子可以通過所述的共價結(jié)合和非共價結(jié)合兩種方式一同作用負載到本發(fā)明聚合物上。

為提高藥物的靶向性，可以進一步將靶向分子共價結(jié)合到本發(fā)明所述式i、式ii或式iii的聚合物上。所述靶向分子包括但不限于環(huán)狀rgd、葉酸、低密度脂蛋白、穿膜肽、核酸適配體、egf、vegf和單克隆抗體等與生物體內(nèi)組織、細胞具有特異性識別能力的功能性分子。

為便于跟蹤和檢測藥物在體內(nèi)的行為，可以進一步將示蹤分子共價結(jié)合到本發(fā)明所述式i、式ii或式iii的聚合物上。所述示蹤分子例如：同位素示蹤劑、酶標示蹤劑、熒光標記示蹤劑、自旋標記示蹤劑等。

所述檢測試劑中，將靶向分子和示蹤分子分別共價結(jié)合到本發(fā)明所述式i、式ii或式iii的聚合物上。通過靶向分子結(jié)合目標靶，經(jīng)由示蹤分子的顯示作用，實現(xiàn)檢測目標靶是否存在的效果。所述靶向分子包括但不限于環(huán)狀rgd、葉酸、低密度脂蛋白、穿膜肽、核酸適配體、egf、vegf和單克隆抗體等與目標組織或細胞具有特異性識別能力的功能性分子。所述示蹤分子例如：同位素示蹤劑、酶標示蹤劑、熒光標記示蹤劑、自旋標記示蹤劑等。

上述靶向分子和示蹤分子通過共價鍵，鍵合到所述式i、式ii或式iii的聚合物的h段、b段或者端基上。例如，可以通過magg的端羧基共價結(jié)合靶向分子或示蹤分子。

也可以通過對聚合物主鏈端基的修飾使其轉(zhuǎn)化為可反應基團，再引入靶向分子和示蹤分子。例如，將聚合物主鏈端基上的br轉(zhuǎn)化為羧基，而后再共價結(jié)合靶向分子或示蹤分子；或者端基br還可以通過與疊氮鈉反應轉(zhuǎn)化為疊氮基團，通過點擊化學反應引入靶向分子或示蹤分子。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1、本發(fā)明通過將b嵌段和h嵌段單體分別聚合構(gòu)建兩親性嵌段共聚物， 在此基礎上調(diào)節(jié)p、b和h嵌段的分子量和嵌段間排列順序，使本發(fā)明式i、式ii和式iii的聚合物在水溶液中發(fā)生自組裝形成尺寸較小的膠束，所述膠束有效逃脫網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)(res)的攝取。此外，所得膠束尺寸大于腎臟排出閾值，在體內(nèi)擁有很長的血液循環(huán)時間。

2、所形成的膠束體系通過epr效應富集于腫瘤組織部位，在腫瘤組織局部高濃度條件下親水鏈段之間相互作用，進一步發(fā)生聚集形成尺寸較大的多膠束聚集體，從而有效地滯留在腫瘤組織內(nèi)部，延長了在腫瘤內(nèi)部的滯留時間。

3、由本發(fā)明聚合物形成的膠束表面被長鏈peg或phpma聚合物所覆蓋，因此膠束能夠很好地防止蛋白非特異性吸附。

4、在更優(yōu)選的方案中，通過在聚合物的主鏈或側(cè)鏈引入環(huán)境響應性化學鍵，所得膠束聚集體能夠在腫瘤外基質(zhì)、腫瘤細胞質(zhì)、溶酶體或內(nèi)涵體中響應性釋放其所負載的抗腫瘤藥物。

5、在更優(yōu)選的方案中，通過在所述聚合物中進一步引入主動靶向分子或者細胞穿膜物質(zhì)，可以提高腫瘤細胞對聚合物的攝取，進一步提高聚合物在腫瘤組織的富集量。

附圖說明

圖1聚合物載體peg-b-pbhmagg-b-p(hpma-co-magg-co-azma)的合成路線

圖2聚合物的gpc曲線

圖3動態(tài)光散射(dls)測定p5-h60-b9膠束粒徑結(jié)果

圖4p5-h60-b9膠束聚集現(xiàn)象的透射電鏡(tem)照片

圖5載藥膠束在生物體內(nèi)代謝的活體成像結(jié)果

圖6載藥膠束在生物體內(nèi)代謝的光聲成像結(jié)果

圖7載藥膠束在生物體內(nèi)對腫瘤的抑制效果圖，圖中為各實驗動物體內(nèi)腫瘤塊。

圖8給藥后小鼠體重變化曲線

具體實施方式

本發(fā)明中聚合物的數(shù)均分子量及其分布用凝膠滲透色譜(gpc)和¹h核磁共振波譜(¹hnmr)來共同表征。

下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。

實施例1

peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3的制備

合成路線如圖1所示。

(1)將數(shù)均分子量為5000的羥基和甲基封端的peg10g溶于40ml甲苯，與甲苯共沸除水兩次后，加入4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-腈基戊酸3.23g，dmap0.1g，加入70ml甲苯溶解，待完全溶解后加入dcc1.98g，室溫攪拌下反應90小時。反應結(jié)束后抽濾除去環(huán)己基脲(dcu)，然后將濾液傾入過量乙醚中，收集沉淀，所得沉淀溶于少量甲苯，再用乙醚沉淀，如此重復3-5次，直至乙醚無色。將沉淀物在40℃真空干燥24小時，所得產(chǎn)物即為peg的大分子鏈轉(zhuǎn)移劑。

(2)取此大分子鏈轉(zhuǎn)移劑0.3g，bhmagg0.6g，4,4’-偶氮二(4-腈基戊酸)2mg，dmso2ml，于真空反應管內(nèi)，在冷凍下抽真空，然后恢復至室溫，充入氬氣，將此冷凍-溶化-充氬氣過程重復三次，最后在氬氣保護下將反應管置于70℃油浴中反應。終止反應時將反應管迅速放入液氮中，然后通過乙醚沉淀得到產(chǎn)物peg5k-b-pbhmagg9k。

(3)再取上一步產(chǎn)物0.1g，hpma0.36g，magg0.04g，azma0.01g，4,4’-偶氮二(4-腈基戊酸)2mg，dmso2ml，于真空反應管內(nèi)，重復上述反應步驟，反應48h后通過丙酮沉淀獲得標題終產(chǎn)物。該產(chǎn)物的分子量和組成可以通過gpc和¹hnmr來共同確認。其gpc曲線如圖2所示。

下文中將該聚合物簡稱為p5-b9-h60。

實施例2

peg5k-b-pbhmagg9k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3的制備

采用與實施例1相同的反應路線和反應條件，調(diào)整hpma、magg和azma的加入量為0.18g、0.02g以及0.005g，聚合制備得到標題終產(chǎn)物。

下文中將該聚合物簡稱為p5-b9-h30。

實施例3

peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-sc(＝s)s(ch2)11ch3的制備

采用與實施例1相同的反應路線和反應條件，調(diào)整bhmagg加入量為0.35g，聚合制備得到標題終產(chǎn)物。

下文中將該聚合物簡稱為p5-b5-h60。

實施例4

peg5k-b-pbhmagg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)30k-sc(＝s)s(ch2)11ch3的制備

采用與實施例1相同的反應路線和反應條件，調(diào)整bhmagg加入量為0.35g，hpma為0.18g，magg為0.02g，azma為0.005g，聚合制備得到標題終產(chǎn)物。

下文中將該聚合物簡稱為p5-b5-h30。

實施例5

peg5k-b-p(hpma-co-magg-co-azma)60k-b-pbhmagg9k-sc(＝s)s(ch2)11ch3的制備

調(diào)換實施例1的步驟(2)和步驟(3)的反應順序，采用與實施例1對應相同的反應條件，聚合制備得到標題終產(chǎn)物。

下文中將該聚合物簡稱為p5-h60-b9。

實施例6

ch3(ch2)11sc(＝s)s-pbhmagg6k-s-s-p(hpma-co-magg-co-azma)80k-br的制備

小分子鏈轉(zhuǎn)移劑cta-s-s-br的合成分為兩步，首先利用1.54g(10mmol)雙(2-羥基乙基)二硫醚與2.27g(10mmol)二溴異丁酰溴在1.01g(10mmol)三乙胺催化下反應合成一端為溴另一端為羥基的小分子引發(fā)劑，產(chǎn)物通過柱層析(乙酸乙酯/石油醚＝4/1)分離純化，旋蒸除去有機溶劑后得到無色或淡黃色油狀液體2g(產(chǎn)率66％)。所得產(chǎn)物進一步與2.66g(6.6mmol)4-十二烷基三硫代碳酸酯基-4-腈基戊酸在1.6gdcc和50mgdmap催化下進行酯化反應，反應完畢后過濾除去dcu，產(chǎn)物經(jīng)柱層析分離純化，最終獲得一端為raft鏈轉(zhuǎn)移劑，另一端為溴原子的雙功能化小分子引發(fā)劑。

采用實施例1相同的反應條件，通過raft合成pbhmagg6k。

嵌段p(hpma-co-magg-co-azma)通過atrp進行合成。首先取大分子鏈轉(zhuǎn)移劑pbhmagg6k0.06g，hpma0.7g，magg0.07g，azma0.03g，配位劑1,4,8,11-四甲基-l,4,8,ll-四氮雜環(huán)四癸烷(me4cyclam)20mg，dmso3ml，于真空反應管內(nèi)，在冷凍下抽真空，然后恢復至室溫，充入氬氣，將此冷凍-溶化-充氬氣過程重復兩次，然后冷凍樣品，在氬氣保護下加入18mgcubr，再次冷凍抽真空，最后在氬氣保護下將反應管置于70℃油浴中反應。后續(xù)產(chǎn)物處理同實施例1。

下文中將該聚合物簡稱為b6-h80。

實施例7、制備負載dox的聚合物

分別取100mg實施例1-6制備的聚合物各溶于5ml三氟乙酸中，室溫攪拌30分鐘后旋蒸除去三氟乙酸，產(chǎn)物溶于10ml無水dmso中，加入三倍摩爾量的dox和催化量的冰醋酸，37℃攪拌反應48-72小時，反應完畢后在水中透析出去游離的dox，分別制備獲得實施例1-6的各聚合物負載dox的產(chǎn)物。

實施例8、制備cy7標記的聚合物

分別取實施例7制備的各負載dox聚合物50mg、配位劑n,n,n',n,'n”- 五甲基二亞乙基三胺(pmdeta)3mg與3mgcy7溶于dmso中，在氬氣氣氛下凍融3次；然后在冷凍狀態(tài)及氬氣保護下加入4.3mg五水硫酸銅及3.4mgl-抗壞血酸鈉，再次抽真空除氧，溶解后在40℃避光攪拌48h。反應完畢后在水中透析除去未反應cy7和催化劑，分別制備獲得實施例1-6的各聚合物負載dox的cy7標記產(chǎn)物。

實施例9、膠束的制備及膠束粒徑的測定

分別取實施例8所制備的聚合物10mg，溶于1mldmso中，然后緩慢滴入10mlpbs緩沖液中，攪拌速度100rpm，然后透析三天以除去有機溶劑得到膠束溶液，置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

膠束的粒徑通過動態(tài)光散射(dls)進行測定，dls在英國馬爾文(malvern)公司的zetasizernanozs上測定。取1.2ml膠束溶液于石英比色皿中，放入儀器中于25℃穩(wěn)定2min后測量三次取平均值。dls測定的膠束粒徑結(jié)果以圖3所示的p5-h60-b9的膠束為代表予以展示。

同時還利用透射電鏡(tem)對膠束進行觀察。首先將20μl的膠束樣品(0.2mg/ml)滴在銅網(wǎng)支撐膜上，室溫過夜干燥后在銅網(wǎng)表面滴加5μl磷鎢酸染色液，干燥后即得到tem樣品。透射電鏡在jeol公司的jem-2200fs上測定，加速電壓為200kv。在tem中可以明顯的觀察到膠束的聚集現(xiàn)象，以圖4所示的p5-h60-b9的膠束為代表予以展示。

從圖3可見，本發(fā)明的兩親性嵌段聚合物形成膠束的粒徑主要在5-40nm之間，由于親水鏈段間的相互作用，所形成的小膠束發(fā)生進一步聚集形成多膠束聚集體，如圖4所示。

實施例10、載藥膠束在生物體內(nèi)分布的活體成像實驗

在此實施例中，使用負載小鼠乳腺癌(4t1)腫瘤細胞的balb/c小鼠作為動物模型。為了獲得荷瘤鼠，在小鼠背部通過皮下注射注入1×10⁶個提前培養(yǎng)好的4t1細胞。經(jīng)過10天左右的生長，當固體瘤體積達到50-100mm³時，小鼠即可用于動物實驗。

在此實施例中，3只balb/c荷瘤鼠作為一組進行載藥膠束生物體內(nèi)活體 成像實驗。分別將實施例8所制備的p5-b9-h60、p5-b5-h60、p5-b5-h30、p5-h60-b9、b6-h80載藥膠束通過尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，小鼠在1h、3h、6h、9h、12h、24h和48h時通過異氟烷進行麻醉后，放入活體成像儀(perkinelmer,u.s.a)中進行成像分析。待膠束注射48h后，通過頸椎錯位處死小鼠，解剖小鼠獲得小鼠腫瘤及主要臟器，再次通過活體成像儀進行分析。

成像結(jié)果如圖5所示。從整體活體成像結(jié)果可見，隨著時間的延長，載藥膠束在體內(nèi)的分布逐漸由全身的血液循環(huán)慢慢聚集到腫瘤上。48h后臟器的活體成像結(jié)果顯示，載藥膠束在腫瘤中的富集度最高，其次是在血管組織豐富的器官—肝臟、腎臟、肺、脾有存留，其中以肝臟最多，血液中也仍有膠束的顯像。由此可見，本發(fā)明的載藥膠束在體內(nèi)擁有很長的血液循環(huán)時間，并且能夠通過epr效應富集于腫瘤組織部位。

實施例11、載藥膠束在生物體內(nèi)分布的光聲成像實驗

在此實施例中，使用的荷瘤鼠獲得方法與實施例10相同。將實施例8所制備的載藥膠束通過尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，小鼠在6h、12h和24h時通過異氟烷進行麻醉后，放入實時多光譜光聲成像儀(itheramedicalgmbh,neuherberg,germany)中進行掃描，選取680、720、750、770、800、830六個檢測波長，掃描的4個截面厚度均為0.3mm，可以實時檢測到肝臟、脾臟、腎臟、腫瘤和血管中的熒光信號。

成像結(jié)果如圖6所示。從圖中可見，隨著時間的延長，載藥膠束在體內(nèi)的分布逐漸由全身的血液循環(huán)慢慢聚集到腫瘤上。12-24h的圖像中，腫瘤中的熒光信號逐漸增強，說明載藥膠束富集到腫瘤中。由此可見，本發(fā)明的載藥膠束能夠通過epr效應富集于腫瘤組織部位。此外，24h的圖像中，肝臟、脾臟、腎臟和血管中仍然能檢測到熒光信號，說明載藥膠束在體內(nèi)循環(huán)保留時間很長。

實施例12、載藥膠束在生物體內(nèi)對腫瘤的抑制效果的測定

在此實施例中，使用的荷瘤鼠獲得方法與實施例10相同。每5只balb/c 荷瘤鼠作為一組進行腫瘤的抑制實驗。分別取100μl實施例7所制備的p5-b9-h60、p5-b5-h60、p5-h60-b9、b6-h80各載藥膠束通過尾靜脈注射進入小鼠體內(nèi)，給藥量為5mg/kg小鼠體重(以dox量計)，每4天給藥一次，共給藥4次。同時選擇注射生理鹽水和游離dox溶液(5mg/kg體重)的兩組實驗作為對照組，給藥時間相同。在第17天實驗結(jié)束后，通過頸椎錯位處死小鼠，解剖小鼠獲得小鼠腫瘤及主要臟器，通過切片進行病理分析，腫瘤的抑制效果可以直觀通過肉眼觀察得出結(jié)論，如圖7所示。

從圖7中可見，載藥膠束組和游離dox溶液組的腫瘤體積小于生理鹽水對照組的，其中b6-h80、p5-h60-b9、p5-b9-h60組的腫瘤體積又明顯小于生理鹽水對照組的，而部分載藥膠束組的腫瘤體積又小于游離dox溶液組的。同時從圖8中可見，游離dox組小鼠體重發(fā)生明顯下降，表明游離dox毒性較大，而載藥膠束組小鼠體重與生理鹽水組差別不大，表明用本發(fā)明的聚合物作為藥物載體給予dox能有效降低dox的毒性，同時也佐證了載藥膠束的腫瘤富集和響應性釋藥能力。綜上所述，將dox負載到本發(fā)明的載藥膠束上，不會影響dox的藥物活性，而通過載藥膠束的靶向給藥，實現(xiàn)藥物的腫瘤內(nèi)富集，在抑制腫瘤生長的同時還能明顯降低藥物的毒副作用。