本發(fā)明涉及生物治療與生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種腫瘤特異性重組水蛭素及其制備方法和用途。
背景技術(shù)：
水蛭素是迄今發(fā)現(xiàn)的活性最強(qiáng)的天然凝血酶特異性抑制劑，最初從醫(yī)用水蛭唾液腺中分離得到，由65～66個(gè)氨基酸組成，可直接與凝血酶以l：l(摩爾比)的方式結(jié)合形成非共價(jià)復(fù)合物，從而使凝血酶失去裂解纖維蛋白原的能力，抑制血栓的形成。天然水蛭素存在十種以上變體，主要有簡(jiǎn)稱為hv1、hv2、hv3三種同源性很高的異構(gòu)體(hirudinvariant)。
目前，國外已有兩個(gè)重組水蛭素產(chǎn)品被批準(zhǔn)上市：1.desirudin(商品名：revasc，瑞士novartis產(chǎn)品)，2.lepirudin(商品名：refludan，英國pharmion及美國berlexlaboratories產(chǎn)品)。兩者結(jié)構(gòu)上僅在n-端存在微小差異，desirudin為val1-val2，而lepirudin為leu1-tyr2。desirudin用于手術(shù)時(shí)深度靜脈血栓(dvt)的預(yù)防與治療，lepirudin用于肝素誘導(dǎo)的血小板減少性疾病患者的抗凝治療。此外，水蛭素在防治不穩(wěn)定性心絞痛、彌散性血管內(nèi)凝血、腦血栓、血栓靜脈炎及冠狀動(dòng)脈血栓等方面都具有巨大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。
在多種惡性腫瘤患者中存在著血液高凝狀態(tài)，如肺癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌等。惡性腫瘤患者血液中的高凝狀態(tài)，不僅能促進(jìn)體內(nèi)血栓形成，而且與腫瘤生長、侵襲以及轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)。凝血功能變化可引起腫瘤細(xì)胞表型和活性改變，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、纖維結(jié)合蛋白(fibrinectin)以及vonwillebrandfactor(vwf)的黏附，從而使腫瘤細(xì)胞在局部增殖、浸潤甚至向其他部位轉(zhuǎn)移。血栓性疾病是惡性腫瘤患者第二大致死因素，僅次于腫瘤轉(zhuǎn)移。對(duì)血栓形成高危腫瘤患者及早進(jìn)行藥物性干預(yù)，對(duì)于延長患者生存期、降低死亡率有重要意義。研究表明，水蛭素在腫瘤治療中也能發(fā)揮作用。重組水蛭素通過其抗凝作用，抑制纖維蛋白的形成，能防止腫瘤細(xì)胞與血纖維蛋白或血小板凝集，使nk細(xì)胞或其他細(xì)胞毒效應(yīng)細(xì)胞的活性得以發(fā)揮。已證明水蛭素治療可發(fā)揮療效的腫瘤有纖維肉瘤、骨肉瘤、血管肉瘤、黑素瘤和白血病等。水蛭素還可配合化療和放療，通過促進(jìn)腫瘤中的血流、改善乏氧狀態(tài)而增強(qiáng)療效。
動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究表明，靜脈或皮下注射水蛭素均無明顯毒副作用，半致死劑量遠(yuǎn)大于治療所需劑量，機(jī)體易接受，免疫性弱，不影響血小板、纖維蛋白原水平和血紅蛋白含量，不易通過血腦脊液屏障。無論急性、亞急性的毒性試驗(yàn)，水蛭素對(duì)呼吸、血壓、心率均不影響。水蛭素在體內(nèi)無降解，以活性成分經(jīng)腎臟排泄。
水蛭素作為一種高效、直接、特異的凝血酶抑制劑，具有很強(qiáng)的抗凝、抗血栓以及抗炎等多種藥理活性。與肝素等傳統(tǒng)的抗凝藥物相比，其治療劑量小、療效高、不會(huì)引起過敏反應(yīng)。水蛭素有抗原性，但其抗體沒有害，反而延長消除半衰期，是一種少見的正效果抗體。因此水蛭素的應(yīng)用將會(huì)不斷得到開拓和推廣，重組水蛭素將會(huì)成為新一代的抗凝、抗栓和抗腫瘤新藥。但是，水蛭素又可導(dǎo)致凝血相關(guān)參數(shù)，如活化部分凝血活酶時(shí)間(aptt)、凝血酶時(shí)間(tt)和凝血酶原時(shí)間(pt)等明顯升高，從而可能引起全身或系統(tǒng)性出血風(fēng)險(xiǎn)。臨床上，作為一個(gè)理想的抗凝藥物，在全身用藥條件下，應(yīng)當(dāng)具有明確的抗凝、抗栓效果，但又不引起出血副作用，尤其是在以治療腫瘤為目的的臨床應(yīng)用時(shí)，其理想的工作狀態(tài)為靶向性的在腫瘤局部發(fā)揮抗凝、抗栓、抗腫瘤作用，從而使臨床用藥安全性提高。在腫瘤治療領(lǐng)域，如何進(jìn)一步減少水蛭素的副作用，增加其腫瘤治療靶向性是值得探討的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤特異性重組水蛭素及表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，至少能夠解決上述問題之一。
本發(fā)明思想的指導(dǎo)原則的關(guān)鍵是構(gòu)建水蛭素衍生物，使水蛭素抗凝活性進(jìn)行腫瘤靶向性釋放，即在正常條件下，該水蛭素衍生物無抗凝活性，而當(dāng)位于腫瘤位置時(shí)，該水蛭素衍生物的抗凝活性才在腫瘤局部釋放，營造不易形成血栓的微環(huán)境，甚至溶解已形成的微小栓子以達(dá)到抗凝、溶栓、防止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能。這就克服了野生型水蛭素全身用藥引起系統(tǒng)性出血的風(fēng)險(xiǎn)。
基質(zhì)金屬蛋白酶(mmps)是一類以無活性酶原形式分泌的zn2+依賴性肽鏈內(nèi)切酶家族，是構(gòu)成胞外基質(zhì)降解最重要的蛋白水解系統(tǒng)。mmp9即基質(zhì)金屬蛋白酶9，是其家族的重要成員。能夠降解腫瘤微環(huán)境中的多種蛋白膠原，促進(jìn)腫瘤侵襲。大量的實(shí)驗(yàn)研究表明，mmp9在癌細(xì)胞的快速增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移的過程中起到很重要的作用。mmp9通過以下方式促進(jìn)腫瘤浸潤及轉(zhuǎn)移：降解ecm的分子物質(zhì)；調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附性；配合其他酶類降解血管基底膜和血管周圍基質(zhì)。這是血管樹生長的重要條件，只有通過降解過程，內(nèi)皮細(xì)胞才能遷移入周圍組織，并逐漸形成血管樹，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。mmp9酶與底物作用后可使明膠中g(shù)ly-ile之間的肽鍵斷裂。
水蛭素是由65～66個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽，其n末端可以與凝血酶催化活性位點(diǎn)結(jié)合，具有抗凝活性，c末端與凝血酶的底物識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)凝血酶有很強(qiáng)的特異性親和作用。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一個(gè)封閉水蛭素n末端的措施，以達(dá)到降低該水蛭素衍生物的抗凝活性的目的，同時(shí)還具有腫瘤靶向?qū)さ墓δ堋．?dāng)該水蛭素衍生物位于腫瘤微環(huán)境使時(shí)，利用腫瘤微環(huán)境中富含mmp9酶特點(diǎn)，使該水蛭素衍生物n末端被封閉的水蛭素重新回復(fù)為水蛭素原形，在腫瘤局部發(fā)揮特異性靶向抗凝作用，從而成為一類新型、安全、有效的腫瘤靶向性抗凝、抗癌劑。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種腫瘤特異性重組水蛭素，重組水蛭素的n末端含有可被mmp9識(shí)別并裂解的寡肽序列，用于重組的水蛭素為水蛭素異構(gòu)體、水蛭素突變體、截短的水蛭肽、基因修飾的水蛭素或水蛭素融合蛋白。
進(jìn)一步的，寡肽序列為可被mmp9識(shí)別并裂解的短肽，其結(jié)構(gòu)特征為xngi，xn代表任意數(shù)量的任意氨基酸。
重組水蛭素是在水蛭素異構(gòu)體hv2或hv3的n末端修飾有寡肽plg，與水蛭素異構(gòu)體hv2或hv3的n末端序列i共同組成mmp9識(shí)別并酶切的底物肽序列plgi，重組水蛭素plg-hv2氨基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2，重組水蛭素plg-hv3氨基酸序列為：seqidno.3，基因序列為：seqidno.4；
或者，所述重組水蛭素，是人白蛋白與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv2或hv3通過寡肽plg連接而成的融合蛋白hph2，或hph3，hph2氨基酸序列為：seqidno.17，基因序列為：seqidno.18，hph3氨基酸序列為：seqidno.19，基因序列為：seqidno.20；
或者，所述重組水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白fc段與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv2或hv3通過寡肽plg連接而成的融合蛋白fph2，或fph3，人嵌合免疫球蛋白fc段包含人igg4鉸鏈區(qū)、fc段序列和igm尾片序列，fph2氨基酸序列為：seqidno.21，基因序列為：seqidno.22，fph3氨基酸序列為：seqidno.23，基因序列為：seqidno.24。
腫瘤細(xì)胞能夠營造腫瘤微環(huán)境，通過分析腫瘤微環(huán)境的特點(diǎn)，可以找到腫瘤靶向性的靶標(biāo)。研究表明αvβ3在多種腫瘤細(xì)胞如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤及浸潤性黑色素瘤等表面高表達(dá)。在腫瘤組織新生血管內(nèi)皮細(xì)胞中強(qiáng)烈表達(dá)，在成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞和絕大多數(shù)正常組織中αvβ3的表達(dá)水平很低。在腫瘤組織中，腫瘤細(xì)胞分泌的生長因子使上皮細(xì)胞活化，其中整合素αvβ3的表達(dá)水平很高，這使得αvβ3成為腫瘤靶向治療的一個(gè)理想位點(diǎn)。與正常組織血管系統(tǒng)相比，腫瘤組織大量表達(dá)αvβ3，αvβ3在腫瘤組織新生毛細(xì)血管系統(tǒng)中的表達(dá)水平比正常組織高出很多。整合素αvβ3能識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，與其特異性結(jié)合，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的粘附與遷移，在腫瘤的生長、浸潤、轉(zhuǎn)移尤其是血管生成中發(fā)揮重要作用。αvβ3能夠與多種含有rgd序列的蛋白結(jié)合，例如玻璃體結(jié)合蛋白、纖維結(jié)合蛋白、纖維蛋白素原、凝血酶敏感素及一些模擬rgd序列的內(nèi)源性蛋白。一些設(shè)計(jì)的抗體或小分子量的αvβ3拮抗劑，在體內(nèi)模型中能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞與玻璃體結(jié)合蛋白之間的粘附，腫瘤的血管發(fā)生明顯減少。
在以往研究中，rgd序列常被作為靶向藥物的載體，將藥物靶向到表達(dá)整合素αvβ3的腫瘤血管系統(tǒng)去。rgd序列是作為纖維結(jié)合蛋白與細(xì)胞的結(jié)合位點(diǎn)被發(fā)現(xiàn)的，其基本識(shí)別位點(diǎn)由arg-gly-asp三個(gè)氨基酸組成。在rgd衍生物中，c(rgdfk)常被作為藥物的載體，因?yàn)橘嚢彼釟埢鵮是最理想的能夠同其他化學(xué)物質(zhì)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)的基團(tuán)。人們運(yùn)用噬菌體技術(shù)發(fā)現(xiàn)了另外一種能和αvβ3特異性結(jié)合的rgd配體：含兩個(gè)二硫鍵的rgd序列(acdcrgdcfcg)，人們稱其為rgd4c。其結(jié)合能力是含一個(gè)二硫鍵rgd序列的20倍，是通常線性rgd序列的200倍。rgd4c的缺點(diǎn)是能夠形成不同的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，如果形成了附加的單環(huán)和二環(huán)結(jié)構(gòu)，則其結(jié)合能力降低10倍。二者相比，c(rgdfk)穩(wěn)定性較好而且容易與其他化學(xué)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)，更適合作為化學(xué)偶聯(lián)的載體。而rgd4c則適合作為運(yùn)用重組技術(shù)設(shè)計(jì)的靶向藥物載體。
進(jìn)一步的，重組水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽rgd4c與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv2或hv3通過linker和寡肽plg連接而成的融合蛋白rph2，或rph3，rph2氨基酸序列為：seqidno.13，基因序列為：seqidno.14，rph3氨基酸序列為：seqidno.15，基因序列為：seqidno.16。
目前已經(jīng)了解，水蛭素分子的n末端是其核心部分，含三對(duì)二硫鍵(cys6-cys14，cys16-cys28，cys32-cys39)，使n末端肽鏈繞迭成密集形核心環(huán)肽結(jié)構(gòu)，與凝血酶的催化活性位點(diǎn)結(jié)合；而c末端為一無規(guī)則伸展的鏈狀結(jié)構(gòu)，其中g(shù)ln49～gly54有空間和疏水作用，而asp55～pro60富含酸性氨基酸，帶有負(fù)電荷，易與凝血酶堿性的底物識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合。hv1/hv2的ser32-asp33-gly34-glu35(sdge)或hv3的ser32-asn33-gly34-lys35(sngk)為一突出于β-折疊間的loop結(jié)構(gòu)，構(gòu)象自由，對(duì)活性無明顯作用。根據(jù)水蛭素的以上特性，將野生型水蛭素(hv2/hv3)肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)。rgd序列由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成，存在于多種細(xì)胞外基質(zhì)中，可與整合素αvβ3特異性結(jié)合。經(jīng)過rgds或rgdm修飾的重組水蛭素可以更好的靶向腫瘤微環(huán)境的整合素αvβ3，通過mmp9蛋白酶將水蛭素釋放出來，發(fā)揮抗凝、抗栓和抗腫瘤作用。
進(jìn)一步的，所述重組水蛭素，是將野生型水蛭素hv2或hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-ser35，再在其n末端修飾plg寡肽，所述重組水蛭素plg-hv2-rgds氨基酸序列為：seqidno.5，基因序列為：seqidno.6，重組水蛭素plg-hv3-rgds氨基酸序列為：seqidno.7，基因序列為：seqidno.8；
或者，所述重組水蛭素，是將野生型水蛭素hv2或hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-met35，再在其n末端修飾plgl寡肽，所述重組水蛭素plg-hv2-rgdm氨基酸序列為：seqidno.9，基因序列為：seqidno.10，重組水蛭素plg-hv3-rgdm氨基酸序列為：seqidno.11，基因序列為：seqidno.12。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述腫瘤特異性重組水蛭素的制備方法，包括以下步驟：化學(xué)合成上述腫瘤特異性重組水蛭素基因片段，在其n末端連接信號(hào)肽序列，并在重組編碼基因的兩端添加限制性酶切位點(diǎn)，將重組編碼基因插入基因載體中制備重組載體，用該重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從中回收和純化該腫瘤特異性重組水蛭素，宿主細(xì)胞為大腸桿菌、乳酸菌、酵母菌、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述的腫瘤特異性重組水蛭素在制備抗凝、抗血栓、防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物、保健品和功能性食品中的應(yīng)用。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了表達(dá)上述腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞制備方法，體外培養(yǎng)人源免疫細(xì)胞，將人源分泌型信號(hào)肽編碼基因與上述的腫瘤特異性重組水蛭素的編碼基因相連，并在重組編碼基因的兩端添加限制性酶切位點(diǎn)，將編碼基因插入載體中制備成重組基因載體，轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞，獲得表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞。
進(jìn)一步的，人源分泌型信號(hào)肽為人酰胺化酶信號(hào)肽，氨基酸序列為：seqidno.25，基因序列為：seqidno.26。
進(jìn)一步的，免疫細(xì)胞為αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一種或多種，所述免疫細(xì)胞為人源免疫細(xì)胞。
進(jìn)一步的，過繼免疫細(xì)胞的膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面。
進(jìn)一步的，靶標(biāo)分子為cd19的全長或其截短片段，或cd20的全長或其截短片段。
進(jìn)一步的，靶標(biāo)分子及跨膜段的結(jié)構(gòu)為：gm-csfr信號(hào)肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段，其氨基酸序列為：seqidno.27，基因序列為seqidno.28。
以過繼免疫細(xì)胞為載體，在腫瘤患者體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素，發(fā)揮“微型細(xì)胞藥廠”的作用，既將細(xì)胞過繼免疫治療技術(shù)與腫瘤靶向性重組水蛭素的防栓抗癌功能整合，更好的發(fā)揮抗腫瘤作用，又可通過在體內(nèi)長期穩(wěn)定表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素，避免反復(fù)注射腫瘤特異性重組水蛭素引起潛在的過敏反應(yīng)。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的應(yīng)用，用于抗凝、抗血栓、防治腫瘤的生物治療，尤其是防治伴有高凝狀態(tài)和/或血栓的腫瘤患者的生物治療。
本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明的腫瘤特異性重組水蛭素的n末端含有可被mmp9識(shí)別并酶切的短肽，可以封閉水蛭素n末端的凝血酶催化活性位點(diǎn)，以達(dá)到降低該水蛭素衍生物的抗凝活性、減少出血副作用的目的，同時(shí)還具有腫瘤靶向?qū)さ墓δ?。?dāng)該水蛭素衍生物位于腫瘤微環(huán)境使時(shí)，利用腫瘤微環(huán)境中的富含mmp9酶特點(diǎn)，特異性切除該水蛭素衍生物n末端的封閉肽，使被封閉的水蛭素重新回復(fù)為水蛭素原形，在腫瘤局部發(fā)揮特異性抗凝作用，從而成為一類新型、安全、有效的腫瘤靶向性抗凝、抗栓和抗癌劑。本發(fā)明更進(jìn)一步的提供了表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的免疫細(xì)胞，通過以過繼免疫細(xì)胞為載體，在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素，可解決水蛭素半衰期短的弊端，無需短時(shí)間內(nèi)反復(fù)給藥，可避免反復(fù)給藥引起過敏或誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生，更加適合需要長期抗凝、抗栓的腫瘤患者。表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞可靶向腫瘤局部表達(dá)，改善腫瘤患者高凝狀態(tài)，溶解微血栓，防止腫瘤轉(zhuǎn)移，促進(jìn)免疫細(xì)胞進(jìn)入腫瘤內(nèi)部發(fā)揮殺傷功能，可單獨(dú)應(yīng)用或臨床配合化/放療使用。
具體實(shí)施方式
下面對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
本發(fā)明的腫瘤特異性重組水蛭素的的n末端含有可被mmp9識(shí)別并裂解的寡肽序列，，用于重組的水蛭素為水蛭素異構(gòu)體、水蛭素突變體、截短的水蛭肽或水蛭素融合蛋白。寡肽序列為可被mmp9識(shí)別并酶切的短肽，其結(jié)構(gòu)特征為xngi，xn代表任意數(shù)量的任意氨基酸。
天然水蛭素有多種異構(gòu)體，其中三種主要異構(gòu)體分別為hirudinvariant1(hv1)、hirudinvariant2(hv2)、hirudinvariant3(hv3)。
hv2和hv3的n末端氨基酸為i，mmp9的生理底物序列為gi，酶切后斷裂點(diǎn)位為g↓i。在hv2或hv3的n末端連接上plg短肽，或其它xxxg型具有同等功效的短肽，與hv2或hv3的n末端的i共同組成mmp9的底物序列，當(dāng)被mmp9自g和i之間裂解后，可完整釋放水蛭素的抗凝活性。
進(jìn)一步的，重組水蛭素的末端還連接有用于靶向整合素αvβ3的多肽，該多肽包含rgd序列。則可使上述水蛭素衍生物更好的靶向腫瘤微環(huán)境的整合素αvβ3。具體的rgd序列為rgd4c序列。當(dāng)rgd4c導(dǎo)向載體與腫瘤細(xì)胞表面αvβ3結(jié)合后，通過mmp9將水蛭素原形釋放出來，發(fā)揮抗凝、抗栓和抗腫瘤作用。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述腫瘤特異性重組水蛭素的制備方法，包括以下步驟：化學(xué)合成上述腫瘤特異性重組水蛭素基因片段，在其n末端連接信號(hào)肽，并在重組編碼基因的兩端添加限制性酶切位點(diǎn)，將重組編碼基因插入基因載體中制備重組載體，，用該重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，并從中回收和純化該腫瘤特異性重組水蛭素，宿主細(xì)胞為大腸桿菌、乳酸菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
用于重組的載體優(yōu)選的為真核表達(dá)載體，優(yōu)選的為ppic9k。宿主細(xì)胞優(yōu)選的為甲醇營養(yǎng)型酵母菌株gs115。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述的腫瘤特異性重組水蛭素在制備抗凝、抗血栓、防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物、保健品和功能性食品中的應(yīng)用。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了表達(dá)上述腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞制備方法，將人源分泌型信號(hào)肽編碼基因與上述的腫瘤特異性重組水蛭素的編碼基因相連，制備成重組基因載體，轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞，獲得表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞。
該過繼免疫細(xì)胞的膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面，腫瘤特異性重組水蛭素直接表達(dá)或通過偶聯(lián)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。靶標(biāo)分子為cd19的全長或其截短片段，或cd20的全長或其截短片段。
本發(fā)明表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞，腫瘤特異性重組水蛭素可以組成性表達(dá)，也可以偶聯(lián)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。偶聯(lián)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以是四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、蛻皮激素(ecdysone)誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)、他克莫司(tacrolimus，fk506)/雷帕霉素(rapamycin)誘導(dǎo)系統(tǒng)或ru486誘導(dǎo)系統(tǒng)。免疫細(xì)胞可以是αβt、γδt、nkt、nk、dc、cik、car-t、car-nk、tcr-t中的一種或多種，免疫細(xì)胞為人源免疫細(xì)胞。
表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞還表達(dá)自殺基因/前藥系統(tǒng)。自殺基因/前藥系統(tǒng)為單純皰疹病毒1型胸腺嘧啶激酶/戊環(huán)鳥苷(hsv-tk/gcv)系統(tǒng)、帶狀皰疹病毒胸腺嘧啶激酶/阿糖甲氧基嘌呤(vzv-tk/ara-m)系統(tǒng)、胞嘧啶脫氨酶/5氟胞嘧啶(cd/5fc)系統(tǒng)、細(xì)胞色素p450微粒體酶cyp2b1/環(huán)磷酰胺(cyp2b1/cpa)系統(tǒng)；細(xì)胞色素p450cyp4b1/氨基蒽(cyp4b1/2aa)系統(tǒng)、脫氧胞苷激酶/阿糖胞苷(dck/ara-c)系統(tǒng)、烏苷-黃嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶/6-硫黃嘌呤(gpt/6tx)系統(tǒng)、硝基還原酶/cb1954(ntr/cb1954)系統(tǒng)、嘌呤核苷磷酸化酶/6-甲基嘌呤脫氧核苷(pnp/6-mep-dr)系統(tǒng)、胸腺嘧啶磷酸化酶/5’-脫氧-5-氟尿嘧啶(tp/5’-dfur)系統(tǒng)、羧基肽酶g2/cmda系統(tǒng)(cpg2/cmda)、羧酸酯酶/cpt-11(ce/cpt-11)系統(tǒng)中的一種。
上述的表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：制備編碼腫瘤特異性重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體，基因載體中包括(信號(hào)肽序列-腫瘤特異性重組水蛭素序列)和(信號(hào)肽序列-靶標(biāo)分子序列-linker-跨膜段序列)兩段基因序列；將上述編碼腫瘤特異性重組水蛭素和靶標(biāo)分子的基因載體通過基因工程技術(shù)轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞。
基因工程技術(shù)為公知技術(shù)，所用基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)包括慢病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、腺病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、睡美人轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。優(yōu)選的，采用睡美人轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)染系統(tǒng)或電轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。以瞬時(shí)表達(dá)載體，將腫瘤特異性重組水蛭素基因?qū)脒^繼免疫細(xì)胞，可使其外源基因表達(dá)量可控，避免過量表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。
編碼腫瘤特異性重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體的結(jié)構(gòu)為：信號(hào)肽-腫瘤特異性重組水蛭素-ires-信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段，或者，信號(hào)肽-靶標(biāo)分子-linker-跨膜段-p2a-信號(hào)肽-腫瘤特異性重組水蛭素。
相應(yīng)地，本發(fā)明還提供了上述表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞的應(yīng)用，用于抗凝、抗血栓、防治腫瘤的生物治療，尤其是防治伴有高凝狀態(tài)和/或血栓的腫瘤患者的生物治療。
下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
實(shí)施例1
本實(shí)施例中重組水蛭素是在水蛭素異構(gòu)體hv2的n末端修飾有寡肽plg，與水蛭素異構(gòu)體hv2的n末端序列i共同組成mmp9識(shí)別并裂解的底物肽序列plgi，腫瘤特異性重組水蛭素plg-hv2，氨基酸序列為：seqidno.1，基因序列為：seqidno.2。
其中，plgi可被其它mmp9識(shí)別并酶切底物肽序列替換，其共同特點(diǎn)為包含有g(shù)i序列，以保證經(jīng)mmp9識(shí)別并酶切后，釋放的水蛭素n末端的氨基酸為i。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例2
本實(shí)施例中重組水蛭素是在水蛭素異構(gòu)體hv3的n末端修飾有寡肽plg，與水蛭素異構(gòu)體hv3的n末端序列i共同組成mmp9識(shí)別并酶切的底物肽序列plgi，重組水蛭素plg-hv3，氨基酸序列為：seqidno.3，基因序列為：seqidno.4。
其中，plgi可被其它mmp9識(shí)別并酶切底物肽序列替換，其共同特點(diǎn)為包含有g(shù)i序列，以保證經(jīng)mmp9酶切后，釋放的水蛭素n末端的氨基酸為i。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例3
本實(shí)施例中重組水蛭素，是將野生型水蛭素hv2肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-ser35，再在其n末端修飾plg寡肽，重組水蛭素plg-hv2-rgds氨基酸序列為：seqidno.5，基因序列為：seqidno.6。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例4
本實(shí)施例中用于重組的水蛭素為水蛭素突變體，是將野生型水蛭素hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-ser35，再在其n末端修飾plg寡肽，重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：plg-hv3-rgds，氨基酸序列為：seqidno.7，基因序列為：seqidno.8。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例5
本實(shí)施例中重組水蛭素，是將野生型水蛭素hv2肽鏈的ser32-asn33-gly34-glu35替換為arg32-gly33-asp34-met35，再在其n末端修飾plgl寡肽，重組水蛭素plg-hv2-rgdm氨基酸序列為：seqidno.9，基因序列為：seqidno.10。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例6
本實(shí)施例中用于重組的水蛭素為水蛭素突變體，是將野生型水蛭素hv3肽鏈的ser32-asn33-gly34-lys35替換為arg32-gly33-asp34-met35(rgdm)，重組水蛭素plg-hv3-rgdm，氨基酸序列為：seqidno.11，基因序列為：seqidno.12。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例7
本實(shí)施例的重組水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽rgd4c與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv2通過linker和寡肽plg連接而成的融合蛋白rph2(rgd4c-plg-hv2)，重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：rgd4c-linker1-mmp9酶切位點(diǎn)-hv2，氨基酸序列為：seqidno.13基因序列為：seqidno.14。
其中，rgd4c可被其它包含rgd序列的可靶向結(jié)合αvβ3的短肽序列替換。plgi可被其它mmp9識(shí)別并酶切底物肽序列替換，其共同特點(diǎn)為包含有g(shù)i序列，以保證經(jīng)mmp9酶切后，釋放的水蛭素n末端的氨基酸為i；linker1的長度為2～15個(gè)氨基酸。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例8
本實(shí)施例的重組水蛭素，是靶向整合素αvβ3的多肽rgd4c與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv3通過linker和寡肽plg連接而成的融合蛋白rph3(rgd4c-plg-hv3)，重組水蛭素的結(jié)構(gòu)為：rgd4c-linker1-mmp9酶切位點(diǎn)-hv3，氨基酸序列為：seqidno.15，基因序列為：seqidno.16。
其中，rgd4c可被其它包含rgd序列的可靶向結(jié)合αvβ3的短肽序列替換。plgi可被其它mmp9識(shí)別并酶切底物肽序列替換，其共同特點(diǎn)為包含有g(shù)i序列，以保證經(jīng)mmp9酶切后，釋放的水蛭素n末端的氨基酸為i。linker1的長度為2～15個(gè)氨基酸。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例9
本實(shí)施方式的重組水蛭素是人白蛋白與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv2通過寡肽plg連接而成的融合蛋白hph2(hsa-plg-hv2)，hph2氨基酸序列為：seqidno.17，基因序列為：seqidno.18
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例10
本實(shí)施方式的重組水蛭素是人白蛋白與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv3通過寡肽plg連接而成的融合蛋白hph3(hsa-plg-hv3)，hph3氨基酸序列為：seqidno.19，基因序列為：seqidno.20。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例11
本實(shí)施方式的重組水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白fc段與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv2通過寡肽plg連接而成的融合蛋白fph2(fc-plg-hv2)，人嵌合免疫球蛋白fc段包含人igg4鉸鏈區(qū)、fc段序列和igm尾片序列，fph2氨基酸序列為：seqidno.21，基因序列為：seqidno.22。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例12
本實(shí)施方式的重組水蛭素，是人嵌合免疫球蛋白fc段與n末端氨基酸是i的水蛭素異構(gòu)體hv3通過寡肽plg連接而成的融合蛋白fph3(fc-plg-hv3)，人嵌合免疫球蛋白fc段包含人igg4鉸鏈區(qū)、fc段序列和igm尾片序列，fph3氨基酸序列為：seqidno.23，基因序列為：seqidno.24。
該腫瘤特異性重組水蛭素在制備防治腫瘤的藥物中的應(yīng)用，尤其是防治腫瘤伴發(fā)高凝狀態(tài)和血栓性病變的藥物中的應(yīng)用。
實(shí)施例13
本實(shí)施例的腫瘤特異性重組水蛭素的制備方法，包括以下步驟：化學(xué)合成上述實(shí)施例1～12任一的腫瘤特異性重組水蛭素基因片段，并將其連接成編碼基因，將編碼基因插入載體中制備重組載體，用該重組載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，宿主細(xì)胞為大腸桿菌、乳酸菌、酵母、昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，之后離心收集上清液，經(jīng)超濾濃縮、凝膠過濾、離子交換三步法純化獲得腫瘤特異性重組水蛭素。
本實(shí)施例用于重組的載體優(yōu)選的為真核表達(dá)載體，采用ppic9k。宿主細(xì)胞為甲醇營養(yǎng)型酵母菌株gs115。
宿主細(xì)胞gs115的發(fā)酵方法為：用低鹽培養(yǎng)基擴(kuò)增工程菌，誘導(dǎo)前用含微量元素的甘油溶液進(jìn)行補(bǔ)料，培養(yǎng)增殖后，用含微量元素的甲醇溶液進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)酵參數(shù)為：溫度30℃、氧容量控制在35±5％、ph＝5、攪拌速度與do連動(dòng)。
實(shí)施例14
表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞制備方法是將人源分泌型信號(hào)肽編碼基因與上述實(shí)施例1～12任一的腫瘤特異性重組水蛭素的編碼基因相連，制備成重組基因載體，轉(zhuǎn)染免疫細(xì)胞，獲得表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞。
過繼免疫細(xì)胞的膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面。該過繼免疫細(xì)胞的膜表面表達(dá)有靶標(biāo)分子，靶標(biāo)分子通過跨膜序列定位在細(xì)胞膜表面。靶標(biāo)分子為cd19的全長或其截短片段，或cd20的全長或其截短片段。
本實(shí)施例的表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的過繼免疫細(xì)胞制備方法包括步驟s1～s3，具體如下。
s1、體外培養(yǎng)人源cik細(xì)胞，包括步驟a的外周血單個(gè)核細(xì)胞(pbmc)采集和步驟b的cik細(xì)胞培養(yǎng)。
a、外周血單個(gè)核細(xì)胞的采集具有以下步驟：
a1、自患者體內(nèi)抽取外周血50-100ml；
a2、淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法進(jìn)一步純化pbmc；
a3、無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90％以上的pbmc。
b、cik細(xì)胞的培養(yǎng)：
b1、將pbmc按1～2×106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000u/ml的重組人ifn-γ，37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
b2、24h后加入50ng/ml的cd3單克隆抗體和300u/ml的重組人il-2，刺激cik細(xì)胞的生長和增殖；
注：此時(shí)也可同時(shí)加入100u/ml的重組人il-1α。
b3、每3天半量換液或擴(kuò)瓶一次，并補(bǔ)加重組人il-2300u/ml；
b4、在培養(yǎng)的第14d，收獲cik細(xì)胞。
其中，細(xì)胞培養(yǎng)基中還可添加5％～20％的自體血清。
s2、制備重組基因載體.
本實(shí)施列采用腫瘤特異性重組水蛭素rph2(rgd4c-pgr-hv2)基因序列，融合蛋白rph2的氨基酸序列為：seqidno.13，基因序列為：seqidno.14。依照腫瘤特異性重組水蛭素rph2的基因序列，在其n末端添加人酰胺化酶信號(hào)肽序列，其氨基酸序列為：seqidno.25，基因序列為seqidno.26?；瘜W(xué)合成基因片段，將其連接成重組編碼基因，n端添加nheⅰ限制性酶切位點(diǎn)，c端添加ecorⅰ限制性酶切位點(diǎn)。
本實(shí)施列采用靶標(biāo)分子結(jié)構(gòu)為：gm-csfr信號(hào)肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段，其氨基酸序列為：seqidno.27，基因序列為seqidno.28?；瘜W(xué)合成基因片段，n端添加bamhⅰ限制性酶切位點(diǎn)，c端添加notⅰ限制性酶切位點(diǎn)。
應(yīng)用基因工程技術(shù)制備編碼腫瘤特異性重組水蛭素和膜型分子靶標(biāo)的基因載體，將信號(hào)肽序列-腫瘤特異性重組水蛭素序列和信號(hào)肽序列-靶標(biāo)分子序列-linker-跨膜段序列兩段基因分別克隆入pires質(zhì)粒的兩個(gè)克隆位點(diǎn)。所用基因工程技術(shù)為公知技術(shù)，簡(jiǎn)述如下：
按照已有的方法建立標(biāo)準(zhǔn)的限制性內(nèi)切酶消化體系，然后利用nheⅰ和ecorⅰ處理pires質(zhì)粒，回收大片段；利用相同的限制性內(nèi)切酶nheⅰ和ecorⅰ處理并回收重組腫瘤特異性水蛭素rph基因片段，然后與上述酶切好的載體pires大片段相連，構(gòu)建出重組腫瘤特異性水蛭素表達(dá)質(zhì)粒pires-rph；轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后，篩選出陽性克隆并擴(kuò)增。
純化pires-rph2質(zhì)粒，然后利用bamhⅰ和notⅰ處理pires-rph2質(zhì)粒，回收大片段；利用相同的限制性內(nèi)切酶bamhⅰ和notⅰ處理并回收重組gm-csfr信號(hào)肽-δcd20-linker2-cd28跨膜段基因片段，然后與上述酶切好的pires-rph2載體大片段相連，構(gòu)建出同時(shí)表達(dá)重組腫瘤特異性水蛭素和膜型分子靶標(biāo)cd20的雙表達(dá)質(zhì)粒pires-rph2/cd20。轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后，篩選出陽性克隆并擴(kuò)增，純化pires-rph2/cd20質(zhì)粒。
s3、純化經(jīng)步驟s2得到的pires-rph2/cd20重組質(zhì)粒，用該重組載體以質(zhì)粒電轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染步驟s1得到的cik細(xì)胞，之后進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)36h以上，得到表達(dá)重組水蛭素的cik細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)染率，根據(jù)臨床需要計(jì)算所需陽性細(xì)胞數(shù)量，回輸腫瘤患者。
該表達(dá)腫瘤特異性重組水蛭素的cik細(xì)胞，用于抗凝、抗血栓、防治腫瘤的生物治療，尤其是防治伴有高凝狀態(tài)和/或血栓的腫瘤患者的生物治療。
以上所述的僅是本發(fā)明的一些實(shí)施方式。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
序列表
<110>何向鋒
<120>一種腫瘤特異性重組水蛭素及其制備方法和用途
<160>28
<210>1
<211>68
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
proleuglyilethrtyrthraspcysthrgluserglyglnasn
51015
leucysleucysgluglyserasnvalcysglylysglyasnlys
202530
cysileleuglyserasnglyglugluasnglncysvalthrgly
354045
gluglythrprolysproglnserhisasnasnglyasppheglu
505560
gluileprogluglutyrleugln
65
<210>2
<211>207
<212>dna
<213>人工序列
<400>2
cccttaggtattacttacactgattgtacagaatcgggtcaaaatttgtgcctctgcgag60
ggaagcaatgtttgcggtaaaggcaataagtgcatattgggttctaatggagaggaaaac120
caatgtgtcactggcgaaggtacaccgaagcctcaaagccataataacggcgatttcgaa180
gaaattccagaagaatatttacaatga207
<210>3
<211>70
<212>prt
<213>人工序列
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proleuglyilethrtyrthraspcysilegluserglyglnasn
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leucysleucysgluglyserasnvalcysglylysglyasnlys
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cysileleuglyserasnglylysaspasnglncysvalthrgly
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gluglythrprolysproglnserhisasnglnglyasppheglu
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proileprogluaspalatyraspglulys
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<211>213
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<213>人工序列
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caatgtgtcactggcgaaggtacaccgaagcctcaaagccataatcaaggcgatttcgaa180
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202530
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202530
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