本發(fā)明屬于眼鏡蛇毒細胞毒素領(lǐng)域，尤其涉及一種眼鏡蛇毒細胞毒素-4n(ctx-4n)的純化制備方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的毒液，其化學成分復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物活性。眼鏡蛇細胞毒素(cytotoxin，ctx)又稱眼鏡蛇心臟毒素(cardiototxin)，是眼鏡蛇毒的重要活性物質(zhì)之一，約占蛇毒蛋白25％～40％，具有心臟毒、抑制骨吸收、引起可興奮組織去極化、抗菌等生物活性，并誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡，不同區(qū)域不同蛇種蛇毒中含有組分的生物效應(yīng)不盡相同。

從眼鏡蛇中分離純化ctx是研究其理化性質(zhì)、毒性反應(yīng)、藥理作用、作用機制等的必要前提。在分離純化ctx方面，國內(nèi)外學者大都采用陽離子交換柱層析和凝膠過濾相結(jié)合的方法進行分離純化，據(jù)此發(fā)現(xiàn)了ctx-i，ctx-ii，ctx-iii，ctx-iv(seq.id.no.2)，ctx-v等細胞毒素，然而，此種方法中，由于柱效的影響因素繁多，且很難加以控制，故重復(fù)性差，分離純化后所得產(chǎn)品中往往含有其他蛋白物質(zhì)，從而將影響細胞毒素生物活性的研究。

肝纖維化是慢性肝病損傷后，肝臟自我修復(fù)的一個過程`，造成肝纖維化的原因是大量的細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ecm)在肝臟內(nèi)沉積，改變了肝臟的結(jié)構(gòu)，破壞了肝臟的生理功能；而使ecm過多的在肝臟累積的原因是肝星狀細胞hsc的激活，激活的hsc細胞會產(chǎn)生大量的ecm；過多的ecm會使肝臟發(fā)生纖維化，繼續(xù)發(fā)展為肝硬化，肝功能衰竭等疾病。因此在肝纖維化的過程中hsc細胞有至關(guān)重要的作用，如何抑制其激活或者使其發(fā)生凋亡在抗肝纖維化過程中有著重大關(guān)聯(lián)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種簡單、高效、可控的眼鏡蛇毒細胞毒素-4n的純化制備方法及其應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

眼鏡蛇毒細胞毒素-4n在制備抗肝纖維化藥物中的應(yīng)用。

上述眼鏡蛇毒細胞毒素-4n按以下方法制備：先采用deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱然后再利用sephadexg-50凝膠層析柱、macro-prephighs陽離子交換柱依次進行分離，每次分離后選取眼鏡蛇毒細胞毒素-4n活性最高的峰作為下步分離的樣品。

選取眼鏡蛇毒細胞毒素-4n活性最高的峰采用cck-8實驗方法，通過對hsc-t6細胞增殖抑制作用，用超純水對所收集的各峰稀釋后進行檢驗。

眼鏡蛇毒細胞毒素-4n的純化制備方法，包括以下步驟：

(1)deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱洗脫分離；

(2)sephadexg-50凝膠層析柱洗脫分離；

(3)macro-prephighs陽離子交換柱洗脫分離。

步驟(1)按以下操作進行：將deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱用a液平衡12h，將蛇毒樣品上樣于平衡好的deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱中，采用b液按設(shè)置的洗脫程序進行洗脫，分別收集各蛋白峰，用cck-8實驗方法檢測各峰對hsc-t6細胞的增殖抑制，選擇抑制率比較顯著的峰進行脫鹽透析，凍干備用；a液為0.05m的tris-hclph8.5緩沖液；b液為0.05m的tris-hclph8.5+0.5mnacl的緩沖液。

樣品的配制按以下操作進行：稱眼鏡蛇毒粗毒1g，加入10mla液溶解，將其放在4℃冰箱中待其全部溶解后，10000rpm，4℃離心，20min；用0.45μm的濾器過濾，再用0.2μm濾器過濾，待用。

步驟(2)按以下操作進行：將步驟(1)中得到的凍干蛋白粉末，加10ml0.02mpbsph7.5的緩沖液使其全部溶解，用0.45μm的濾器過濾，再用0.2陽濾器過濾，待用；sephadexg-50凝膠層析柱用0.02mpbsph7.5的緩沖液平衡12h，將前述蛋白樣品上樣于平衡好的sephadexg-50柱中，采用0.02mpbsph7.5按設(shè)置的洗脫程序進行洗脫，分別收集各蛋白峰，用cck-8實驗方法檢測各峰對hsc-t6細胞的增殖抑制，選擇抑制率比較顯著的峰進行脫鹽透析，凍干備用。

步驟(3)按以下操作進行：將步驟(2)中得到的凍干蛋白粉末，加1mlpb緩沖液充分溶解后，10000rpm離心15min，取上清液，過0.22μm濾器后，上樣于pb緩沖液平衡好的macro-prephighs柱，采用緩沖液b按設(shè)置的洗脫程序進行洗脫，分別收集各蛋白峰，用cck-8實驗方法檢測各峰對hsc-t6細胞的增殖抑制，選擇抑制率比較顯著的峰進行脫鹽透析，凍干，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?；平衡用的pb緩沖液為0.02m的磷酸二氫鈉和0.02m的磷酸氫二鈉按比例137∶63混合配制而成的緩沖液，混合后緩沖液ph為6.5；緩沖液b為0.02mpbph6.5+0.5mnacl；溶解用的pb緩沖液ph4.0。

針對目前眼鏡蛇毒細胞毒素-4n制備存在的問題，發(fā)明人建立了一種眼鏡蛇毒細胞毒素-4n的純化制備方法，先采用deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱然后再利用sephadexg-50凝膠層析柱、macro-prephighs陽離子交換柱依次進行分離，每次分離后選取眼鏡蛇毒細胞毒素-4n活性最高的峰作為下步分離的樣品。其中，通過ctx-4n對hsc-t6細胞的增值抑制作用，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了眼鏡蛇毒分離純化過程中ctx-4n活性最強峰，蛋白質(zhì)質(zhì)譜法鑒定確認為ctx-4n。通過實驗，發(fā)明人還確定了ctx-4n作用hsc-t6細胞隨著濃度增加其對增殖抑制作用越強，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，并計算出ic50為12.836±0.045μg/ml。細胞凋亡實驗證明，ctx-4n對hsc-t6細胞有凋亡作用，使其發(fā)生凋亡的最小濃度為4μg/ml。研究表明，應(yīng)用本發(fā)明可以獲得電泳純度的ctx-4n，其純度高，活性高；hsc-t6增殖抑制和凋亡實驗證明，ctx-4n對hsc-t6細胞有殺傷作用，提示肝纖維化發(fā)展過程ctx-4n會有抗肝纖維化的作用，具有重要的藥用價值。

附圖說明

圖1是deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱分離純化結(jié)果。

圖2是deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱分離純化后收集各峰蛋白對hsc-t6細胞的增殖抑制率。

圖3是sephadexg-50凝膠層析柱分離純化結(jié)果。

圖4是sephadexg-50凝膠層析柱分離純化后收集各峰蛋白對hsc-t6細胞的增殖抑制率。

圖5是macro-prephighs陽離子交換柱分離純化結(jié)果。

圖6是macro-prephighs陽離子交換柱分離純化后收集各峰蛋白對hsc-t6細胞的增殖抑制率。

圖7是sds-page電泳鑒定結(jié)果。

圖8是ph4.3緩沖系統(tǒng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定結(jié)果。

圖9是cck-8檢測ctx-4n作用hsc-t6細胞的增殖抑制率。

圖10是peannexinvapoptosisdetectionkiti檢測ctx-4n作用hsc-t6細胞的凋亡率，圖中：a：空白對照組，b：ctx-4n(1μg/ml)，c：ctx-4n(2μg/ml)，d：ctx-4n(4μg/ml)，e：ctx-4n(8μg/ml)，f：ctx-4n(16μg/ml)。

具體實施方式

1.材料與方法

1.1儀器與試劑

電子分析天平(英國sartotius)，start層析系統(tǒng)(ge公司)，l18-4584-01系統(tǒng)(美國pharmaciabiotech公司)，yc-2層析實驗冷柜(北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)，lgj-18冷凍干機(北京松源華興科技發(fā)展公司)，酶標儀(美國biotek公司)，細胞培養(yǎng)箱(thermo公司)，大鼠肝星狀細胞hsc-t6(中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會昆明細胞庫)，dmem培養(yǎng)基(gibco公司)、胎牛血清(gibco公司)，cck-8試劑(日本同仁公司)，peannexinvapoptosisdetectionkiti(美國bd公司)，廣西眼鏡蛇毒凍干粉末(廣西醫(yī)科大學蛇毒所提供，眼鏡蛇為爬行綱有鱗目蛇亞目眼鏡蛇科眼鏡蛇屬，舟山眼鏡蛇，拉丁名為najaatra)，其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1hsc-t6細胞培養(yǎng)

將hsc-t6細胞用含有10％的胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)，放置5％co2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的hsc-t6細胞接種于96孔板中，每孔細胞量為1000個，待用。

1.2.2樣品配制

稱取眼鏡蛇毒粗毒粉末1g，加入10ml0.05mtris-hclph8.5緩沖液溶解，放置4℃待其完全溶解后，10000rpm，4℃離心20min，用0.45μm的濾器過濾，再用0.2μm濾器過濾，待用。

1.2.3分離純化方法

(1)deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱洗脫分離

將deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱用a液平衡12h，將蛇毒樣品上樣于平衡好的deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱中，采用b液按表1設(shè)置的洗脫程序進行洗脫，分別收集各蛋白峰，用cck-8實驗方法檢測hsc-t6細胞增殖抑制。選擇抑制率比較顯著的峰進行脫鹽透析，凍干備用。a液為0.05mtris-hclph8.5的緩沖液，b液為0.05mtris-hclph8.5+0.5mnacl的緩沖液。

(2)sephadexg-50凝膠層析柱洗脫分離

將步驟(1)中得到的凍干蛋白粉末，加10ml0.02mpbsph7.5的緩沖液使其全部溶解，用0.45μm的濾器過濾，再用0.2μm濾器過濾，待用。sephadexg-50凝膠層析柱用0.02mpbs(ph7.5)的緩沖液平衡12h，將蛋白樣品上樣于平衡好的sephadexg-50柱中，采用0.02mpbs(ph7.5)按表2設(shè)置的洗脫程序進行洗脫，分別收集各蛋白峰，做cck-8實驗方法檢測hsc-t6細胞增殖抑制。選擇抑制率比較顯著的峰進行脫鹽透析，凍干備用。

(3)macro-prephighs陽離子交換柱洗脫分離

將步驟(2)中得到的凍干蛋白粉末，加1ml0.02mpb緩沖液充分溶解后，10000rpm離心15min，取上清液，過0.22μm濾器后，上樣于pb緩沖液平衡好的macro-prephighs柱，采用緩沖液b按表3設(shè)置的洗脫程序進行洗脫，分別收集各蛋白峰，用cck-8實驗方法檢測hsc-t6細胞增殖抑制。選擇抑制率比較顯著的峰進行脫鹽透析，凍干，-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。平衡所用pb緩沖液為0.02m的磷酸二氫鈉(nah2po4)和0.02m的磷酸氫二鈉(na2hpo4)按比例137∶63混合配制而成的緩沖液，混合后緩沖液ph為6.5。緩沖液b為0.02mpb(ph6.5)+0.5mnacl。溶解所用pb緩沖液ph4.0。

1.2.4hsc-t6細胞增殖抑制實驗

收集各蛋白峰，分別按1，5，10，20μg/ml的濃度去作用于hsc-t6細胞24h后，用cck-8試劑去檢測。cck-8實驗方法檢測心臟毒素-4n作用hsc-t6細胞后增殖抑制，觀察其對細胞的增殖抑制的影響。

1.2.5sds-page電泳

將macro-prephighs陽離子交換柱最后分離純化后的最強活性ctx-4n峰凍干粉末，用超純水溶解配成濃度為4mg/ml，取16μl，加上4μl蛋白上樣緩沖液(廠家：碧云天；貨號：p0015l)混勻，置于沸水中水浴10min，上樣于12％的sds-page膠中，其中濃縮膠部分所用電壓為80v，分離膠部分所用電壓為120v，當?shù)鞍咨蠘泳彌_液的藍色條帶跑至距分離膠底1cm處時，停止電泳?？捡R斯亮藍r-250染色1h后脫色。

1.2.6ph4.3緩沖系統(tǒng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

將macro-prephighs陽離子交換柱最后分離純化后的最強活性ctx-4n峰凍干粉末，用超純水溶解配成濃度為4mg/ml，取16μl，加上4μl蛋白上樣緩沖液(取蒸餾水7.3ml，ph6.7緩沖液1.2ml，甘油1.0ml，0.5％(w/v)甲基綠溶液0.5ml，混勻，4℃保存；ph6.7緩沖液：取冰醋酸2.87ml，加水稀釋，用1mol/l氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)ph值至6.7，加水稀釋至100ml，4℃保存。)上樣于12％的sds-page膠中，其中濃縮膠部分所用電壓為80v，分離膠部分所用電壓為120v，當綠色甲基綠接近膠板底部時，停止電泳。考馬斯亮藍r-250染色1h后脫色。

1.2.7蛋白質(zhì)質(zhì)譜法鑒定蛋白

將電泳后的蛋白質(zhì)條帶切割下來，送至蘇州普泰生物技術(shù)有限公司，用nano-lc-esi-ms/ms方法進行鑒定。

1.2.8ctx-4n對hsc-t6細胞的增殖抑制作用

取生長狀況良好的hsc-t6細胞，向96孔板內(nèi)加入100μl細胞液，每孔細胞數(shù)量為1000個，每組設(shè)置5個復(fù)孔，在37℃，5％co2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12h使細胞貼壁。細胞貼壁后取出96孔板，吸掉培養(yǎng)基，用1×pbs洗2兩次后，按照實驗分組設(shè)計分別加入不同濃度的ctx4n作用細胞，終濃度為0，1，2，4，8，16，32μg/ml。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，吸掉培養(yǎng)基，用1×pbs洗2兩次，加入cck-8試劑，繼續(xù)孵育1h，測定a450od值，根據(jù)公式算抑制率。抑制率＝[(對照組-實驗組)/(對照組-空白組)]×100％(對照組：含有細胞的培養(yǎng)基、cck-8、沒有ctx4n，實驗組：含有細胞的培養(yǎng)基、cck-8、ctx4n，空白組：不含細胞和ctx4n的培養(yǎng)基、cck-8)

1.2.9ctx-4n對hsc-t6細胞的凋亡作用

取生長狀態(tài)良好的hsc-t6細胞，以2×10⁵/孔的細胞密度接種于6孔板，放入5％co2，37℃細胞培養(yǎng)箱，過夜培養(yǎng)待其貼壁后棄掉培養(yǎng)基，用1×pbs洗一次，加入含有ctx-4n的細胞培養(yǎng)去作用hsc-t6細胞，加入的ctx-4n的濃度為0，1，2，4，8，16μg/ml，每組設(shè)置3個復(fù)孔，在細胞培養(yǎng)箱中作用24h后，用peannexinvapoptosisdetectionkiti試劑盒方法用流式細胞儀去檢測。具體是用0.25％的胰酶(不含edta)消化細胞，2000rpm離心5min，去除上清液，用預(yù)冷的1×pbs洗2次，2000rpm離心5min，加入1xbindingbuffer200μl輕輕吹打均勻細胞使其成為單細胞懸液，每組細胞樣本濃度約為1×10⁶個/ml，取100μl細胞懸液加入到流式管中，加入5μlannexinv-pe和5μ17-aad與細胞懸液輕輕混勻，避光孵育15min。孵育結(jié)束后每管加入400μl1xbindingbuffer混勻，并且在1h內(nèi)完成流式細胞儀檢測。凋亡試劑染料加入細胞設(shè)置對照：(1)只加5μlannexinv-pe，(2)只加5μ17-aad，(3)兩者都不加。

2結(jié)果

2.1分離純化結(jié)果

deae-sepharosecl-6b陰離子交換柱分離結(jié)果如圖1和對hsc-t6細胞的增殖抑制實驗結(jié)果如圖2所示，作用hsc-t6細胞后，第i峰具有最強的抑制活性；sephadexg-50凝膠層析柱分離結(jié)果如圖3和對hsc-t6細胞的增殖抑制實驗結(jié)果如圖4所示，作用hsc-t6細胞后，第iii峰具有最強的抑制活性；macro-prephighs陽離子交換柱分離結(jié)果如圖5和對hsc-t6細胞的增殖抑制實驗結(jié)果如圖6所示，作用hsc-t6細胞后，第iv峰具有最強的抑制活性。

2.2電泳結(jié)果

macro-prephighs陽離子交換柱分離得到的ctx-4n活性，經(jīng)sds-page電泳，從圖4的結(jié)果中可以確定其純度已達到電泳純度，分子量大約為10kda。經(jīng)ph4.3緩沖系統(tǒng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，從圖5的結(jié)果中可以確定其純度已達到電泳純度。

2.3蛋白質(zhì)譜鑒定

將電泳后的蛋白條帶切割下來，送至蘇州普泰生物技術(shù)有限公司，用nano-lc-esi-ms/ms方法進行分析鑒定。經(jīng)分析比較與文獻(long-senchangs-klandcc.molecularcloningandevohtionofthegenesencodingtheprecursorsoftaiwancobracardiotoxinandcardiotoxin-likebasicprotein[j].biochemicalgenetics2004，vol.42，nos.11/12)報道一致，確定蛋白質(zhì)為ctx-4n(seq.id.no.1)，分子量約為9.605kd。

2.4對hsc-t6細胞增殖抑制的影響

表4結(jié)果其中1μg/ml濃度作用hsc-t6細胞的增殖抑制率與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；2，4，8，16，32μg/ml濃度作用hsc-t6細胞的增殖抑制率與對照組相比差異具有統(tǒng)計意義(p＜0.01)。從表4和圖9的結(jié)果可以確定ctx-4n作用hsc-t6細胞隨著濃度增加對其增殖抑制作用越強，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，并計算出ic50為12.836±0.045ug/ml。

2.5對hsc-t6細胞凋亡的影響

ctx-4n作用hsc-t6細胞凋亡率檢測顯示，不同濃度的ctx-4n作用hsc-t6細胞24h后，細胞存在不同濃度的凋亡如圖10所示，空白對照細胞的凋亡率為4.05±0.09％，當ctx-4n濃度為1，2μg/ml，細胞凋亡率為4.22±0.11％和7.16±0.18％，與空白對照組相比差異沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；當ctx-4n為4，8，16μg/ml時，凋亡率分別為：15.23±0.29％，22.21±0.74％，40.39±1.13％，與空白對照組相比差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.01)。從而得出ctx-4n使hsc-t6細胞發(fā)生凋亡的最小濃度為4μg/ml。

3結(jié)論

發(fā)明人建立一種從眼鏡蛇毒分離純化具有電泳純度，活性高的細胞毒素-4n的方法并為其在抗肝纖維化中藥理作用提供實驗基礎(chǔ)。

表1deae-sepharosecl-6b離子交換柱洗脫程序

表2spehadexg-50凝膠柱洗脫程序

表3macro-prephighs陽離子交換柱洗脫程序

表4ccn-8檢測不同濃度的ctx-4n作用hsc-t6細胞的增殖抑制率

sequencelisting

<110>廣西醫(yī)科大學

<120>眼鏡蛇毒細胞毒素-4n的純化制備方法及其應(yīng)用

<130>眼鏡蛇毒細胞毒素-4n的純化制備方法及其應(yīng)用

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>81

<212>prt

<213>najaatra

<400>1

metlysthrleuleuleuthrleuvalvalvalthrilevalcysleu

151015

aspleuglytyrthrarglyscysasnlysleuvalproleuphetyr

202530

lysthrcysproalaglylysasnleucystyrlysmetphemetval

354045

serasnleuthrvalprovallysargglycysileaspvalcyspro

505560

lysserserleuleuvallystyrvalcyscysasnthraspargcys

65707580

asn

<210>2

<211>81

<212>prt

<213>najaatra

<400>2

metlysthrleuleuleuthrleuvalvalvalthrilevalcysleu

151015

aspleuglytyrthrarglyscysasnlysleuvalproleuphetyr

202530

lysthrcysproalaglylysasnleucystyrlysmetphemetval

354045

serasnleuthrvalprovallysargglycysileaspvalcyspro

505560

lysasnseralaleuvallystyrvalcyscysasnthraspargcys

65707580

asn