專利名稱：眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素的分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素的分離純化方法。
背景技術(shù)：
眼鏡蛇毒是由眼鏡蛇的毒腺分泌的一種天然毒蛋白，其化學(xué)成分非常復(fù)雜，含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其他小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物學(xué)活性。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，眼鏡蛇毒的許多組分已得到分離純化和序列測定，各種成分廣泛應(yīng)用于生物化學(xué)、分子生物學(xué)、毒理學(xué)和藥物學(xué)理論研究和臨床應(yīng)用。
自1933年Monaelesser和Taguet首次報道眼鏡蛇毒對癌組織壓迫神經(jīng)引起疼痛的病例的顯著療效經(jīng)來，眼鏡蛇毒的鎮(zhèn)痛作用得到了深入的研究，其中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素(neurotoxin，NTX)顯示了獨特的鎮(zhèn)痛作用，NTX的鎮(zhèn)痛機理與嗎啡類似，鎮(zhèn)痛效果大于嗎啡，持續(xù)時間長，無麻醉作用，無成癮性和耐藥性，但起效較嗎啡慢；同時NTX還能戒除嗎啡毒癮，所以在癌痛或戒毒等方面具有獨特的治療作用。
眼鏡蛇毒細胞毒素(cytotoxin，CTX)是眼鏡蛇毒的重要活性成分之一，約占蛇毒總蛋白的40％～50％，同一種眼鏡蛇毒含有多種CTX，它們對體外培養(yǎng)的多種動物和人的腫瘤細胞具有溶解作用，能夠強烈破壞游離細胞，尤其是惡性腫瘤細胞，是一種很有潛力的抗腫瘤藥物。
獲得單一成分的CNT和CTX是理化性質(zhì)分析、藥理活性研究和臨床應(yīng)用的前提。CNT和CTX分離純化的國內(nèi)外報道較多(Chang，et al.Biochem Biophys Res Commun，2002，294(3)574；Lin，et al.J Protein Chem，2002，21(2)81；李范珠等，中國藥師，2004，7(9)659；張明芳等，福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2004，38(1)1)，也有相關(guān)的專利技術(shù)(WO 01/03710和CN 1102570A)，但都是使用SP-Sephadex、CM-Sephadex、Sephadex和Mono Q等不同介質(zhì)進行離子交換層析和分子篩層析分離純化，雖能得到較高純度的單一組分，但提取率較低，還需要昂貴的蛋白質(zhì)純化設(shè)備，增加了藥物的成本，阻礙了這類藥物的進一步推廣使用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明設(shè)計了一種全新的NTX和CTX分離純化方法，從眼鏡蛇毒中同時高效提取高純度NTX和CTX。
本發(fā)明提供的眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素的分離純化方法包括以下步驟(1)按重量份1份眼鏡蛇毒原液使用10份丙酮研磨、洗滌，操作時，先取適量丙酮研磨眼鏡蛇毒原液成勻漿，以濾紙過濾勻漿，再用剩余丙酮洗滌，室溫放置使丙酮揮發(fā)，即得眼鏡蛇毒丙酮粉；(2)眼鏡蛇毒丙酮粉按1∶10(W/V)溶解于蒸餾水中，用50％的乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0～5.0，10000rpm 4℃低溫離心5～10min，取上清液；(3)按上清液體積計，加入25％的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)至終濃度為3～5％(W/V)，記錄PAA加入量，4℃放置30～50min，2000rpm 4℃低溫離心3～5min，取沉淀溶解于適量蒸餾水中，用0.5mol/L碳酸鈉溶液調(diào)pH至9.5～10.0，加氯化鈉至終濃度為4～5％(W/V)，以已加入的PAA∶氯化鈣溶液為1∶35(W/V)加入20％的氯化鈣溶液并混勻，室溫放置30min，以鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0～5.0，室溫放置30～50min，10000rpm 4℃低溫離心5～10min，取上清液；(4)上清液用超細顆粒Sephadex G-50凝膠柱分離，以5～10mmol/L pH7.0～7.5含0.2～0.3mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，第一個洗脫主峰為神經(jīng)毒素，第二個洗脫主峰為細胞毒素，收集各級分溶液凍干，即分別為眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素。
本發(fā)明所述的NTX，是從眼鏡蛇毒中分離純化的多肽類物質(zhì)，其特征是由61～62個氨基酸殘基組成的堿性多肽，分子量為7300～7500Da，等電點pH(pI)為10.0左右，小鼠熱板法結(jié)果顯示，腹注1/4LD50和1/2LD50的NTX，小鼠痛閾比對照組平均升高43％和54％，并有劑量—效應(yīng)關(guān)系。
本發(fā)明所述的CTX，是從眼鏡蛇毒中分離純化的多肽類物質(zhì)，其特征是由60個氨基酸殘基組成的堿性多肽，分子量為6600～7100Da，等電點pH(pI值)為11.0左右；大鼠體外心臟標本收縮試驗表明CTX使大鼠體外心臟標本收縮幅度減小、攣縮，最后停搏于收縮期。
本發(fā)明具有的下列優(yōu)點1.本發(fā)明可同時分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素，提高了眼鏡蛇毒的綜合利用效率。
2.本發(fā)明用丙酮制備眼鏡蛇蛇毒丙酮粉，以除去粗蛇毒中的脂溶性成分。
3.本發(fā)明以酸調(diào)節(jié)蛇毒丙酮粉水溶液的pH至4.0，離心除去蛇毒中的中酸性蛋白和多肽。
4.本發(fā)明以PAA特異吸附并沉淀蛇毒中的堿性蛋白和堿性多肽，離心分離PAA-堿性蛋白/多肽復(fù)合物，除去水溶性成分；利用pH變化使PAA-堿性蛋白/多肽解吸附，用氯化鈣除去PAA。
5.本發(fā)明以Sephadex G-50(超細顆粒)凝膠柱分離純化眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素，產(chǎn)品含鹽量低，可直接冷凍干燥。
本發(fā)明制品使用PAA吸附法，同時提取眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素，綜合利用效率和提取效率高；產(chǎn)品純度高、含鹽量低，可直接冷凍干燥，應(yīng)用前景廣。
具體實施例方式
實施例1(1)取浙江產(chǎn)眼鏡蛇蛇毒原液2.5g，分析純25ml丙酮。將蛇毒原液置于研缽中，加5ml丙酮研磨成勻漿，以濾紙過濾勻漿，并用剩余的20ml丙酮洗滌，室溫放置使丙酮揮發(fā)，即得蛇毒丙酮粉。
(2)將蛇毒丙酮粉溶解于25ml蒸餾水中，用50％的乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.5，10000rpm離心5min(4℃)，取上清液，記錄體積。
(3)根據(jù)上清液體積，加入25％的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)至終濃度為4％，記錄PAA加入量，4℃放置40min，2000rpm離心3min(4℃)，取沉淀溶解于適量蒸餾水中，用0.5mol/L碳酸鈉溶液調(diào)pH至9.7，加氯化鈉至終濃度為4％(W/V)，以已加入的PAA∶氯化鈣溶液為1∶35(W/V)加入20％的氯化鈣溶液并混勻，室溫放置40min；以鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0，10000rpm離心7min(4℃)，取上清液。
(4)上清液用Sephadex G-50(超細顆粒)凝膠柱分離，以5mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0，含0.2mol/L氯化鈉)洗脫，第一個洗脫主峰為神經(jīng)毒素，第二個洗脫主峰為細胞毒素，收集各級分溶液凍干，即得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素。經(jīng)BCA法測定，其中NTX為195mg，CTX為385mg；SDS-PAGE電泳顯示NTX分子量為7400Da，CTX分子量為6900Da左右；等電聚焦電泳表明NTX的等電點pH(pI)為9.8～10.2，CTX的等電點pH(pI值)為11.0～11.3；小鼠熱板法證明腹注1/4LD50的NTX，小鼠痛閾比對照組平均升高42％；大鼠體外心臟標本收縮試驗證明CTX使大鼠體外心臟標本收縮幅度減小、攣縮，最后停搏于收縮期。
實施例2(1)取浙江產(chǎn)眼鏡蛇蛇毒原液4.0g，分析純40ml丙酮。將蛇毒原液置于研缽中，加7ml丙酮研磨成勻漿，以濾紙過濾勻漿，并用剩余的33ml丙酮洗滌，室溫放置使丙酮揮發(fā)，即得蛇毒丙酮粉。
(2)將蛇毒丙酮粉溶解于40ml蒸餾水中，用50％的乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0，10000rpm離心8min(4℃)，取上清液。
(3)同實施例1步驟(3)，但PAA終濃度為5％。
(4)上清液用Sephadex G-50(超細顆粒)凝膠柱分離，以8mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5，含0.3mol/L氯化鈉)洗脫，第一個洗脫主峰為神經(jīng)毒素，第二個洗脫主峰為細胞毒素，收集各級分溶液凍干，即得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素。經(jīng)BCA法測定，其中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素為310mg，眼鏡蛇毒細胞毒素為620mg。
實施例3(1)取浙江產(chǎn)眼鏡蛇蛇毒原液4.0g，分析純40ml丙酮。將蛇毒原液置于研缽中，加7ml丙酮研磨成勻漿，以濾紙過濾勻漿，并用剩余的33ml丙酮洗滌，室溫放置使丙酮揮發(fā)，即得蛇毒丙酮粉。
(2)將蛇毒丙酮粉溶解于40ml蒸餾水中，用50％的乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至5.0，10000rpm離心10min(4℃)，取上清液。
(3)同實施例1步驟(3)，但PAA終濃度為3.2～3.5％。
(4)上清液用Sephadex G-50(超細顆粒)凝膠柱分離，以10mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.5，含0.3mol/L氯化鈉)洗脫，第一個洗脫主峰為神經(jīng)毒素，第二個洗脫主峰為細胞毒素，收集各級分溶液凍干，即得眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素。經(jīng)BCA法測定，其中眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素為307mg，眼鏡蛇毒細胞毒素為614mg。
權(quán)利要求
1.眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素的分離純化方法，其特征在于以下步驟(1)按重量份1份眼鏡蛇毒原液使用10份丙酮研磨、洗滌，操作時，先取適量丙酮研磨眼鏡蛇毒原液成勻漿，以濾紙過濾勻漿，再用剩余丙酮洗滌，室溫放置使丙酮揮發(fā)，即得眼鏡蛇毒丙酮粉；(2)眼鏡蛇毒丙酮粉按1∶10(W/V)溶解于蒸餾水中，用50％的乙酸溶液調(diào)節(jié)pH至4.0～5.0，10000rpm 4℃低溫離心5～10min，取上清液；(3)按上清液體積計，加入25％的聚丙烯酸(polyacrylic acid，PAA)至終濃度為3～5％(W/V)，記錄PAA加入量，4℃放置30～50min，2000rpm 4℃低溫離心3～5min，取沉淀溶解于適量蒸餾水中，用0.5mol/L碳酸鈉溶液調(diào)pH至9.5～10.0，加氯化鈉至終濃度為4～5％(W/V)，以已加入的PAA∶氯化鈣溶液為1∶35(W/V)加入20％的氯化鈣溶液并混勻，室溫放置30min，以鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.0～5.0，室溫放置30～50min，10000rpm 4℃低溫離心5～10min，取上清液；(4)上清液用超細顆粒Sephadex G-50凝膠柱分離，以5～10mmol/L pH 7.0～7.5含0.2～0.3mol/L氯化鈉的磷酸鹽緩沖液洗脫，第一個洗脫主峰為神經(jīng)毒素，第二個洗脫主峰為細胞毒素，收集各級分溶液凍干，即分別為眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種眼鏡蛇蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素的分離純化方法，可同時分離眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素，提高了眼鏡蛇毒的綜合利用效率。本發(fā)明先使用丙酮處理眼鏡蛇蛇毒原液，以除去蛇毒原液中的脂溶性成分，以酸調(diào)節(jié)蛇毒丙酮粉水溶液的pH，離心除去蛇毒中的中酸性蛋白和多肽，再以PAA特異吸附并沉淀蛇毒中的堿性蛋白和堿性多肽，離心分離PAA－堿性蛋白/多肽復(fù)合物，除去水溶性成分；利用pH變化使PAA－堿性蛋白/多肽解吸附，用氯化鈣除去PAA；以Sephadex G－50(超細顆粒)凝膠柱分離純化眼鏡蛇毒神經(jīng)毒素和細胞毒素，產(chǎn)品含鹽量低，可直接冷凍干燥。
文檔編號C07K1/00GK1740192SQ200510060668
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月8日
發(fā)明者童富淡, 張?；? 金蘇華 申請人:浙江大學(xué)