專利名稱：胸腺五肽合成工藝方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域中多肽的合成方法，具體說(shuō)是涉及胸腺五肽合成工藝方法。
背景技術(shù)：
胸腺激素是由胸腺所分泌的一族多肽類蛋白質(zhì)激素。這類激素在個(gè)體發(fā)育和免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)方面起著至關(guān)重要的作用。胸腺生成素(Thymopoientin)是由胸腺上皮細(xì)胞分泌的激素之一，1974年由Goldsfein G從牛胸腺中分離并確定其一級(jí)結(jié)構(gòu)，1979年Goldsfein G通過(guò)固相合成胸腺生成素的片段，證明其主要活性中心為胸腺五肽，其結(jié)構(gòu)為精氨酸-賴氨酸-天門冬氨酸-纈氨酸-酪氨酸(Tyr-Val-Asp-Lys-Arg)。
多肽合成法分液相合成法與固相合成法。在液相合成法中，每次接肽以后都需要對(duì)產(chǎn)物分離純化或結(jié)晶以便除去未反應(yīng)的原料和副產(chǎn)物(如中國(guó)專利申請(qǐng)03134355.4公開(kāi)的“一種胸腺五肽液相合成法”中所描述)，這個(gè)步驟相當(dāng)費(fèi)時(shí)間而且麻煩，因操作帶來(lái)的損失往往也很大。固相合成法是以液相合成法為基礎(chǔ)的，由于在液相合成法中最普遍采用的是以羧基活化的方式進(jìn)行接肽，因此在固相合成法中也采用過(guò)量的活化羧基組分以促使縮合反應(yīng)接近于完全，而過(guò)量的羧基組分和副產(chǎn)物可以通過(guò)過(guò)濾和洗滌的方法很容易地除去。這樣既克服了液相合成法的費(fèi)時(shí)和煩瑣，又降低了由操作帶來(lái)的損失，具有方便、快捷、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)率高的優(yōu)勢(shì)。在國(guó)內(nèi)外，F(xiàn)moc固相合成法已被廣泛用于各種性能多肽的合成，具有反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)少及產(chǎn)率高等優(yōu)點(diǎn)。現(xiàn)有的技術(shù)認(rèn)為固相合成法必須全部采用Fmoc保護(hù)AA(氨基酸)或Boc保護(hù)AA，事實(shí)上也確實(shí)全部采用同一保護(hù)基保護(hù)的AA為原料，但Fmoc固相合成法中所采用的原料Fmoc-Arg(Pdf)-OH的價(jià)格非常昂貴，直接導(dǎo)致胸腺五肽產(chǎn)品的價(jià)格也居高不下，因而很有必要對(duì)現(xiàn)有的Fmoc固相合成法加以研究改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)現(xiàn)狀而提供一種固相合成胸腺五肽的新工藝方法。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為該胸腺五肽合成工藝方法，其以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保護(hù)氨基酸Boc-Arg-OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得胸腺五肽粗品。
所述切肽的步驟如下以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin為10克計(jì)，用80～150ml裂解試劑充分裂解合成好的五肽中間體，去掉Boc基及側(cè)鏈保護(hù)基，同時(shí)把五肽從樹(shù)脂resin中裂解下來(lái)；所述的裂解試劑的體積組成為三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶4.5～6.0∶5∶2.2～3.0∶3.5～5.5。
所述后處理步驟如下先過(guò)濾收集濾液，然后用三氟醋酸攪拌洗滌濾渣，再過(guò)濾，合并濾液，將濾液于40～50℃條件下蒸發(fā)濃縮，往濃縮物中加入無(wú)水乙醚至沉淀充分，過(guò)濾收集沉淀，用無(wú)水乙醚充分洗滌沉淀，干燥所得沉淀即得胸腺五肽粗品。
所述接肽(包括接二肽、三肽、四肽及五肽)的步驟如下a、脫帽以六氫吡啶/DMF溶液為脫帽劑，脫去Fmoc保護(hù)基，然后以DMF溶液充分洗滌，洗干凈副產(chǎn)物；b、接肽將用于接肽的保護(hù)氨基酸溶于DMF中，加入TBTU及HOBT，搖勻，再加入N-甲基嗎啡啉的DMF溶液作為接肽液，搖勻并充分反應(yīng)；c、洗滌以DMF溶液充分洗滌，洗干凈副產(chǎn)物及過(guò)量的羧基組分。
所述TBTU的用量為TBTU與所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的質(zhì)量比為5.0～5.5∶10。
所述HOBT的用量為HOBT與所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的質(zhì)量比為2.0～2.5∶10。
所述N-甲基嗎啡啉的DMF溶液的用量為以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wangresin為10克計(jì)，N-甲基嗎啡啉的DMF溶液的用量為12～18ml，濃度為0.8～1.2mmol/L。
所述六氫吡啶/DMF溶液的濃度為六氫吡啶占溶液體積的18～25％。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于1、用Boc-Arg-OH·HCl的接肽效果要略好于現(xiàn)有Fmoc固相合成法所采用的Fmoc-Arg(Pdf)-OH的接肽效果；2、用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，Boc-Arg-OH·HCl的胍基采用質(zhì)子保護(hù)，對(duì)接肽無(wú)影響；3、Boc基在切肽過(guò)程中去除，而現(xiàn)有Fmoc固相合成法在切肽之前需先脫除Fmoc基，因而本發(fā)明方法相對(duì)于現(xiàn)有方法來(lái)說(shuō)可省略去Fmoc基這一反應(yīng)，簡(jiǎn)化了制備工藝。
4、本發(fā)明方法中采用的Boe-Arg-OH·HCl的價(jià)格遠(yuǎn)低于Fmoc-Arg(Pdf)-OH的價(jià)格，后者的價(jià)格為前者價(jià)格的5倍以上。因此用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，不僅保證了合成的效率，又簡(jiǎn)化了工藝、降低了成本。
5、接肽時(shí)添加HOBT后，雖然粗制品的重量未有明顯增加，但粗制品的有效成分含量大幅提高，可從未添加時(shí)的37wt％提高到57wt％，效果非常明顯。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
實(shí)施例1.試驗(yàn)方法1.1原料和輔料規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)(見(jiàn)表1)表1 1.2設(shè)備及儀器1.2.1恒溫?fù)u床1.2.2SHB-3型循環(huán)水真空泵1.2.3Waters高效液相色譜儀1.3合成方法
1.3.1脫帽將10g Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin放入燈泡瓶中，加入20V/V％六氫吡啶/DMF溶液，室溫振搖燈泡瓶10分鐘，脫去Fmoc保護(hù)基。
1.3.2洗滌用100ml DMF溶液，室溫振搖燈泡瓶2分鐘，倒掉燈泡瓶?jī)?nèi)液體，重復(fù)洗滌三次，洗干凈副產(chǎn)物。
1.3.3接肽羧基組分(接肽用原料，即保護(hù)氨基酸)溶于DMF中，加入5.2gTBTU，2.3HOBT，搖勻，再加入15ml接肽液(1mmol/L N-甲基嗎啡啉的DMF溶液)，加入至燈泡瓶中，搖勻，將燈泡瓶放入搖床振搖，反應(yīng)1小時(shí)，完成接肽工作。
1.3.4洗滌用100ml DMF溶液洗滌4次，洗干凈副產(chǎn)物及過(guò)量羧基組分。再重復(fù)脫帽、洗滌、接肽和洗滌后逐個(gè)延長(zhǎng)肽鏈至五肽。
1.3.5切肽在合成好五肽中間體的燈泡瓶中加入100ml裂解試劑(三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶5∶5∶2.5∶5)，用玻璃磨口塞密閉，放入搖床振搖3小時(shí)，去掉側(cè)鏈保護(hù)基，同時(shí)把五肽從樹(shù)脂中裂解下來(lái)。
1.3.6后處理取出燈泡瓶，用布氏漏斗過(guò)濾收集濾液；將漏斗內(nèi)樹(shù)脂用20ml的三氟醋酸攪拌洗滌，繼續(xù)過(guò)濾；重復(fù)洗滌一次，合并濾液；將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮瓶中，于45℃水浴條件下濃縮至10ml，取下濃縮瓶，將500ml無(wú)水乙醚加入漏斗中，攪拌洗滌沉淀，過(guò)濾；重復(fù)洗滌一次，收集沉淀，置表面皿中，真空干燥過(guò)夜即得胸腺五肽的粗制品。
2.試驗(yàn)結(jié)果2.1添加HOBT時(shí)粗制品產(chǎn)率的影響采用上述1.3合成方法，以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin(以下簡(jiǎn)稱resin)為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boe)-OH及Boc-Arg-OH·HCl依次接二肽、三肽、四肽和接五肽，研究添加HOBT對(duì)反應(yīng)的影響，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3表2未添加HOBT試驗(yàn)結(jié)果 表3添加HOBT試驗(yàn)結(jié)果
2.2不同接肽時(shí)間對(duì)粗制品的影響采用上述1.3合成方法，在添加HOBT情況下，對(duì)1.3.3的接肽時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，分別采用0.5h、1.0h、2.0h、4.0h進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4表4不同接肽時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果 2.3Fmoc-Arg(Pdf)-OH與Boc-Arg-OH·HCl用于制備胸腺五肽的對(duì)比試驗(yàn)采用上述1.3合成方法，在添加HOBT、接肽反應(yīng)時(shí)間為1.0h情況下，進(jìn)行合成試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5、表6。
表5Boc-Arg-OH·HCl試驗(yàn)結(jié)果 表6Fmoc-Arg(Pdf)-OH試驗(yàn)結(jié)果
從以上試驗(yàn)結(jié)果可知(1)、從表2、表3試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，添加HOBT后，粗制品重量未有明顯增加，但粗制品有效成分含量大幅提高，從未添加時(shí)的37wt％(平均)提高到57wt％，效果很明顯。這是因?yàn)镠OBT起催化劑作用，能活化羧基組分(接肽用原料，即保護(hù)氨基酸)，有效提高肽鍵的縮合率。
(2)、從表4的情況來(lái)看，接肽時(shí)間超過(guò)1小時(shí)后，對(duì)粗制品的重量和有效成分含量影響不大。
(3)、從表5、表6情況來(lái)看，用Boc-Arg-OH·HCl的接肽效果與現(xiàn)有Fmoc固相合成法所采用的Fmoc-Arg(Pdf)-OH的接肽效果基本相當(dāng)，且前者要略好于后者。用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，Boc-Arg-OH·HCl的胍基采用質(zhì)子保護(hù)，對(duì)接肽無(wú)影響；Boc基在切肽過(guò)程中去除，而現(xiàn)有Fmoc固相合成法在切肽之前需先脫除Fmoc基，因而本發(fā)明方法相對(duì)于現(xiàn)有方法來(lái)說(shuō)可省略去Fmoc基這一步反應(yīng)，簡(jiǎn)化了制備工藝。從生產(chǎn)成本上來(lái)分析，F(xiàn)moc-Arg(Pdf)-OH的價(jià)格相當(dāng)于Boc-Arg-OH·HCl的價(jià)格的5倍以上。因此用Boc-Arg-OH·HCl代替Fmoc-Arg(Pdf)-OH后，不僅保證了合成的效率，又簡(jiǎn)化了工藝、降低了成本。
3.在前述試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)Boc-Arg-OH·HCl的用量、裂解試劑的用量及組成、接肽時(shí)TBTU及HOBT的用量、N-甲基嗎啡啉的DMF溶液的用量及濃度以及六氫吡啶/DMF溶液的濃度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響進(jìn)行了研究，在不同條件下制備胸腺五肽粗品，各制備例如下(以下用量均以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin用量為10g計(jì))制備例1.
采用上述1.3合成方法，其中脫帽劑六氫吡啶/DMF溶液濃度為18V/V％，接肽時(shí)TBTU用量為5.0g，HOBT用量為2.0g，接肽液N-甲基嗎啡啉的DMF溶液用量為12ml，濃度為1.2mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩爾用量為Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩爾用量的2倍，接肽反應(yīng)時(shí)間為1h；切肽用裂解試劑用量為80ml，質(zhì)量組成為三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶6.0∶5∶3.0∶3.5。結(jié)果制得胸腺五肽粗品8.6g，有效成分含量為56.3％。
制備例2.
采用上述1.3合成方法，其中脫帽劑六氫吡啶/DMF溶液濃度為25V/V％，接肽時(shí)TBTU用量為5.5g，HOBT用量為2.3g，接肽液N-甲基嗎啡啉的DMF溶液用量為18ml，濃度為0.8mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩爾用量為Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩爾用量的2.5倍，接肽反應(yīng)時(shí)間為75min；切肽用裂解試劑用量為150ml，質(zhì)量組成為三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶4.5∶5∶2.2∶5.5。結(jié)果制得胸腺五肽粗品9.3g，有效成分含量為51.8％。
制備例3.
采用上述1.3合成方法，其中脫帽劑六氫吡啶/DMF溶液濃度為22V/V％，接肽時(shí)TBTU用量為5.3g，HOBT用量為2.5g，接肽液N-甲基嗎啡啉的DMF溶液用量為16ml，濃度為1.0mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩爾用量為Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩爾用量的1.8倍，接肽反應(yīng)時(shí)間為1h；切肽用裂解試劑用量為120ml，質(zhì)量組成為三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶5.5∶5∶2.5∶4.5。結(jié)果制得胸腺五肽粗品8.3g，有效成分含量為61.3％。
制備例4.
采用上述1.3合成方法，其中脫帽劑六氫吡啶/DMF溶液濃度為20V/V％，接肽時(shí)TBTU用量為5.2g，HOBT用量為2.2g，接肽液N-甲基嗎啡啉的DMF溶液用量為15ml，濃度為1.0mmol/L，Boc-Arg-OH·HCl的摩爾用量為Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin摩爾用量的2.0倍，接肽反應(yīng)時(shí)間為1h；切肽用裂解試劑用量為100ml，質(zhì)量組成為三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶5.0∶5∶2.5∶4.0。結(jié)果制得胸腺五肽粗品8.7g，有效成分含量為57.6％。
權(quán)利要求
1.一種胸腺五肽合成工藝方法，其以Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸Fmoc-Val-OH、Fmoc-Asp(otBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保護(hù)氨基酸Boc-Arg-OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得胸腺五肽粗品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述切肽的步驟如下以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin為10克計(jì)，用80～150ml裂解試劑充分裂解合成好的五肽中間體，去掉Boc基及側(cè)鏈保護(hù)基，同時(shí)把五肽從樹(shù)脂resin中裂解下來(lái)；所述的裂解試劑的體積組成為三氟醋酸∶苯酚∶水∶二巰基乙醇∶苯甲硫醚＝82.5∶4.5～6.0∶5∶2.2～3.0∶3.5～5.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述后處理步驟如下先過(guò)濾收集濾液，然后用三氟醋酸攪拌洗滌濾渣，再過(guò)濾，合并濾液，將濾液于40～50℃條件下蒸發(fā)濃縮，往濃縮物中加入無(wú)水乙醚至沉淀充分，過(guò)濾收集沉淀，用無(wú)水乙醚充分洗滌沉淀，干燥所得沉淀即得胸腺五肽粗品。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述接肽的步驟如下a、脫帽以六氫吡啶/DMF溶液為脫帽劑，脫去Fmoc保護(hù)基，然后以DMF溶液充分洗滌，洗干凈副產(chǎn)物；b、接肽將用于接肽的保護(hù)氨基酸溶于DMF中，加入TBTU及HOBT，搖勻，再加入N-甲基嗎啡啉的DMF溶液作為接肽液，搖勻并充分反應(yīng)；c、洗滌以DMF溶液充分洗滌，洗干凈副產(chǎn)物及過(guò)量的羧基組分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述TBTU的用量為TBTU與所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的質(zhì)量比為5.0～5.5∶10。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述HOBT的用量為HOBT與所述Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin的質(zhì)量比為2.0～2.5∶10。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述N-甲基嗎啡啉的DMF溶液的用量為以所述起始原料Fmoc-Tyr(tBu)-Wang resin為10克計(jì)，N-甲基嗎啡啉的DMF溶液的用量為12～18ml，濃度為0.8～1.2mmol/L。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的胸腺五肽合成工藝方法，其特征在于所述六氫吡啶/DMF溶液的濃度為六氫吡啶占溶液體積的18～25％。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種胸腺五肽合成工藝方法，屬于生物化學(xué)領(lǐng)域中多肽技術(shù)領(lǐng)域，其以Fmoc－Tyr(tBu)－Wang resin為起始原料，然后用保護(hù)氨基酸Fmoc－Val－OH、Fmoc－Asp(otBu)－OH、Fmoc－Lys(Boc)－OH依次接二肽、三肽和四肽，其特征在于其后以保護(hù)氨基酸Boc－Arg－OH·HCl接五肽，接肽工作完成后充分洗滌，然后切肽、后處理即得胸腺五肽粗品。該方法不僅保證了合成的效率，又簡(jiǎn)化了工藝、大大降低了成本。
文檔編號(hào)C07K7/06GK1733796SQ200510060558
公開(kāi)日2006年2月15日 申請(qǐng)日期2005年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月30日
發(fā)明者葉善明, 施傅濤, 俞通泰, 翁士喬 申請(qǐng)人:寧波市激素制品有限公司