本發(fā)明涉及化妝品及醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種ghk或ahk三肽的合成方法。

背景技術(shù)：

ghk/ahk三肽是一種含有三個(gè)氨基酸的活性多肽，其氨基酸的序列為h-gly-his-lys-oh和h-ala-his-lys-oh。ghk是銅肽的重要中間體，人體血漿中的三肽gly-l-his-l-lys(ghk)和二價(jià)銅離子有很強(qiáng)的親和力，能自發(fā)地形成絡(luò)合物銅勝肽(copperpeptide或ghk-cu)。銅離子對(duì)傷口愈合以及許多的酶促反應(yīng)過(guò)程而言是一種非常重要的成分。

銅肽最初于1973年從人的血漿中分離得到，并于1985年發(fā)現(xiàn)其具有傷口修復(fù)功能，1999年研究者認(rèn)為銅肽及其銅復(fù)合物可以作為組織重塑的激活劑，其也是一個(gè)信號(hào)肽，促進(jìn)傷疤外部大量膠原蛋白集聚物的降解，皮膚正常膠原蛋白的合成、彈力蛋白、蛋白聚糖和葡萄胺聚糖的生成、不同細(xì)胞類(lèi)型的生長(zhǎng)速度和遷移、抗炎、抗氧化反應(yīng)。

銅肽在醫(yī)學(xué)上最早用于促進(jìn)上課愈合以及增進(jìn)肌膚彈性，近年來(lái)部分研究認(rèn)為能改善細(xì)紋，含銅肽的皮膚護(hù)理產(chǎn)品具有:收緊松弛皮膚,提高彈性，提高皮膚的清晰度，提高皮膚的密度和緊致度，減少光損傷和色斑，減少細(xì)紋和深部皺紋，大大增加角質(zhì)細(xì)胞的增殖，促進(jìn)頭發(fā)生長(zhǎng)；其衍生物pal-ghk有豐唇的功效，使用在唇膏的生成上，使用后試嘴唇看起來(lái)豐潤(rùn)柔亮，也是安全的豐胸產(chǎn)品原料之一。

目前，ghk/ahk的合成方法主要是液相合成以及經(jīng)典固相合成。其中液相合成方法均基于使用保護(hù)的氨基酸在縮合劑的作用下由n端向c端逐個(gè)合成，通過(guò)氨基酸保護(hù)，兩次縮合，脫保護(hù)，得到ghk/ahk（發(fā)明專(zhuān)利申請(qǐng)說(shuō)明書(shū)cn201310751827.1）。cn201310751827.1中使用了縮合劑，這些縮合劑成本高，容易發(fā)生副反應(yīng)，產(chǎn)生消旋產(chǎn)物，而且縮合劑副產(chǎn)物容易殘留在產(chǎn)品里，影響產(chǎn)品質(zhì)量。固相合成將氨基酸由c端向n端逐個(gè)延伸，通過(guò)縮合、脫保護(hù)、再縮合、切割樹(shù)脂、離心、凍干、液相制備得到純度高于90%的ghk/ahk產(chǎn)品（謝進(jìn),曹福祥.“固相合成甘氨酰組氨酰賴(lài)氨酸”精細(xì)化工中間體,2008,38(6)）。該方法所用到的樹(shù)脂昂貴，且交換活性小，合成過(guò)程中使用的縮合劑以及堿都大大過(guò)量，使ghk/ahk的生產(chǎn)成本增高，因此降低ghk/ahk生產(chǎn)成本的工藝方法具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)在于提供一種原料易得、成本低、副產(chǎn)物少和產(chǎn)物易分離的ghk或ahk三肽的合成方法。所述技術(shù)方案如下：

本發(fā)明公開(kāi)了一種ghk或ahk三肽的合成方法，該方法包括：酰氯與硅烷保護(hù)的組氨酸反應(yīng)得到相應(yīng)的氯取代二肽（中間體a），與三氟乙酸酐（用于保護(hù)組氨酸咪唑環(huán)上的間位亞氨基）反應(yīng)得到三氟乙?；Ｗo(hù)物（中間體b），再與酰氯化試劑反應(yīng)制成相應(yīng)的酰氯產(chǎn)物（中間體c），然后與三氟乙酰賴(lài)氨酸反應(yīng)得到相應(yīng)的氯取代三肽（中間體d），最后氨解并脫去三氟乙?；玫絞hk或ahk。其中，酰氯為氯乙酰氯、2-氯丙酰氯或3-氯丙酰氯，氯乙酰氯用于合成ghk，2-氯丙酰氯或3-氯丙酰氯用于合成ahk。其反應(yīng)方程式如下：

其中，r1為clch2-、ch3chcl-或clch2ch2-，r2對(duì)應(yīng)為nh2ch2-（對(duì)應(yīng)ghk）、ch3ch(nh2)-（對(duì)應(yīng)ahk）或nh2ch2ch2-（對(duì)應(yīng)ahk）。

具體地，本發(fā)明提供的方法包括：

(1)酰氯與硅烷保護(hù)的組氨酸在非極性溶劑1中于0-50℃條件下反應(yīng)，反應(yīng)完成后用水淬滅得到中間體a，中間體a為氯乙酰組氨酸/2-氯丙酰組氨酸/3-氯丙酰組氨酸，其結(jié)構(gòu)式為：

。

(2)將中間體a溶于三氟乙酸中，于10-40℃條件下與三氟乙酸酐反應(yīng)得到中間體b，中間體b為氯乙酰（三氟乙酰）組氨酸/2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酸/3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酸，其結(jié)構(gòu)式為：

。

(3)中間體b在有機(jī)溶劑中于20-80℃條件下與酰氯化試劑反應(yīng)得到中間體c，中間體c為氯乙酰（三氟乙酰）組氨酰氯/2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰氯/3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰氯，其結(jié)構(gòu)式為：

。

(4)將中間體c溶于非質(zhì)子溶劑1中，在有機(jī)堿的作用下于10-40℃條件下與三氟乙酰賴(lài)氨酸（r基團(tuán)上氨基保護(hù)）反應(yīng)得到中間體d，中間體d為氯乙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸/2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸/3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，其結(jié)構(gòu)式為：

。

(5)中間體d與氨水于10-90℃條件下氨解并脫去（賴(lài)氨酸和組氨酸上的）三氟乙?；玫疆a(chǎn)品ghk或ahk（產(chǎn)品e），ghk或ahk的結(jié)構(gòu)式為：

。

其中，r1為clch2-、ch3chcl-、clch2ch2-，r2對(duì)應(yīng)為nh2ch2-、ch3ch(nh2)-、nh2ch2ch2-。

其中，步驟(1)包括：將組氨酸用硅烷保護(hù)后溶解于非極性溶劑1中，于0-30℃滴加酰氯，滴加完成后于0-50℃條件下反應(yīng)2-8小時(shí)，反應(yīng)完成后用水淬滅，抽濾，干燥得到中間體a。其中，酰氯與組氨酸的摩爾比為1.0-1.5：1，組氨酸與水的摩爾比為1：2-5，非極性溶劑1選自甲苯、氯仿、二氯甲烷或四氫呋喃等。

其中，步驟(2)包括：將中間體a溶于2-10倍體積的三氟乙酸中，于-10-10℃滴加三氟乙酸酐，滴加完成后升溫至10-40℃反應(yīng)0.5-4.0小時(shí)，濃縮得到油狀物，加入5-15倍體積的非極性溶劑2析晶，抽濾、干燥得到中間體b。其中，三氟乙酸酐與中間體a的摩爾比為1.0-1.5：1，非極性溶劑2選自甲苯、氯仿或二氯甲烷等。

其中，步驟(3)包括：將中間體b混入4-10倍體積的有機(jī)溶劑中，于20-80℃滴加酰氯化試劑，滴加完成后保溫反應(yīng)（20-80℃）2小時(shí)以上，反應(yīng)完成后減壓蒸去溶劑并用2-10倍體積的非質(zhì)子溶劑2溶解制成中間體c溶液。其中，中間體b與酰氯化試劑的摩爾比為1:1.05-2.00，酰氯化試劑為二氯亞砜或用非質(zhì)子溶劑（甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等）溶解的三光氣等，有機(jī)溶劑選自甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等，非質(zhì)子溶劑2選自甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等。

其中，步驟(4)包括：將三氟乙酰賴(lài)氨酸溶于2-20倍體積的非質(zhì)子溶劑1中，降溫至10℃以下，加入有機(jī)堿，滴加中間體c溶液，滴加完成后于10-40℃條件下反應(yīng)1小時(shí)以上，反應(yīng)完成后濃縮至干，加極性溶劑1析晶得到中間體d。其中，三氟乙酰賴(lài)氨酸與中間體c的摩爾比為1：1.0-1.5，有機(jī)堿與中間體c的摩爾比為1.0-1.5：1，非質(zhì)子溶劑1選自甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等，有機(jī)堿選自三甲胺，三乙胺或diea（n,n-二異丙基乙胺）等，極性溶劑1選自甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮等。

其中，步驟(5)包括：將中間體d與3-20倍體積的氨水混合后，于10-90℃條件下保持體系壓力反應(yīng)1小時(shí)以上，反應(yīng)完成后減壓濃縮至油狀物，加入極性溶劑2析晶，抽濾，得到ghk或ahk固體，純度大于97%。其中，極性溶劑2選自甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮等，氨水含量為15wt%以上。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供的方法包括：

(1)將組氨酸用硅烷保護(hù)后溶解于非極性溶劑1中，于0-30℃滴加酰氯，滴加完成后于0-50℃條件下反應(yīng)2-8小時(shí)，反應(yīng)完成后用水淬滅，抽濾，干燥得到中間體a。其中，酰氯與組氨酸的摩爾比為1.0-1.5：1，組氨酸與水的摩爾比為1：2-5，非極性溶劑1選自甲苯、氯仿、二氯甲烷或四氫呋喃等，中間體a的結(jié)構(gòu)式為：

。

(2)將步驟(1)得到的中間體a溶于2-10倍體積的三氟乙酸中，于-10-10℃滴加三氟乙酸酐，滴加完成后升溫至10-40℃反應(yīng)0.5-4.0小時(shí)，濃縮得到油狀物，加入5-15倍體積的非極性溶劑2析晶，抽濾、干燥得到中間體b。其中，三氟乙酸酐與中間體a的摩爾比為1.0-1.5：1，非極性溶劑2選自甲苯、氯仿或二氯甲烷等，中間體b的結(jié)構(gòu)式為：

。

(3)將步驟(2)得到的中間體b混入4-10倍體積的有機(jī)溶劑中，于20-80℃滴加酰氯化試劑，滴加完成后保溫反應(yīng)2小時(shí)以上，反應(yīng)完成后減壓蒸去溶劑并用2-10倍體積的非質(zhì)子溶劑2溶解制成中間體c溶液。其中，中間體b與酰氯化試劑的摩爾比為1:1.05-2.00，酰氯化試劑為二氯亞砜或用非質(zhì)子溶劑溶解的三光氣等，有機(jī)溶劑選自甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等，非質(zhì)子溶劑2選自甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等，中間體c的結(jié)構(gòu)式為：

。

(4)將三氟乙酰賴(lài)氨酸溶于2-20倍體積的非質(zhì)子溶劑1中，降溫至10℃以下，加入有機(jī)堿，滴加步驟(3)得到的中間體c溶液，滴加完成后于10-40℃條件下反應(yīng)1小時(shí)以上，反應(yīng)完成后濃縮至干，加極性溶劑1析晶得到中間體d。其中，三氟乙酰賴(lài)氨酸與中間體c的摩爾比為1：1.0-1.5，有機(jī)堿與中間體c的摩爾比為1.0-1.5：1，非質(zhì)子溶劑1選自甲苯、氯仿、四氫呋喃或二氯甲烷等，有機(jī)堿選自三甲胺，三乙胺或diea等，極性溶劑1選自甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮等，中間體d的結(jié)構(gòu)式為：

。

(5)將步驟(4)得到的中間體d與3-20倍體積的氨水混合后，于10-90℃條件下保持體系壓力反應(yīng)1小時(shí)以上，反應(yīng)完成后減壓濃縮至油狀物，加入極性溶劑2析晶，抽濾，得到ghk或ahk固體。其中，極性溶劑2選自甲醇、乙醇、異丙醇或丙酮等。

本發(fā)明提供的方法避免了使用縮合劑，三氟乙?；梢杂冒彼摫Ｗo(hù)，同時(shí)氨解得到ahk或ghk三肽，減少了副產(chǎn)物并使純度達(dá)到97%以上，大幅度減少了生產(chǎn)成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

以下通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述，但不限于以下所述內(nèi)容。

實(shí)施例1

1、合成氯乙酰組氨酸

將50g（0.32mol）l-組氨酸用硅烷保護(hù)后，用100ml氯仿溶解，降溫至0℃，滴加38.4g（0.34mol）氯乙酰氯，滴加完畢后，升溫至20-30℃，反應(yīng)5小時(shí)，用18.4g（1.02mol）水淬滅，攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾，60℃真空干燥得到70.2g氯乙酰組氨酸，收率：95.0%，hplc純度：98.6%。

2、合成氯乙酰（三氟乙酰）組氨酸：

反應(yīng)瓶中加入70g（0.30mol）氯乙酰組氨酸，300ml三氟乙酸，降溫至-5℃，滴加69.3g（0.31mol）三氟乙酸酐，升溫至20℃反應(yīng)3小時(shí)，反應(yīng)液減壓濃縮至油狀物，加入500ml甲苯析晶，抽濾，得到90.2g，收率：91.9%，hplc純度：97.1%。

3、合成酰氯：

反應(yīng)瓶中加入90g（0.27mol）氯乙酰（三氟乙酰）組氨酸，350ml氯仿升溫至40-50℃，滴加38.1g（0.32mol）二氯亞砜，保溫反應(yīng)4小時(shí)，減壓蒸去溶劑，得到黃褐色固體，加入300ml二氯甲烷溶解備用。

4、合成氯乙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸

反應(yīng)瓶中加入63.5g（0.26mol）三氟乙酰賴(lài)氨酸，300ml二氯甲烷，降溫至5℃，加入28.3g（0.28mol）tea（三乙胺），滴加步驟3中制備的酰氯，在25℃反應(yīng)4小時(shí)，將反應(yīng)液濃縮至干，得到油狀物，加入300ml異丙醇析晶，抽濾，得到固體，60℃真空干燥得130.5g氯乙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，收率91.1%%，hplc純度：97.6%。

5、合成ghk

耐壓瓶中加入130g（0.23mol）氯乙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，600ml濃氨水，密封升溫至50℃，反應(yīng)2小時(shí)，泄壓，反應(yīng)液濃縮至油狀物，加入500ml甲醇析晶，抽濾，固體60℃真空干燥得到67.6gghk，收率：86.4%，hplc純度為：96.8%；經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單純化，得到61.2g固體，hplc純度98.9%。

實(shí)施例2

1、合成2-氯丙酰組氨酸

將50g（0.32mol）l-組氨酸用有機(jī)硅保護(hù)后，用100ml氯仿溶解，降溫至0℃，滴加44.7g（0.35mol）2-氯丙酰氯，滴加完畢后，升溫至20-30℃，反應(yīng)3小時(shí)，用19.8g（1.1mol）水淬滅，攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾，60℃真空干燥得到74.6g2-氯丙酰組氨酸，收率：95.1%，hplc純度：98.6%。

2、合成2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酸：

在反應(yīng)瓶中加入74g（0.30mol）2-氯丙酰組氨酸，350ml三氟乙酸，降溫至0℃，滴加66.6g（0.32mol）三氟乙酸酐，滴加完畢后升溫至35℃反應(yīng)2小時(shí)，減壓濃縮得到油狀物，加入650ml二氯甲烷析晶，抽濾，固體烘干得到91.3g，收率：89.2%，hplc純度：97.6%。

3、合成酰氯

反應(yīng)瓶中加入90g（0.26mol）2-氯丙酰組氨酸，300ml氯仿升溫至40-50℃，滴加36.9g（0.31mol）二氯亞砜，反應(yīng)液溶清，保溫反應(yīng)4小時(shí)，減壓蒸去溶劑，得到黃褐色固體，加入300ml氯仿溶解備用。

4、合成2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸

反應(yīng)瓶中加入58.1g（0.24mol）三氟乙酰賴(lài)氨酸，400ml氯仿，降溫至0℃，加入30g（0.30mol）tea，滴加步驟3中制備的酰氯，在20℃反應(yīng)5小時(shí)，將反應(yīng)液濃縮至干，得到油狀物，加入400ml95%乙醇醇析晶，抽濾，得到固體，60℃真空干燥得124.0g2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，收率91.3%，hplc純度：98.1%。

5、合成ahk

壓力釜中加入120g（0.21mol）2-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，800ml濃氨水，密封升溫至60℃，反應(yīng)4小時(shí)，泄壓，反應(yīng)液濃縮至油狀物，加入600ml乙醇析晶，抽濾，固體60℃真空干燥得到66.0gahk，收率：88.8%，hplc純度為：97.2%；經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單純化，得到61.3g固體，hplc純度99.2%。

實(shí)施例3

1、合成3-氯丙酰組氨酸

將50g（0.32mol）l-組氨酸用硅烷保護(hù)后，用200ml甲苯溶解，降溫至0℃，滴加60.9g（0.48mol）3-氯丙酰氯，滴加完畢后，升溫至40-50℃，反應(yīng)3小時(shí)，用20.7g（1.15mol）水淬滅，攪拌1小時(shí)后，過(guò)濾，60℃真空干燥得到75.3g3-氯丙酰組氨酸，收率：96.0%，hplc純度：98.1%。

2、合成3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酸：

在反應(yīng)瓶中加入75g（0.31mol），400ml三氟乙酸，降溫至-10℃，滴加82.1g（0.39mol）三氟乙酸酐，滴加完畢后升溫至10℃反應(yīng)4小時(shí)，反應(yīng)液濃縮得到油狀物，加入500ml四氫呋喃析晶，抽濾，干燥得到93.1g，收率：88.1%，純度：98.0%。

3、合成酰氯

反應(yīng)瓶中加入93g（0.27mol）3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酸，350ml四氫呋喃升溫至40-50℃，滴加41.6g（0.35mol）二氯亞砜，反應(yīng)液溶清，保溫反應(yīng)6小時(shí)，減壓蒸去溶劑，得到黃褐色固體，加入400ml氯仿溶解備用。

4、合成3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸

反應(yīng)瓶中加入55.7g（0.23mol）三氟乙酰賴(lài)氨酸，300ml四氫呋喃，降溫至-5℃，加入34g（0.34mol）tea，滴加步驟3中制備的酰氯，在10℃反應(yīng)6小時(shí)，將反應(yīng)液濃縮至干，得到油狀物，加入500ml甲醇：乙醇2:1（v/v）混合溶劑析晶，抽濾，得到固體，60℃真空干燥得117.6g3-氯丙酰（三氟乙酰）組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，收率90.4%，hplc純度：97.6%。

5、合成beta-ahk

壓力釜中加入117g（0.21mol）3-氯丙酰組氨酰（n6-三氟乙酰）賴(lài)氨酸，1000ml濃氨水，密封升溫至65℃，反應(yīng)6小時(shí)，泄壓，反應(yīng)液濃縮至油狀物，加入700ml甲醇：乙醇1:3（v/v）混合溶劑析晶，抽濾，固體60℃真空干燥得到65.2gbeta-ahk，收率：87.7%，hplc純度為：97.6%；經(jīng)過(guò)一次簡(jiǎn)單純化，得到59.2g固體，hplc純度98.6%。

如上所述，以上描述僅在于展示本發(fā)明的多個(gè)實(shí)施例，顯而易見(jiàn)，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不違背本發(fā)明的前提下，可進(jìn)行部分修改和變更，上文的描述提及的內(nèi)容僅作為說(shuō)明性的例證，并非作為對(duì)本發(fā)明的限制；具有本文所述技術(shù)特征的三乙胺鹽酸鹽催化制備二氯鹵代烷的方法，均落入本專(zhuān)利保護(hù)范圍。