本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種亞臨界水萃取界蘿卜葉中山奈苷的方法。
背景技術(shù)：
亞臨界水又稱超加熱水、高壓熱水或熱液態(tài)水，是指在一定的壓力下，將水加熱到100℃以上臨界溫度374℃以下的高溫，水體仍然保持在液體狀態(tài)。亞臨界狀態(tài)下流體微觀結(jié)構(gòu)的氫鍵、離子水合、離子締合、簇狀結(jié)構(gòu)等發(fā)生了變化，因此亞臨界水與常溫常壓下的水在性質(zhì)上有較大差別。亞臨界狀態(tài)下，隨著溫度的升高，水的極性可在較大范圍內(nèi)變化，水的極性可由強極性漸變?yōu)榉菢O性，其性質(zhì)更類似于有機溶劑，可將溶質(zhì)按極性由高到低萃取出來。亞臨界水萃取技術(shù)已成為食品、化工、中草藥開發(fā)領(lǐng)域中最引人注目的技術(shù)，被迅速運用于食品添加劑、功能因子的制備和食品加工廢棄物的回收再資源化。
山奈苷(kaempferitrin)，別名：山奈酚-3,7-o-l-二鼠李糖苷(kaempferol-3,7-l-
dirhamnoside)，分子式：c27h30o14，分子量：578.57，據(jù)文獻(xiàn)報道，山奈苷具有降血壓、降血糖、抗疲勞、清熱解毒、抗骨質(zhì)疏松等藥理活性。山柰苷的制備主要以傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根為原料，經(jīng)醇提后濃縮，采用柱層析分離純化，凍干后得到相應(yīng)的產(chǎn)品。中國專利cn201210382477、201410183257.5、200810068891.9、105732743a分別公開了從紫葉李樹葉、山螞蝗、槐角、陰香葉中分離提取山奈苷的方法。
蘿卜葉是十字花科植物蘿卜（raphanussativusl.）的根生葉，又稱萊菔葉。蘿卜是我國一種重要的蔬菜，全國各地均有種植，可四季栽培，全年供應(yīng)，產(chǎn)銷量很大。蘿卜葉作為蘿卜的副產(chǎn)品，資源也十分豐富。蘿卜葉的營養(yǎng)成分豐富，美國公眾科學(xué)中心將蘿卜葉列于超級營養(yǎng)蔬菜第三名。同時，蘿卜葉還具有很高的營養(yǎng)價值和藥用價值?，F(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)研究表明，蘿卜葉具有促進(jìn)胃腸蠕動、治療胃潰瘍、抗氧化及降血壓等多種生物活性。前期研究發(fā)現(xiàn)，蘿卜葉中含有山奈苷組分，但目前尚未有從蘿卜葉中提取分離山柰苷的文獻(xiàn)報道和專利申請。本發(fā)明可進(jìn)一步擴大蘿卜葉的開發(fā)和利用，同時也為山奈苷的提取提供新資源和新方法，可產(chǎn)生良好的社會效益和可觀的經(jīng)濟效益。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種利用亞臨界水萃取技術(shù)從蘿卜葉中萃取山奈苷的方法。
本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種亞臨界水萃取蘿卜葉中山奈苷的方法，按照下述步驟進(jìn)行：
步驟1、以蘿卜葉為原料，干燥后粉碎過20~200目篩；
步驟2、原料置于萃取釜中，用亞臨界水對蘿卜葉粉末進(jìn)行萃取，經(jīng)抽濾后，對濾渣重復(fù)萃取三次，合并提取液，減壓濃縮至流浸膏；
步驟3、將步驟2所述浸膏上大孔吸附樹脂層析柱進(jìn)行初步分離，上樣后，先用蒸餾水洗脫除去未吸附的水溶性雜質(zhì)，再用一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液洗脫，收集有效餾分液；
步驟4、將上述有效餾分液置于低溫條件下，使其析出結(jié)晶為山奈苷粗品；粗品再經(jīng)重結(jié)晶、真空干燥后得山奈苷純品。
步驟2中，所述蘿卜葉與亞臨界水的用量比為1g:10~50ml；所述萃取在亞臨界萃取設(shè)備中進(jìn)行，萃取溫度為100~200℃，萃取時間為8~60min，壓力為4~10mpa。
步驟3中，所述大孔吸附樹脂為非極性或中等極性，具體型號為d101、ab-8和ads-17等；所述一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇水溶液中，乙醇的體積分?jǐn)?shù)為25~35%；所述有效餾分液為經(jīng)檢測含有山奈苷的餾分液。
步驟4中，所述低溫條件為0~5℃；所述重結(jié)晶的具體步驟為：邊滴加乙醇邊攪拌并加熱，至所有粗品均能溶解，迅速趁熱濾去不溶性雜質(zhì)，得澄清的濾液，在0~5℃的條件下將澄清的濾液靜置1~7d，使重結(jié)晶，以獲得山奈苷純品。
本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明公開的亞臨界水萃取蘿卜葉中山奈苷的方法，所用萃取溶劑和蘿卜葉原料低廉易得，涉及到的工藝流程簡單，操作簡便，涉及到的化學(xué)藥劑成本較低，可回收重復(fù)使用，無有毒有害試劑污染，可進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，可用于醫(yī)藥用原料藥。
附圖說明
圖1為從蘿卜葉中分離得到山奈苷單體化合物的hplc圖。
具體實施方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法；所述試劑和材料，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。
實施例1
取粉碎過60目篩的蘿卜葉粉末100g，置于亞臨界水萃取釜中，加入1000ml水，控制萃取壓力3mpa，萃取溫度100℃，萃取時間60min，萃取結(jié)束后，冷卻至室溫，經(jīng)抽濾，濾渣重復(fù)提取三次，合并濾液，真空減壓濃縮；將濃縮液液以3ml/min流速上大孔樹脂色譜柱（ab-8大孔吸附樹脂，非極性，玻璃柱型號為φ3.0*l100cm）,以同樣的流速，用2000ml蒸餾水沖洗柱子；采用體積分?jǐn)?shù)為25%的乙醇水溶液洗脫，收集山奈苷有效餾分液，用高效液相色譜檢測（方法見實施例3）；將收集的有效餾分液于0℃下靜置1d，析出結(jié)晶后過濾，得山奈苷粗品；將粗品邊滴加乙醇邊攪拌并加熱，至所有粗品均能溶解，迅速趁熱濾去不溶性雜質(zhì)，得澄清的濾液，將該濾液于0℃的條件下靜置1，經(jīng)重結(jié)晶，室溫真空干燥后，得山奈苷純品。經(jīng)hplc檢測，山奈苷含量大于95%，提取率為81.3%。
實施例2
取粉碎過200目篩的蘿卜葉粉末100g，置于亞臨界水萃取釜中，加入5000ml水，控制萃取壓力10mpa，萃取溫度200℃，萃取時間8min，萃取結(jié)束后，冷卻至室溫，經(jīng)抽濾，濾渣重復(fù)提取三次，合并濾液，真空減壓濃縮；將所得濃縮液以3ml/min流速上大孔樹脂色譜柱（ads-17大孔吸附樹脂，中等極性，玻璃柱型號為φ3.0*l100cm）,以同樣的流速，用2000ml蒸餾水沖洗柱子；采用體積分?jǐn)?shù)為35%的乙醇水溶液洗脫，收集山奈苷有效餾分液，用高效液相色譜檢測（方法見實施例3）；將收集的有效餾分液于5℃下靜置7d，析出結(jié)晶后過濾，得山奈苷粗品；將粗品邊滴加乙醇邊攪拌并加熱，至所有粗品均能溶解，迅速趁熱濾去不溶性雜質(zhì)，得澄清的濾液，將該濾液于5℃的條件下靜置7d，經(jīng)重結(jié)晶，室溫真空干燥后，得山奈苷純品。經(jīng)hplc檢測，山奈苷含量大于95%，提取率為88.7%。
實施例3
本實施例為山奈苷檢測方法的實施例。
山奈苷通過高效液相色譜法檢測，山奈苷產(chǎn)品在檢測波長為344nm，經(jīng)安捷倫zorbaxsb-c18柱（4.6×250mm，5μm）分離（流動相：a相為1%的乙酸水溶液，b相為甲醇；流速為1ml/min，柱溫為25℃，梯度洗脫），色譜圖如圖1所示，山奈苷在30.93min處出現(xiàn)色譜峰，在同一色譜條件下，該峰的保留時間與山柰苷對照品的保留時間一致。