整體而言，本發(fā)明涉及一種于哺乳類個(gè)體中抑制黑色素生成或降低黑色素含量的勝肽，以及其方法及其組合物。

背景技術(shù)：

人類色素沉著最顯著的原因是由于皮膚及頭發(fā)中黑色素的合成及分布。因此，在皮膚和頭發(fā)的顏色主要取決于存在的色素種類及其濃度。

美國第6,579,848號專利是關(guān)于刺鼠訊號蛋白及勝肽以及其醫(yī)藥組合物及它們在抑制黑色素細(xì)胞的黑色素生成的方法上的用途。美國第8,669,238號專利揭示一種用于治療過度色素沉著的方法，包括投予一組合物至患有過度色素沉著的個(gè)體，該組合物包含至少一種選自于由下列所組成的群組的抑制劑：驅(qū)動蛋白kif13a抑制劑、ap-1連接物復(fù)合體次單元的抑制劑、以及ap-1連接物復(fù)合體次單元或ap-1連接物復(fù)合體與驅(qū)動蛋白kif13a之間的交互作用的抑制劑。美國第8,455,023號專利是關(guān)于香桂(cinnamomumsubavenium)萃取物以及其通過抑制黑色素生成在美白美容中的用途。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明發(fā)明人非預(yù)期地發(fā)現(xiàn)序列為ssastted(seqidno:1)的勝肽可有效地在哺乳類個(gè)體中抑制或降低黑色素生成。

因此，在一方面，本發(fā)明提供一種單離的或合成的勝肽，用于在哺乳類個(gè)體中抑黑色素生成或降低哺乳個(gè)體的黑色素細(xì)胞的黑色素含量。該單離的或合成的勝肽是由seqidno:1的氨基酸序列所組成。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于在哺乳類個(gè)體中抑制黑色素生成或降低哺乳個(gè)體的黑色素細(xì)胞的黑色素含量的方法，其包含對該個(gè)體或該黑色素細(xì)胞投予有效量的根據(jù)本發(fā)明的單離的或合成的勝肽。在本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例中，該單離的或合成的勝肽是局部地投予至該個(gè)體。

又一方面，本發(fā)明提供一種用于在哺乳類個(gè)體中抑制黑色素生成或降低哺乳個(gè)體的黑色素細(xì)胞的黑色素含量的組合物。該組合物包含有效量的單離的或合成的勝肽，其是由seqidno:1的氨基酸序列所組成。根據(jù)本發(fā)明的特定具體實(shí)施例，該組合物可進(jìn)一步包含一可接受的載體，且可調(diào)制為局部用制劑。

應(yīng)理解的是，前述的一般性說明及以下的詳細(xì)說明皆僅為例示性及解釋性的，并不限制本發(fā)明。

附圖說明

配合附圖一起閱讀將可更佳地理解前述的發(fā)明內(nèi)容，以及下述的詳細(xì)說明。為了說明本發(fā)明的目的，在圖式中顯示目前較佳的具體實(shí)施例。

在圖式中：

圖1顯示在細(xì)胞中由本發(fā)明的勝肽所致的減少的黑色素生成。以10-50μg/ml的seqidno:1的勝肽(lfh-392-399)處理b16f10黑色素瘤細(xì)胞5天，并于第3天更換培養(yǎng)基。將細(xì)胞及培養(yǎng)基收集于試管中。已知曲酸對于酪胺酸酶活性的抑制效果，因此，在細(xì)胞試驗(yàn)中以其做為陰性對照組。已知ibmx可增進(jìn)細(xì)胞內(nèi)camp的含量，進(jìn)而刺激黑色素生成，因此，在細(xì)胞試驗(yàn)中，以其做為陽性對照組。

圖2a顯示細(xì)胞中的黑色素含量。

圖2b顯示黑色素在培養(yǎng)基中的分泌情況。每次測量皆為三重復(fù)，數(shù)據(jù)以平均值±s.d.表示。相較于對照組，*p＜0.05。

圖3顯示由本發(fā)明勝肽所增加的酪氨酸酶活性。相較于對照組，*p＜0.05。

圖4顯示dopa染色的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

在一方面，本發(fā)明提供一種用于在哺乳類個(gè)體中抑制黑色素生成或降低哺乳類個(gè)體的黑色素細(xì)胞的黑色素含量的單離的或合成的勝肽，該單離的或合成的勝肽是由ssastted(seqidno:1)的氨基酸序列所組成。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于在哺乳類個(gè)體中抑制黑色素生成或降低哺乳類個(gè)體的黑色素細(xì)胞的黑色素含量的方法。該方法包含以下步驟：將該單離的或合成的seqidno:1的勝肽，可在該哺乳類個(gè)體中有效抑制黑色素生成的量，或以可有效降低該黑色素細(xì)胞的黑色素含量的量，投予至該哺乳類個(gè)體或該哺乳類個(gè)體的黑色素細(xì)胞。較佳地，該單離的或合成的勝肽是局部地投予。

又一方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含一有效量的由seqidno:1的氨基酸序列所組成的單離的或合成的勝肽。本發(fā)明的組合物可用于抑制黑色素生成或降低哺乳類個(gè)體的黑色素細(xì)胞中的黑色素含量。該組合物可用于化妝品用途，例如，皮膚美白。

在本發(fā)明的特定具體實(shí)施例中，該組合物進(jìn)一步包含一(生理上)可接受的載體。

在特定較佳具體實(shí)施例中，本發(fā)明的組合物是調(diào)制為局部用制劑。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)及科學(xué)術(shù)語具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員對于本發(fā)明所屬領(lǐng)域的理解相同的含義。

用語「一」或「一個(gè)」在權(quán)利要求書及/或說明書中與術(shù)語「包括」一起使用時(shí)，其意思為「一個(gè)」，但其亦與「一或多個(gè)」、「至少一個(gè)」、以及「一或多于一個(gè)」的含義一致。

用語「勝肽」在本文中是以其常規(guī)含義而被使用，亦即為一種聚合物，其單體為氨基酸，并藉由酰胺鍵而互相連結(jié)在一起，另可選擇地，其是指多肽(polypeptide)。當(dāng)該氨基酸為α-氨基酸時(shí)，可使用l-光學(xué)異構(gòu)物或d-光學(xué)異構(gòu)物。此外，亦可包含非天然的氨基酸，例如，β-丙氨酸、苯甘氨酸及高精氨酸。使用氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫。

本文中所使用的術(shù)語「載體」是指一般用于調(diào)制可增進(jìn)穩(wěn)定性、無菌性、遞送性的藥物或化妝品組合物的材料。當(dāng)勝肽遞送系統(tǒng)調(diào)制為一種溶液或懸浮液時(shí)，該遞送系統(tǒng)是于一可接受載體中，較佳地為水性載體?？墒褂枚喾N水性載體，例如，水、緩沖液、0.8％鹽水、0.3％甘氨酸、透明質(zhì)酸等。該組合物可含有如所需要而可接近生理?xiàng)l件的生理上可接受的輔助物質(zhì)，例如ph調(diào)整及緩沖劑、溶液張力調(diào)節(jié)劑、潤濕劑及其類似物，例如，乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、山梨醇酐單月桂酸酯、油酸三乙醇胺等。

術(shù)語「局部的」或「局部地」在本文中是以其常規(guī)含義而被使用，其是指可以在身體任何部位內(nèi)或上的位置，包括但不限定于表皮、任何其他真皮、或任何其他身體組織。局部地投予或施予意指使該勝肽直接與組織接觸，例如含有黑色素生成細(xì)胞的皮膚或膜。

本發(fā)明設(shè)計(jì)使用單離的或合成的seqidno:1所示的勝肽作為針對各種用途的活性成分。在一較佳具體實(shí)施例中，本發(fā)明的單離的或合成的勝肽是與一可接受的載體組合而形成一種可置放于皮膚上的局部用制劑。局部用制劑可包括軟膏、乳液、糊劑、乳霜、凝膠、滴劑、塞劑、噴霧、液劑、洗發(fā)劑、護(hù)發(fā)劑、粉末及經(jīng)皮貼片。根據(jù)需要，可使用增稠劑、稀釋劑、乳化劑、分散助劑或黏合劑。較佳地，載體的功能為增加本發(fā)明勝肽的皮膚滲透性，并且在體內(nèi)條件下應(yīng)能將該勝肽遞送至黑色素細(xì)胞。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，合適的載體為習(xí)知，且其包括但不限于水、二甲基亞砜、乙醇、脂質(zhì)體、液體石蠟、石蠟、二甲基甲酰胺、2-吡咯烷酮、油酸、以及品牌的滲透增進(jìn)劑。

通過以下實(shí)例進(jìn)一步說明本發(fā)明，所述實(shí)例是以提供例示性的目的提供而非限制。

實(shí)例

實(shí)例1：seqidno:1所示的勝肽抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞的黑色素生成

1.材料與方法

1.1單離的或合成的seqidno:1所示的勝肽的制備

得自人類乳鐵蛋白且具有ssastted(seqidno:1)(796.75da)氨基酸序列的勝肽是由生工有限公司(mdbio,inc.)(中國臺灣，臺北)所合成。以高效液相層析法(hplc)及質(zhì)譜儀確認(rèn)該勝肽的純度及組成。使10mg的勝肽粉末溶解并與1ml的雙去離子水(ddh2o)混合，而制得10mg/ml的seqidno:1所示的勝肽樣本，將其儲存于-20℃下備用。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

在37℃且含有5％co2的加濕空氣下，將b16f10小鼠黑色素瘤細(xì)胞培養(yǎng)于無酚紅而含10％胎牛血清及青霉素/鏈霉素(100iu/50g/ml)的dmem中。

1.3黑色素含量檢測

根據(jù)leeetal.,jinvestdermatol124,405-411,2005的方法稍加修改以測定培養(yǎng)的b16f10細(xì)胞中的黑色素含量。簡言之，將b16f10細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)盤中(2×10⁴細(xì)胞/孔)，并培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼附。在培養(yǎng)箱中以各種測試樣本處理5天后，進(jìn)行清洗、經(jīng)胰蛋白酶處理并在丸?；?pelleting)前計(jì)數(shù)。在1mnaoh中煮沸1小時(shí)后，定量每個(gè)細(xì)胞中的黑色素，并在400nm下從針對合成真黑色素的校正曲線讀取每個(gè)樣本的黑色素含量，并由3個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)中，將其轉(zhuǎn)換成黑色素pg/細(xì)胞的平均值±se。

1.4酪胺酸酶測定

酪胺酸酶是黑色素生成路徑的限速酶。其測定可提供針對黑色素生成的誘導(dǎo)程度的高特異性及靈敏性指標(biāo)。根據(jù)belleietal.,jbiolchem285,7288-7299,2010的方法稍加修改以測定培養(yǎng)的b16f10細(xì)胞的酪氨酸酶酵素活性。簡言之，將b16f10細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)盤中(2×10⁴個(gè)細(xì)胞/孔)，并培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼附。在培養(yǎng)箱中以各種測試樣本處理5天后，以pbs清洗細(xì)胞，之后使用胰蛋白酶收集細(xì)胞。達(dá)培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)，以含有1％tritonx-100的磷酸鹽緩沖液(ph6.8)使細(xì)胞溶解。然后藉由冷凍及解凍將細(xì)胞打破，在10,000×g下離心10分鐘使裂解液澄清。以裂解緩沖液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量及調(diào)整蛋白質(zhì)濃度后，將100μl的各裂解液(各含有相同量的蛋白質(zhì))等量分注于96孔盤中，然后將100μl的5mml-dopa添加至每孔中。在37℃下培養(yǎng)30分鐘后，以分光亮度計(jì)測定在475nm下的吸光值。重復(fù)測定三次。

1.5dopa染色

亦進(jìn)行dopa染色以測定酪胺酸酶的酵素活性。將b16f10細(xì)胞種于6孔培養(yǎng)皿中(2×10⁴細(xì)胞/孔)，并培養(yǎng)過夜使細(xì)胞貼附。在培養(yǎng)箱中以各種測試樣本處理4天后，以pbs清洗細(xì)胞，再以2％多聚甲醛固定，并以pbs進(jìn)一步清洗三次，在37℃下將細(xì)胞反應(yīng)于0.1％dopa(溶于0.1m的pbs中)中5小時(shí)，并以光學(xué)顯微鏡觀察(wangetal.,expthermed6,967-972,2013)。

2.結(jié)果

2.1對黑色素生成的影響

以50μg/ml的seqidno:1所示的勝肽處理的b16f10細(xì)胞培養(yǎng)物，顯示出較少的細(xì)胞色素沉著(圖1)。

2.2對黑色素含量的影響

以10及50μg/ml的seqidno:1所示的勝肽處理b16f10細(xì)胞顯示出顯著地降低的黑色素合成量(圖2a及圖2b)。

2.3對于酪胺酸酶活性的效果

以10及50μg/ml的seqidno:1所示的勝肽處理b16f10細(xì)胞顯示出顯著地降低的酪胺酸酶活性(圖3)，且細(xì)胞亦顯示出較弱的dopa染色(圖4)。

本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解在不脫離本發(fā)明的廣義發(fā)明概念的情況下，可修改上述具體實(shí)施例。因此，可理解的是，本發(fā)明并不局限于所揭示的特定具體實(shí)施例，而旨在于涵蓋由所附申請專利范圍所定義的本發(fā)明精神及范圍內(nèi)的修飾。