免疫調節(jié)勝肽用于治療或預防發(fā)炎相關疾病的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種在個體中治療或預防發(fā)炎相關疾病的方法，其包含施予該個體一醫(yī)藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQIDNO：1的免疫調節(jié)勝肽。本發(fā)明還提供一種在個體中抑制癌轉移或腫瘤生長的方法，其包含施予該個體一醫(yī)藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQIDNO:1的免疫調節(jié)勝肽。
【專利說明】免疫調節(jié)勝肽用于治療或預防發(fā)炎相關疾病的方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明關于一種利用調節(jié)免疫反應、阻止及減少癥狀產生的組合物治療或預防發(fā)炎相關疾病的方法。另外，本發(fā)明還關于一種利用一組合物改變基因表達量表不為免疫調解效果的方法。

【背景技術】
[0002]人體內產生免疫反應的目的是清除致病微生物和惡性細胞，但過度免疫反應則會產生危及生命的臨床癥狀。調節(jié)過度免疫反應可消除發(fā)炎現(xiàn)象，并使組織回復完整性。先前報告指出嗜酸性白血球增多癥可由許多情況引起，例如早產兒、體內建立合成代謝狀態(tài)、藥物反應、對外來抗原反應、慢性肺病、紅血球生成素治療、全靜脈營養(yǎng)輸液及感染{Marc B.Ro thenberg，(1998) NE,，338:1592-1600 )等。在造成嗜酸性白血球增多癥過敏或血管炎的原因中，以嗜酸性白血球性肺疾病最值得注意，相關疾病包括急性與慢性嗜酸性白血球性肺炎、過敏性支氣管肺曲菌癥、過敏性血管炎和肉芽腫(邱格及史特勞斯氏癥(Churg-Strausssyndrome) —嗜酸性白血球增多癥、氣喘、系統(tǒng)性血管炎和肺部浸潤)(.Singh V et al., (2009) IJASM 53: 58-64, Ayalew Tefferi et al., (2010) MayoClin Proc.，85: 158- 164)0
[0003]CCL-1l (CC型趨化介素配體-11)會誘發(fā)嗜酸性白血球聚集、細胞內鈣離子含量上升及呼吸粹發(fā)(respiratory burst)。此外，CCL-1l會增強嗜酸性白血球粘附于內皮細胞。已知鼻和鼻竇的慢性發(fā)炎疾病(包括鼻息肉、過敏性鼻炎和過敏性及非過敏性兩種鼻竇炎)具有大量嗜酸性白血球發(fā)炎性浸潤的特征，這些疾病都可測得CCL-1l蛋白質表達量hf^Rankin SM, et al., (2000) Mol Med Today., 6:20-27、。在發(fā)炎性腸道疾病患者的病灶處發(fā)現(xiàn)CCL-1l mRNA表達量顯著上升，可說明疾病(如潰瘍性結腸炎和克隆氏癥)嗜酸性白血球聚集機制SM, et al., (2000, Mol Med Today.6:20-27)。在何杰金氏病，組織嗜酸性白血球增多程度已證實與CCL-1l蛋白質表達量直接關聯(lián)SM’et al., (2000) Mol Med Today., 6:20_27\因此，迄今為止的臨床證據(jù)，都證明在各種嗜酸性白血球增多疾病中，CCL-1l是潛在且重要的因子。CCL-1l除了具嗜酸性白血球趨化作用外，亦能刺激骨髓釋放嗜酸性白血球及其前驅細胞，造成血中嗜酸性白血球快速增多。在發(fā)炎和胚胎發(fā)育過程中CCL-1I能促使骨髓造血前驅細胞朝骨髓系細胞分化(Mnkin SM,et al., (2000) Mol Med Today., 6:20-27、。除了嗜酸性白血球增多之外，CCL-11 可使轉移性癌細胞在癌癥環(huán)境增殖和生長。在乳癌轉移小鼠模型中將癌細胞接種于小鼠股骨，血管內皮生長因子(VEGF)和CCL-1l表達量顯著高于對照組小鼠iSosnoski DM.et al.，(2012) Int J Breast Cancer 2012:160265).因此，CCL-1l是治療嗜酸性白血球增多癥和癌細胞轉移疾病的首要標的。
[0004]氣喘、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病(COPD)和肺纖維化統(tǒng)稱為肺部疾病，這些疾病的特征為呼吸道阻塞。呼吸道阻塞定義為在用力呼氣期間氣流阻力增加，在氣喘癥特別明顯(汾印知/? TH (2012) Nat.Med, 18: 673-683)。氣喘是呼吸道對特異性或非特異性刺激產生過度免疫反應引起呼吸道阻塞性失調的疾病。氣喘引起慢性呼吸道發(fā)炎現(xiàn)象需要許多細胞參與，例如上皮細胞、巨噬細胞、嗜中性白血球、嗜酸性白血球、肥大細胞、T細胞及B細胞(泣J.s.et al.，(2012) J.AllergyClin.匆.其中嗜酸性白血球、肥大細胞和輔助2型(Th2)T細胞為氣喘發(fā)炎過程中最重要細胞。氣喘的病理學特征系由對吸入的過敏原產生過度免疫反應，此特征為呼吸道過度反應(AHR)的可逆性阻塞、呼吸道發(fā)炎及Th2相關或Thl相關細胞介素的失衡(5?<9V.H., et al., (1995) Am J Respir Crit Care Med, 151: 1526-31)0 Thl細胞分泌的細胞介素包括腫瘤壞死因子-β (TNF-β )和干擾素-Y (INF-γ)，這些細胞介素負責殺死細胞內寄生蟲和維持自體免疫反應；Th2細胞分泌的細胞介素包括介白素-4(IL-4)、IL-5及IL-13，這些細胞介素在過敏性氣喘疾病發(fā)揮重要作用，并已成為免疫治療性單株抗體的標的(及irwr, A., (2000) BMJ, 321: 424、。因此，在過敏性氣喘發(fā)炎過程中許多細胞介素都扮演關鍵角色(免A.G., et al., (2012) J Mol Cell B1l, 4:3-10)0
[0005]目前氣喘治療方式(如吸入型皮質類固醇、β2-促效劑(β 2-agonist)、M膽堿受體拮抗劑或抗白三烯藥物)皆針對癥狀緩解、反應分子與發(fā)炎介素減少或中和。這些療法對于急性病癥與癥狀緩解雖有療效，但長期的治療效果有限。而傳統(tǒng)過敏原免疫療法具有長期和顯著的療效，但需長年多次注射，且有注射失效及偶發(fā)性免疫球蛋白E (IgE)相關藥物不良反應的風險(Cbz, L.(2006) Ann Allergy Asthma Immunol 97，因此，更有效且持久治療氣喘的方法應著重改變體內免疫反應和將過度免疫反應轉換為保護性免疫反應，從而緩和疾病的病程的發(fā)展策略。
[0006]嗜酸性白血球顆粒內蛋白質參與呼吸道重塑與AHR相關重度氣喘，這些蛋白質包括嗜酸性白血球過氧化酶(EPO)、主要堿性蛋白(MBP)、嗜酸性白血球神經(jīng)毒素(EDN)及嗜酸性白血球陽離子蛋白(ECP )。ECP有助于清除入侵微生物，如寄生蟲和病毒(GiembyczMA, et al, (1999) Pharmacol Rev 51:213-340)0此外，氣喘呼吸道過敏性發(fā)炎常見特征是ECP與嗜酸性白血球分泌其它蛋白質造成呼吸道損傷GE (2000) J AllergyClin Immunol，105: 651-663)0這些蛋白質中ECP和EDN屬于人類核醣核酸酶A家族且具有核醣核酸酶活性，會傷害上皮細胞和神經(jīng)元而造成呼吸道重塑及迷走神經(jīng)功能障礙(.Rosenberg HF, et al, (1989) J Exp Med 170: 163-176)。ECP 在抑制哺乳動物細胞株增殖扮演重要角色(泛如貧尤C., et al, (2010) BMC Cell B1l.77..6)。關于ECP細胞毒性的機制尚未清楚，因為其核醣核酸酶活性遠低于EDNOtoi石E., et al, (1999) J.B1l.Chem.274: 15605 - 15614\已有假說認為ECP的細胞毒性系因其影響細胞膜脂質失去穩(wěn)定性，且細胞毒性程度和ECP濃度具直接相關性。細胞實驗顯示ECP會結合至細胞表面的碳水化合物(泛a/設尤C.，et al, (2010) BMC Cell B1l.77..沒)對醣胺聚醣(GAG)結構(特別是肝素)具高度親和力。ECP對細胞表面缺乏硫酸肝素(HS)的細胞株的細胞毒性顯著下降 0?/? T.C，et al, (2007) Traffic 8: 1778-1795、。
[0007]ECP 序列已確認含有肝素結合序列(heparin-binding motif) (.Fan, T.C., etal.(2008) J B1l Chem 283: 25468-25474, US7595374),可利用此特性減少 ECP對支氣管上皮細胞的細胞毒性，用以治療氣喘(US8399416)。本專利細胞介素調節(jié)勝肽(CMP)為包含ECP主要肝素結合序列的胺基酸勝肽，具能將分子送入細胞的特性，且對支氣管上皮細胞無細胞毒性 0?/?) 5: 1.，et al.(2013) PLoS One, 8: e57318、US 8372950XW?良多種特性，如能與肝素/硫酸肝素、脂質及細胞結合的活性(Zim, P.C.，et al.(2013)B1med Res Int, 2013: 77似游)。在細胞實驗中CMP可運送小分子熒光化合物、重組蛋白和擬肽藥物進入上皮細胞內，在動物實驗CMP可運送重組蛋白進入BALB/c小鼠的肺部及腸道上皮組織內 0?/?) S.1., et al.(2013) PLoS One, 8: e57318、US 8372951)。對細胞介素的調節(jié)，CMP的肝素結合和細胞穿透特性有助于減輕發(fā)炎相關疾病。因此，本發(fā)明對BALB/c小鼠塵螨引起的呼吸道過敏性發(fā)炎具有免疫調節(jié)的功效。


【發(fā)明內容】

[0008]以下詳細說明及附圖作為本實例的一種說明，而非表示建構或利用本實例的唯一形式。該說明闡述該些實例的功能與建構及操作該些實例的步驟的順序。然而，相同或相等的功能及序列可藉不同的實例達成。
[0009]本發(fā)明所用的術語“一”、“一個”及“該”意指“一個或多個”，且該術語亦包括復數(shù)，
除非內文另有明確指明。
[0010]本發(fā)明提供一種在個體中透過調節(jié)該個體的CCL-1l基因表達以治療或預防發(fā)炎相關疾病的方法，其包含施予該個體一醫(yī)藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQID NO:1的免疫調節(jié)勝肽(NYRWRCKNQN)。本發(fā)明的個體為患有癌癥、自體免疫疾病、氣道發(fā)炎、發(fā)炎異常、皮膚異?；蛴刹≡w引起的疾病的哺乳動物。病原體的實例包括但不限于細菌、病毒、霉菌、皮屑、真菌、塵螨、倉儲螨、螫刺昆蟲、蚊子/糠蚊、蟑螂或動物。自體免疫疾病的實例包括但并不限于多發(fā)性硬化癥、氣喘、關節(jié)炎、重癥肌無力癥、關節(jié)炎、紅斑性狼瘡、天皰瘡、牛皮癬、結腸炎、移植器官排斥、異種移植的排斥反應或免疫缺乏疾病。癌癥的實例包括但不限于結腸癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、轉移性胰腺癌、卵巢癌或乳癌。其中呼吸道發(fā)炎的實例包括但不限于氣喘、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管性氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病或肺纖維化。該施予的途徑選自舌下、經(jīng)皮吸收、局部、粘膜、吸入、鼻內、噴霧劑、眼內、氣管內、皮膚貼劑或眼滴劑。
[0011]在較佳實施例中，該組合物可降低該個體中發(fā)炎、呼吸道阻塞、支氣管痙攣、呼吸道過度反應、病理組織學發(fā)炎分數(shù)、杯狀細胞增生或免疫球蛋白E量、趨化介素表達量、細胞介素表達量或TLR4途徑。
[0012]在另一較佳實施例中，該組合物可降低該個體中的呼吸道阻力。
[0013]在另一較佳實施例中，該組合物可降低該個體中白血球(巨噬細胞、嗜堿性白血球、嗜中性白血球、嗜酸性白血球或淋巴細胞)聚集或趨化介素(CCL-26或CXCL-12)表達量或細胞介素(IL-1 β、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-13 或 IL-18)表達量。
[0014]在另一較佳實施例中，該個體為患有氣管發(fā)炎或之前患有肺疾病的癥狀的人類。
[0015]在另一較佳實施例中，該組合物可降低該個體中氣喘發(fā)作的嚴重程度、呼吸道阻塞、支氣管痙攣、呼吸道過度反應、病理組織學發(fā)炎分數(shù)、杯狀細胞增生或免疫球蛋白E的量。
[0016]在另一較佳實施例中，本發(fā)明的方法進一步包含將該組合物與一試劑一并施予，該試劑選自類固醇、抗IgE抗體、抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、白三烯抑制劑、脂氧合酶抑制齊IJ、IL-13拮抗劑、細胞介素釋放抑制劑、抗組織胺及組織胺釋放抑制劑所組成的群組。
[0017]本發(fā)明還提供一種在個體中抑制癌轉移或腫瘤生長的方法，其包含施予該個體一醫(yī)藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQ ID NO:1的免疫調節(jié)勝肽。在較佳實施例中，該癌轉移為肺癌轉移。在另一較佳實施例中，該個體為哺乳動物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018]圖1表示CMP對細胞介素的轉錄的調控作用。將Beas_2B細胞于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后將5 μ M ECP,5 μ M CMP或5 μ M ECP與5 μ M CMP在37。C分別共培養(yǎng)(A) 6小時和(B) 12小時。CCL-1U CCL-24和CCL-26的mRNA表達量由定量PCR進行量測。以未經(jīng)任何處理的Beas_2B細胞作為對照組。實驗數(shù)據(jù)系以相對倍數(shù)表示，將未經(jīng)任何處理的細胞mRNA表達量組設為I倍。該數(shù)據(jù)代表至少三次獨立的實驗，標準偏差(SD)以誤差條表不。
[0019]圖2表示CMP抑制ECP刺激Beas_2B細胞表達CCL-11。將Beas_2B細胞于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后用ECP刺激(柱狀圖第2長條)。在37 ° C反應時以PBS為負對照組(第I長條)和ECP不加CMP (第2長條)或加入CMP I μ M (第3長條)、2.5 μ M(第4長條)、5 μΜ (第5長條)、10 μ M (第6長條)刺激細胞24小時。CCL-1l蛋白質量則使用CCL-1l抗體的ELISA試劑組測定。該數(shù)據(jù)代表至少三次獨立實驗的平均值土SD (標準偏差)。*** 表示 P〈0.001;** 表示 P <0.0l0
[0020]圖3表示CMP抑制IL-4刺激Beas_2B細胞表達CCL-11。將Beas_2B細胞于無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時后，用PBS(柱狀圖第I長條)或10 ng / mL IL-4進行刺激(第2_7長條)。在37 ° C不同條件10 ng / mL的IL-4不加CMP (第I長條)或加入CMP I μ M(第3長條)、2.5 μΜ (第4長條)、5 μ M (第5長條)及10 μ M (第6長條)刺激24小時。CCL-1l蛋白質量則使用CCL-1l抗體的ELISA試劑組測定。該數(shù)據(jù)代表至少三次獨立實驗的平均值土SD (標準偏差)。表示P〈0.001 (以IL-4刺激與PBS處理的Beas_2B細胞比較)。*表示P〈0.05 (以指定濃度的CMP刺激與PBS處理的Beas-2B細胞比較)。
[0021]圖4表示本發(fā)明的動物實驗設計簡圖。除對照組外的所有組別都于第I天和第8天用粗萃塵螨過敏原進行免疫接種，接著在第15天在所有塵螨處理組中于氣管內給予粗萃塵螨過敏原，將BALB/c小鼠分為六組:(I)對照組(PBS )、( 2 )只有氣管內給予塵螨(mlT，第15天加入塵螨)、(3)只有鼻腔內給予CMP (elN，第I至22天給予CMP)、(4)預防處理組(elN+mIT,第I至14天給予CMP,第15天給予塵螨)、(5)治療處理組(mIT+eIN,第15天給予塵螨，第15至22天給予CMP及(6)預防和治療處理組(eIN+mIT+eIN，第I至22天給予CMP，第15天給予塵螨)。
[0022]圖5表示CMP抑制塵螨引起的呼吸道過度反應。測量甲基膽堿(MCh)對小鼠暴露在CMP含有及不含塵螨蛋白質之中的呼吸道阻力(Penh)的效果。全部六種處理組分別以6.25、12.5或25 mg/ml的MCh刺激I分鐘后測量呼吸道阻力(Penh)。以測得數(shù)值與各組別的呼吸道阻力基準線(MCh刺激前)的比值表示。每個結果以平均值土SD表示(η = 4)。*** 表示 P〈0.001。
[0023]圖6表示CMP抑制塵螨引起的發(fā)炎反應聚集。在過敏原誘發(fā)(allergenchallenge)后，將取自不同處理組的肺部組織的代表切片進行免疫組織分析。將組織切片以蘇木精-伊紅(haematoxylin and eosin,H&E)染色觀察一般型態(tài)及細胞浸潤，或以過碘酸雪夫氏(per1dic acid_Schiff,PAS)染色觀察杯狀細胞增生和黏蛋白產生。(A)周圍小支氣管、肺泡發(fā)炎和(B) PAS的分數(shù)根據(jù)組織切片決定。每個結果以平均值土SD表示(η =4)。*** 表示 P〈0.001。
[0024]圖7表示CMP抑制塵螨引起支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的免疫細胞聚集。收集所有實驗組別的小鼠的支氣管肺泡灌洗液。細胞族群以迪夫快速(Diff-Quick)染色后于風干的細胞離心的抹片鑒別，進行至少300個細胞的細胞分類計數(shù)鑒別巨噬細胞、嗜酸性白血球、嗜中性白血球或淋巴細胞。數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗之一。每個結果以平均值土SD表示(η = 4)。*** 代表 P〈0.001。
[0025]圖8表示CMP抑制塵螨引起血清IgE表達。在最后鼻內(第23天)處理的24小時后從小鼠尾部(第18天)及下腔靜脈采集血液樣本并分離血清。利用酵素免疫吸附法(ELISA)測定血清Der P特異性IgE的量。每個結果以平均值土SD表示(η = 4)。*表示Ρ〈0.05, ** 表示 Ρ〈0.01。
[0026]圖9表示CMP抑制塵螨引起肺部細胞介質及趨化介質表達。分析不同組別小鼠的肺蛋白質萃取物中指定的細胞介素。數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗之一。利用酵素免疫吸附法(ELISA)測定處理組的小鼠肺蛋白質萃取物中的CCL-11、IL-5、IL-13及IL-17A/F的量。每個結果以平均值土SD表示(η = 4)。**表示Ρ〈0.01, ***表示P〈0.001。
[0027]圖10表示CMP抑制腫瘤轉移活性。將Α549、Η460和小鼠大腸癌細胞在37 ° C加入CMP培養(yǎng)30分鐘后，每2 X 104細胞/孔的密度加至24孔盤中通孔膜(transwellmembrane)的上腔室部分。數(shù)據(jù)代表從一個代表性實驗的三重復樣本的平均值土標準誤差(S.E.)。該實驗至少重復3次且具有相似結果。

【具體實施方式】
[0028]實例I CMP調控細胞介質的轉錄
實驗方式
定量實時PCR分析細胞介素的mRNA表達量
對于細胞介素表達分析，將Beas-2B細胞在三種不同條件:1) 5 μ M ECP,2) 5 μ MCMP及3) 5 μ M ECP與5 μ M CMP共培養(yǎng)，在37 ° C刺激6小時和12個小時。經(jīng)過培養(yǎng)之后，使用 RNA TRIzol 試劑(Invitrogen, Inc)及 MoMLV-反轉錄酶(Promega, Madison,Wis)萃取RNA。利用SYBR綠熒光染料(SYBR Green)為基礎的定量實時PCR定量目標基因，目標基因的相對表達比例以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)表達量進行標準化。藉由使用 StepOneTM 擴增檢測系統(tǒng)(Life Technologies Corporat1n)的定量時 PCR (realtime PCR)測量細胞介素表達的變化。數(shù)據(jù)利用St印OneTM定量程序軟件(版本2.22，LifeTechnologies Corporat1n)分析,并以平均值土SD表示。顯著分析以具有雙尾分布的兩樣本不等變異數(shù)t檢驗進行。顯著性設為P〈0.05。
[0029]ECP是最為人熟知的氣喘標記蛋白質，參與觸發(fā)支氣管上皮細胞的細胞介素表達。進行實時定量PCR分析在ECP或不加CMP的治療后細胞介素表達量。支氣管上皮的Beas-2B細胞在含有5 μ M ECP,5 μ M CMP及5 μ M ECP與5 μ M CMP兩者的無血清培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)6和12小時，利用實時定量PCR監(jiān)測細胞介素和趨化介素的基因變化。未經(jīng)任何處理Beas-2B細胞在相同條件培養(yǎng)6和12小時作為陰性對照組。本實例分析了趨化介素的基因表達量的變化，包括CCL-ll、CCL-24和CCL-26。值得注意的是，在6小時ECP刺激Beas_2B細胞中CCL-1l和CCL-26的基因表達量分別增加了 9倍和2倍(圖1A)，而在12小時，ECP刺激Beas-2B細胞中CCL-1l基因表達量增加了 2.8倍(圖1B)。只有培養(yǎng)CMP的組沒有影響B(tài)eas-2B趨化介質表達量。此外，ECP和CMP兩者共培養(yǎng)6小時會造成Beas_2B細胞中ECP誘導的CCL-1l基因表達顯著降低，表示CMP可能會干擾支氣管上皮細胞中的ECP所刺激的CCL-1l免疫反應，并進一步減少氣喘癥狀。
[0030] 實例2 CMP對CCL-1l的免疫調控實驗方式
人類CCL-1l酵素免疫吸附法(ELISA)試劑組
CCL-1l ELISA試劑組(R&D)是定量細胞培養(yǎng)上清液中人類CCL-1l濃度的酵素免疫吸附法。此分析采用對涂覆在96孔盤的人類CCL-1l具專一性抗體?？撞壑?0 μ L標準品或樣品在室溫培養(yǎng)2.5小時。用I X洗滌溶液洗滌5次后，將200 μ L CCL-1l復合物加入每個孔槽中持續(xù)I小時。再次洗滌后，將100 μ L TMB—步基質試劑(One-St印SubstrateReagent)加入每個孔槽中，在室溫反應30分鐘。最后將50 μ L反應終止液中加入每個孔槽中，并立即使用分光光度計在450 nm讀取。本分析的偵測極限為5 pg/mL。
[0031 ] 為了確認CMP是否會影響ECP所刺激的CCL-1I表達，Beas_2B細胞分別5 μ M ECP不加CMP或是加入I μΜ、2.5 μΜ、5 μΜ及10 μΜ CMP刺激，在37 ° C培養(yǎng)24小時。結果顯示5 μ M ECP刺激細胞釋放17.8 pg/mL CCL-1l (圖2)。而在I或2.5 μ M CMP誘導并沒有減少ECP刺激細胞釋放CCL-1I。但在5或是10 μ M CMP誘導，ECP刺激的CCL-1l顯著降低到 7.55 pg/mL 和 8.94 pg/mL (圖 2)。
[0032]為了進一步探討CMP是否影響其它物刺激Beas_2B細胞產生CCL-1I，將去除血清的Beas-2B細胞單獨加入10 ng/mL IL-4 (刺激CCL-1l的主要細胞介素)刺激，或同時加入濃度為1、2.5、5及10 μΜ的CMP，在37 ° C培養(yǎng)24小時。結果顯示10 ng/mL IL-4刺激細胞釋放73.2 pg/mL CCL-1l (圖3)，而I或2.5 μ M CMP沒有減少IL-4刺激的細胞釋放CCL-1l (圖 3)，而 5 或 10 μ M CMP 分別減少細胞釋放 CCL-11 量 48.1 pg/mL 及 30.2 pg/mL(圖3)。這些結果顯示ECP與IL-4會刺激Beas_2B細胞釋放趨化介素CCL-1I，且加入5和10 μ M的CMP可負調控ECP與IL-4所誘導的CCL-11表達。
[0033]實例3降低肺部呼吸道過度反應實驗方式
將小鼠分為6組:1)對照組(η=10)、2)只有氣管內給予塵螨粗萃過敏原(mIT) (n=10)、3)只有鼻腔內給予CMP (eIN) (n=12)、4)預防處理組(elN+mIT ;n=12)、5)治療處理組(mIT+eIN ；n =12)及6)預防和治療處理組(eIN+mIT+eIN ;n=18)(圖4)。所有接受mIT的組別于第I天和第8天用粗萃塵螨過敏原進行免疫接種，接著在第15天氣管內給予粗萃塵螨過敏原。eIN和eIN+mIT+eIN組自第I天至第22天接受eIN ；eIN+mIT組從第I天到第15天(給予mIT前)接受eIN ;且mIT+eIN組從第15天(給予mIT后)至第22天接受eIN。所有小鼠皆于第23天犧牲。動物使用方式經(jīng)機構的實驗動物照護及使用委員會審查與核準(IACUC 核準號:La-95279)。
[0034]呼吸道阻力(Penh)的測量
將有意識、自主呼吸的小鼠在第22天(即最后一次誘發(fā)處理的I小時后)使用全身體積描記系統(tǒng)(Buxco，Wilmington, NC, USA)測量呼吸道反應性，如先前文獻所述(Maeda T,et al, Eur J B1chem 2002, 269，307-316)。簡言之，將老鼠個別放置在腔室內，并靜置3-5分鐘。透過連接到計算機數(shù)據(jù)獲取系統(tǒng)的傳感器連續(xù)測量腔室-壓力-時間波形。在呼吸道阻力(Penh)基準線讀取> 3分鐘后，將小鼠藉由吸入方式依序暴露于霧化的甲基膽堿(MCh，于 PBS 中，濃度分別為 0、6.25、12.5 及 25 mg/ml ;Sigma, St Louis, MO, USA)持續(xù)I分鐘。Penh值在MCh霧化之后的前3分鐘內測量呼吸道阻力、潮氣量及呼吸頻率(次/分鐘)的變化，取平均值并用于比較所有六個處理組之間的反應。
[0035]氣喘主要特征是支氣管痙攣，會造成呼吸道阻塞和呼吸道過度反應(AHR)，然后降低氣流(St印hen T.H.(2012) Nat.Med, 18: 673-683)。AHR是氣喘的臨床特征之一，且與疾病嚴重程度成比例(Chang, Y.J.et al.(2011) Nat.1mmunol.12: 631 - 638)。測量在所有實驗小鼠的呼吸道阻力變化評估CMP對塵螨誘發(fā)的氣喘的影響。對照吸入的甲基膽堿劑量增加的反應檢測eIN+mIT、mIT+eIN及eIN+mIT+eIN的處理小鼠的AHR反應(圖5)。12.5和25 mg/ml MCh刺激后，mIT組呼吸道阻力變化較對照組、eIN+mIT+eIN及eIN組更大。相較于25 mg/ml MCh處理的塵螨組，elN+mIT和mIT+eIN的呼吸道阻力變化較低，但
12.5mg/ml MCh處理的則否。這些結果顯示CMP可減少呼吸道阻塞、支氣管痙攣及增加過敏原誘導的AHR中的氣流?？偠灾?，CMP可在氣喘小鼠模型中發(fā)揮其預防和治療的效果。
[0036]實例4肺部組織的病理變化組織病理學分析
將蘇木精-伊紅染色(H & E)的福爾馬林固定的肺切片利用三個隨機選擇將肺泡、周圍小支氣管和發(fā)炎指區(qū)域的三個獨立的分數(shù)的平均值的計算。各個切片由兩個醫(yī)生獨立且盲檢的方式分別判讀，并按照先前呼吸道發(fā)炎的評分系統(tǒng)(Ford JG, et al, (2001) JImmunol 167: 1769-77)。為了評估杯狀細胞增生，呼吸道切片用過碘酸-希夫式(PAS)染色進行檢測。兩位判讀者獨立且隨機的對每個玻片的10個區(qū)域評分，每一個肺利用數(shù)值間的平均的計算，每個呼吸道中PAS陽性的杯狀細胞含量的分數(shù)(Padrid P，et al, (1995)Am J Respir Crit Care Med 151: 184-9)決定如下:0，5% 的杯狀細胞；1，5 - 25% ；2,25 - 50% ；3, 50 - 75% ；4, 75%。
[0037]為了測定AHR的抑制是否可代表更完整的的病理狀況，將六組小鼠之間的肺組織切片進行比較。周圍小支氣管和肺泡發(fā)炎的分數(shù)如圖6A所示，mIT組在肺部的周圍支氣管及肺泡區(qū)域中發(fā)現(xiàn)細胞浸潤層。eIN+mIT+eIN組的周圍小支氣管和肺泡的分數(shù)顯著低于mIT組。杯狀細胞增生的分數(shù)示于圖6B，eIN+mIT+eIN組的分數(shù)低于mIT組。eIN+mIT+eIN組對周圍小支氣管、肺泡發(fā)炎和杯狀細胞增生相較于elN+mIT和mIT+eIN組有更佳的抑制效果。動物實驗的證據(jù)可證實CMP確實有降低過敏原刺激造成的呼吸道發(fā)炎及杯狀細胞增生的效果。
[0038]實例5抑制肺部免疫細胞聚集支氣管肺泡灌洗液及免疫細胞計數(shù)
支氣管插管，接著沖洗兩次，每次1.0毫升磷酸鹽緩沖液通過套管導入肺部并回收收集細胞，每次沖洗的支氣管肺泡灌洗液(BALF)放置于冰上的聚丙烯管。接著將收集的BALF在4 ° C轉速300Xg離心7分鐘。除去上清液后，將細胞再懸浮于1.0毫升的磷酸鹽緩沖液(PH7.4)?？偧毎麛?shù)用血球計數(shù)器計數(shù)，并將1-5 X 13的細胞離心涂于顯微鏡載玻片(細胞離心涂片，Shandon Scientific, Cheshire, UK)。將玻片于空氣干燥24小時，固定并用瑞氏染劑(Wright stain)染色。根據(jù)形態(tài)學標準對每玻片至少300個細胞進行細胞分類計數(shù)，計算細胞數(shù)并以絕對細胞數(shù)表示。
[0039]為了了解過敏原誘發(fā)環(huán)境免疫細胞聚集于呼吸道的程度，測量支氣管肺泡灌洗液免疫細胞數(shù)量。如圖7所示，eIN+mIT+eIN組的巨噬細胞、嗜酸性白血球和淋巴細胞計數(shù)較mIT組低。elN+mIT組的嗜酸性白血球計數(shù)低于mIT組。CMP處理后，肺部的免疫細胞聚集明顯減少，表示CMP會抑制氣喘小鼠的呼吸道發(fā)炎現(xiàn)象。
[0040]實例6抑制塵螨特異性血清IgE量測量血清Der P特異性IgE量
自小鼠尾巴(第18天)及處理完成后自下腔靜脈(第23天)采集血液樣本并將血清分離。將塵螨蛋白(5微克)在4°C涂覆于培養(yǎng)盤隔夜。然后，將第18天和第23天的血清加入經(jīng)涂覆的培養(yǎng)盤，標準抗IgE抗體購自B.D.(San Diego, CA, USA)。透過酵素免疫吸附法(ELISA)測量血清塵螨特異性IgE量。
[0041]為了進一步分析CMP對塵螨所引起氣喘的治療效果，所有六個處理組皆測量小鼠的血清塵螨特異性IgE的量。血清取自尾巴(第18天)及下腔靜脈(IVC)(第23天)(圖8)。第18天時，mIT組有較eIN+mIT、mIT+eIN和eIN+mIT+eIN組高的IgE量。第23天時，eIN+mIT+eIN組的IgE量較mIT組低很多。CMP降低了關鍵分子-特異性IgE，說明對氣喘小鼠呼吸道發(fā)炎的抑制機制。
[0042]實例7抑制肺部萃取物輔助2型T細胞介白素制備肺組織上清液
將左肺于1.0毫升的冷磷酸鹽緩沖液均質化，并在使用前保存在冰浴。將肺部物質在4°C轉速20000Xg離心5分鐘。接著將肺部均質物上清液用PBS稀釋至最終蛋白質濃度為500 μ g/ml 并保存于-80°c。
[0043]使用ELISA進行細胞介素分析
利用ELISA測量肺蛋白質萃取物的細胞介素的量。使用BD OptEIATM組小鼠IL-5、IL-10、IL-13、IFN-Y 及轉化生長因子-β (TGF-β )試劑組(BD B1science, San Jose,CA, USA)和DuoSet小鼠嗜酸性白血球趨化蛋白(eotaxin)、IL-17A/F、血管內皮生長因子(VEGF)和基質金屬蛋白酶-9 (MMP-9)試劑組(R&D，Minneapolis, MN，USA)。將微孔盤送入 ELISA 測讀儀(Thermo Labsystems, Waltham, MA, USA)在 450 nm 進行讀值。
[0044]塵螨透過誘導由Thl向Th2細胞的免疫偏差(immune deviat1n),可誘發(fā)BALB/c 小鼠產生過敏性氣喘(Stevens, W.H., et al., (1995) Am J Respir Crit Care Med,151: 1526-31)。最近的研究指出，在BALB/c模式，由Th2細胞介素(IL-13)和Thl7細胞介素(IL-17A/F)兩者調控氣喘的呼吸道發(fā)炎(Mukherjee S，et al.(2011) Am JPathol 179: 248-58)。Thl7細胞調控Th2細胞在氣喘發(fā)展過程非常重要。在中度至重度氣喘患者的支氣管粘膜下層IL-17A/F的表達增加(Doe C，et al.(2011) Chest 138:1140-1147)。為了檢驗CMP是否能夠回復Thl/Th2/Thl7偏差，測量了 BALF的不同細胞介素表達量。eIN+mIT、mIT+eIN和eIN+mIT+eIN這三個組別的CCL-11濃度較mIT組低；IL_5表達量在mIT+eIN與eIN+mIT+eIN組也比較低，與elN+mIT組相同；eIN+mIT、mIT+eIN和eIN+mIT+eIN組的IL-13濃度皆較mIT組低(圖9)。這三組老鼠肺部IL-17A/F量也是遠低于mIT組(圖9)。CMP處理的小鼠肺部CCL-ll、IL-5和IL-13表達量降低，表示CMP可減輕細胞介素調控的呼吸道發(fā)炎并影響嗜酸性白血球活化。另一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，CMP能降低肺部IL-17A/F表達。因此，CMP和IL-17之間的調控關聯(lián)，顯示CMP是一種新式治療方式。這些證據(jù)顯示CMP可作為目前肺疾病患者的抗發(fā)炎藥物的替代治療方法。
[0045]實例8 CMP對腫瘤細胞轉移的抑制轉移分析
CMP對癌細胞轉移抑制分析是在24孔成對培養(yǎng)盤(compan1n plate) (BectonDickinson)由細胞培養(yǎng)嵌入物(直徑6.4毫米，孔隙8微米的聚乙烯對苯二甲酸酯膜[Becton Dickinson])組成的24孔穿孔腔室進行。先將3 X 14的癌細胞懸浮與5或是
12.5μΜ的CMP共培養(yǎng)30分鐘，總體積為200 μ L。再將細胞懸浮液接種到嵌入物的上腔室、將含5%胎牛血清(FBS)的培養(yǎng)基作為趨化因子加入底部腔室的培養(yǎng)盤孔、并置入37° C含有5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)18小時。用棉簽除去上部膜表面未轉移的細胞，而貼附至下部膜表面的轉移細胞用4%多聚甲醛固定，并用0.2%結晶紫染色。轉移的細胞的數(shù)目在4個隨機選擇的高倍率區(qū)域于顯微鏡計數(shù)。顯示的數(shù)據(jù)代表三個個別的孔槽的統(tǒng)計結果。
[0046]HS和硫酸軟骨素(CS)的醣胺聚多醣(GAGs)已被報導可吸引參與細胞生長、發(fā)育和基質重塑的生長因子，推測CMP能于胞外捕捉生長調控因子從而抑制癌癥轉移。CMP與人類肺癌Α549，Η460細胞株或小鼠結腸癌細胞共培養(yǎng)，實驗具抑制癌癥轉移活性。實驗開始前30分鐘，先將5或12.5 μΜ CMP加入細胞培養(yǎng)液，放置18小時后，檢測細胞轉移量。實驗結果發(fā)現(xiàn)濃度5 μ M的CMP可降低Α549和小鼠結腸癌細胞60%的移動活性，而濃度12.5 μ M可降低Η460的50%移動活性(圖10)。
[0047]由上述實施例的說明可了解其僅為例示方式，熟習此技藝者可能采用各種修改。上述說明書、實例及數(shù)據(jù)提供本發(fā)明的例示性實施例的結構及用途的完整敘述。雖然本發(fā)明的各種實施例已敘述具有一定特殊性或參照一或多個個別實施例，但熟習此技藝者可能在不脫離本創(chuàng)作的精神和范圍內對揭示的實施例作些許的變更。
[0048]本文所提及的任何出版物、專利和專利申請案都是全文引用的方式加入本文，并應視為是明確的和獨立的方式全文引用每一個別的出版物、專利或專利申請案。
【權利要求】
1.一種在個體中通過調控該個體CCL-1l基因表達以治療或預防發(fā)炎相關疾病的方法，其包含施予該個體一醫(yī)藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQ ID NO:1的免疫調節(jié)勝肽。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該施予可經(jīng)由選自舌下、經(jīng)皮吸收、局部、粘膜、吸入、鼻內、噴霧劑、眼內、氣管內、皮膚貼劑或眼滴劑的途徑完成。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該發(fā)炎相關疾病為癌癥、自體免疫疾病、發(fā)炎異常、呼吸道發(fā)炎、皮膚異?；蛴刹≡w引起的疾病。
4.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中該自體免疫疾病為多發(fā)性硬化癥、氣喘、關節(jié)炎、重癥肌無力癥、關節(jié)炎、紅斑性狼瘡、天皰瘡、牛皮癬、結腸炎，移植器官排斥、異種移植排斥反應或免疫缺陷性疾病。
5.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中該癌癥為結腸癌、直腸癌、胃癌、胰腺癌、肺癌、轉移性胰腺癌、卵巢癌或乳腺癌。
6.根據(jù)權利要求3所述的方法，其中該呼吸道發(fā)炎為氣喘、支氣管炎、過敏性支氣管炎、支氣管性氣喘、肺氣腫、慢性阻塞性肺病或肺部纖維化。
7.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該CCL-1l基因表達和嗜酸性白血球增多癥有關。
8.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該組合物能夠減少該個體中發(fā)炎、白血球聚集、趨化介素表達量或細胞介素表達量。
9.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中該白血球為巨噬細胞、嗜堿性白血球、嗜中性白血球、嗜酸性白血球或淋巴細胞。
10.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中該趨化介素為CCL-26或CXCL-12。
11.根據(jù)權利要求8所述的方法，其中該細胞介素為IL-1β、IL-4、IL-5、IL_6、IL-8、IL-13 或 IL-18。
12.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該組合物能夠降低該個體中氣喘發(fā)作的嚴重程度、呼吸道阻塞、支氣管痙攣、呼吸道過度反應、病理組織學發(fā)炎分數(shù)、杯狀細胞增生或免疫球蛋白E量。
13.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該組合物降低該個體中的呼吸道阻力。
14.根據(jù)權利要求1所述的方法，其進一步包括施予一試劑選自類固醇、抗IgE抗體、抗IL-4抗體、抗IL-5抗體、白三烯抑制劑、脂氧合酶抑制劑、IL-13拮抗劑、細胞介素釋放抑制齊IJ、抗組織胺及組織胺釋放抑制劑所組成的群組。
15.根據(jù)權利要求1所述的方法，其中該個體為哺乳動物。
16.—種在個體中抑制癌轉移或腫瘤生長的方法,其包含施予該個體一醫(yī)藥有效劑量的組合物，該組合物包含一序列為SEQ ID NO:1的免疫調節(jié)勝肽。
17.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中該癌轉移為肺癌轉移。
18.根據(jù)權利要求16所述的方法，其中該個體為哺乳動物。
【文檔編號】A61P37/02GK104302657SQ201380021014
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2013年9月10日 優(yōu)先權日:2012年9月10日
【發(fā)明者】張大慈, 傅令嫻, 方韶瓏 申請人:張大慈