專利名稱：抗蝰蛇毒血清及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗蛇毒血清及其制備方法，尤其涉及抗蝰蛇毒血清及其制備方法。
背景技術(shù)：
抗蛇毒血清的研究已有100多年的歷史。首先應(yīng)用于臨床的是在印度制備的抗眼鏡蛇毒血清。以后，世界上就有許多科學(xué)工作者從事這一研究工作，均因免疫效價低，純化技術(shù)等問題而未能被廣泛應(yīng)用于臨床。高效價、高純度并廣泛用于臨床的抗蛇毒血清也才數(shù)十年的歷史。目前，世界上有20多個國家30多個機構(gòu)利用60多種毒蛇的蛇毒生產(chǎn)抗蛇毒血清，現(xiàn)有近百種單價和多價抗蛇毒血清。
我國早在1923年，首先在臺灣研制抗蛇毒血清。1969年，上海生物制品研究所開展抗蛇毒血清的研制工作。首先對分布廣、危害大、占蛇傷大多數(shù)的蝮蛇進行研究，對抗原(蛇毒)進行減毒處理，然后對馬匹進行免疫，獲得滿意的效價。在1970年，由浙江醫(yī)科大學(xué)和浙江省中醫(yī)研究所承擔了臨床驗證，結(jié)果證明精制抗蝮蛇毒血清反應(yīng)小、療效顯著，深受病者和醫(yī)務(wù)工作者的歡迎。以后又相繼研制成抗五步蛇、抗銀環(huán)蛇、抗眼鏡蛇血清?？股叨狙宓难兄瞥晒?，為我國填補了空白，克服了中草藥治療蛇傷的嚴重缺點，極大地保護了蛇傷病人的生命，取得了巨大的社會效益。
蝰蛇屬蝰科，主要分布于我國華南地區(qū)、國外馬來半島及印支諸國，它是我國主要毒蛇之一。對野外、山林及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)工作者危害極大。近幾年來，食蛇人數(shù)不斷擴大，食蛇飼養(yǎng)咬傷者亦日益增多，特別是我國廣東、福建一帶蝰蛇咬傷病人的大大增加。
國外已有抗蝰蛇毒血清產(chǎn)品上市，主要針對分布于歐洲的蝰蛇種類制備，已生產(chǎn)使用的蝰蛇毒血清有河蝰、毒蝰、極北蝰、草原蝰抗血清等。英國藥典1993年版第二卷記載的河蝰、毒蝰、極北蝰、草原蝰抗血清的效價為抗Vipera ammodytes Venom(河蝰)血清每毫升中和效價不低于100LD50；抗Vipera aspis Venom(毒蝰)血清每毫升中和效價不低于100LD50；抗Vipera berus Venom(極北蝰)血清每毫升中和效價不低于50LD50；
抗Vipera ursinsi Venom(草原蝰)血清每毫升中和效價不低于50LD50；國外現(xiàn)有的產(chǎn)品主要是基于歐洲分布的蝰蛇種類制備的，由于不同種類的蝰蛇蛇毒抗原特異性具有種屬差異，國外現(xiàn)有的抗血清用于治療我國蝰蛇咬傷患者，針對性差；另外蝰蛇排毒量多，毒性強，咬傷后發(fā)病迅速，死亡率高，國外現(xiàn)有的抗血清效價偏低。因此，本領(lǐng)域迫切需要高效價、針對國內(nèi)分布的蝰蛇蛇毒的抗血清。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效價抗蝰蛇毒血清，以克服現(xiàn)有抗血清效價低、針對性不強的問題。
本發(fā)明的另一目的是提供上述抗蝰蛇毒血清的制備方法。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種以園斑蝰蛇(Vipera russelli SiamensisSmith)蛇毒為抗原，免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的抗蝰蛇毒血清，蛋白含量≤170g/l、pH 6.0-7.0、氯化鈉含量7.5-9.5g/l、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)2≥60％、中和效價≥500LD50/ml、類A型物質(zhì)≤4μg。
本發(fā)明的第二方面，提供了抗蝰蛇毒血清的制備方法，包括如下步驟1.制備免疫血漿園斑蝰蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理10~20分鐘左右，取上清凍干，用福爾馬林處理減毒，作為免疫用抗原；選擇健康馬匹，用常規(guī)方法進行基礎(chǔ)免疫、超免疫待血漿效價超過100U/ml后采血，分離血漿；2.精制提純消化將制得的免疫血漿2-4倍稀釋，調(diào)溫至29-31℃，調(diào)節(jié)pH至3.0-3.3之間，加入溶化胃酶，消化1-1.5小時；第一次沉淀及加熱處理上述消化液加18~22％(g/ml)硫酸銨，調(diào)pH至4.8-5.2，加溫至56~60℃并保溫20~40分鐘，降溫過濾分離，取清液，棄沉淀；鹽析上述清液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4之間，每100ml加硫酸銨15~25g，取沉淀，棄清液；明礬沉淀上述沉淀稀釋至蛋白含量約1~3％(g/ml)，使沉淀完全溶解，在溫度不高于10~30℃下加入明礬溶液使最終含量為0.8-1.2％(g/ml)，調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，吸附05~1.5小時，過濾分離，取清液，棄沉淀；濃縮將上述清液用原體積1~4倍的注射用水多次稀釋，用3~5萬分子量的濾膜超濾濃縮至原體積的5~20％使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下；原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入氯仿使最終含量為0.4~0.6％(ml/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0，得抗蝰蛇毒血清原液。
本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在本發(fā)明以國內(nèi)園斑蝰蛇(Vipera russelli Siamensis Smith)蛇毒為抗原，其抗原性較好；獲得的抗蝰蛇毒血清免疫效價高，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD50以上，相當于4mg干毒，高于英國藥典之規(guī)定；在臨床試驗中有效率為98.5％，治愈率達91％，沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，說明本發(fā)明的抗蝰蛇毒血清療效好，安全性高。
具體實施例方式
基礎(chǔ)免疫、超免疫馬匹免疫從馬體初次接受免疫原刺激，到產(chǎn)生少量抗毒素即第一次免疫應(yīng)答的出現(xiàn)，需要一定的時間。這一階段在制造抗血清的工作中被稱作“基礎(chǔ)免疫”。基礎(chǔ)免疫對于以后的強化免疫即所謂“超免疫”影響很大。有了第一次免疫應(yīng)答后，再次接觸同一免疫原就會迅速出現(xiàn)第二次免疫應(yīng)答，抗毒素效價將會急劇上升。由第一次應(yīng)答到第二次應(yīng)答之間的有效間隔期，將視馬體狀態(tài)與免疫原的種類、性狀及劑量等而異，一般需要1-2個月以上，也可至半年以上。即使超過一年，對首次刺激的記憶也不會完全消失，對再次刺激仍會出現(xiàn)水平相當高的第二次應(yīng)答。對超免疫成功的馬匹予以采血并開始再次免疫注射，如此反復(fù)的每一循環(huán)通稱“1程”、“2程”……超免疫。
基礎(chǔ)免疫水平、免疫原的強度、注射次數(shù)及注射間隔時間、前后程間的間隔時間等都是對超免疫的成敗、免疫應(yīng)答水平的持久性以及馬體健康狀態(tài)有影響的因素，須根據(jù)實踐經(jīng)驗與具體條件適當調(diào)節(jié)，制訂最佳免疫實施方案。
抗蛇毒血清的制備首要條件是蛇毒(抗原)、動物(免疫對象)和純化設(shè)備(抗體提純)。選擇健康蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理15分鐘左右，以除去雜質(zhì)，上清經(jīng)凍干成粉狀備用。干燥蛇毒需測定其毒力，應(yīng)選擇毒性強、抗原譜廣(免疫電泳檢驗)的蛇毒作為抗原。
在作免疫抗原時，必須除菌處理，因為蛇毒中常混有使動物致病的厭氧菌。由于蛇毒的毒性強，抗原性較差，加大劑量以增強免疫刺激性，在免疫過程中會造成動物死亡，所以對免疫用的蛇毒需減毒處理。減毒處理方法較多，較好的也常用的方法是福爾馬林減毒法。
為加強對動物的免疫刺激性，通常在抗原中加進非特異性刺激劑，稱佐劑?？刹捎貌煌耆魟?，其配比為羊毛脂1份、石蠟油2份，置玻璃瓶中搖勻(加溫)，經(jīng)高壓滅菌，然后將滅菌佐劑與等體積抗原混合便成免疫用抗原。
作為免疫用馬，必須經(jīng)檢疫合格之健康。免疫劑量根據(jù)抗原性質(zhì)(毒性及抗原性)而定，通常以小劑量開始漸次遞增。
在免疫馬匹時注意到如下幾點(1)免疫原注射時采取皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、靜脈、腹腔等途徑。注射部位為頸部兩側(cè)、脊背兩側(cè)、臀部兩側(cè)。采用“多點分散、每點少量”的注射方法。
(2)按一般規(guī)律，每注射一次免疫原后，抗血清效價會發(fā)生波動，波峰逐次升高。達到最高水平后則可能趨于逐次漸降。掌握波動規(guī)律，抓住最好時機進行注射與采血，對于抗血清生產(chǎn)很有利。
(3)有的馬匹在長期免疫、采血的過程中，抗血清效價達到一定水平后不僅不再上升，反而逐漸跌落，對免疫原的再刺激毫無應(yīng)答。此現(xiàn)象被稱為“免疫麻痹”，可能與免疫原的性質(zhì)及注射劑量、注射的頻率及間隔時間等有關(guān)；也可能是免疫原中混雜的免疫抑制性物質(zhì)引起的。對此，應(yīng)給該馬以足夠時間的休息，以解除抑制作用，然后調(diào)整免疫方案，重新開始超免疫。
中和抗體用蛇毒減毒抗原免疫馬匹制備的馬抗蛇毒血清，主要成分為中和抗體，分子結(jié)構(gòu)與人的IgG基本相同。經(jīng)胃酶處理，IgG分子在重鏈間的二硫鍵的Fc端被切斷。切下的Fc片段無抗毒活性，不耐熱，經(jīng)繼續(xù)消化與熱變性而去除。保留下來的F(ab)2片段具有抗毒活性，其作用機理為中和抗體與蛇毒蛋白分子結(jié)合，封閉蛇毒蛋白與細胞膜上受體的結(jié)合位點，阻止蛇毒與人體細胞結(jié)合，起到抗毒作用。
抗體效價測定抗血清的效價測定按國際通用的中和試驗法進行動物試驗，其方法是把抗原和特異性抗體作用一定時間后，再給動物注射，借助動物體的反應(yīng)情況來判定抗血清的效價。本發(fā)明所用的動物試驗方法是以動物死亡為反應(yīng)指征，以小白鼠注射抗蛇毒血清與蛇毒混合液后，動物的生存死亡情況，確定血清的效價。
免疫血漿效價的測定采用固定血清劑量、改變蛇毒劑量的方法，即取1毫升血清加入1毫升含不同濃度蛇毒溶液(蛇毒以LD50、MLD或mg為單位)，混合后置37℃1小時，注射小白鼠體內(nèi)(iv或im)作中和反應(yīng)測定之，以含蛇毒最高劑量動物不死亡為中和終點，計算1毫升血清中和蛇毒數(shù)量。
成品檢定效價常用ED50，參照《免疫檢測技術(shù)》(第二版，徐宜為編著)文獻規(guī)定的方法測定。
一、制備免疫血漿按《中國生物制品規(guī)程》中《生物制品生產(chǎn)用馬匹檢疫及管理規(guī)程》的規(guī)定，選用健壯、無傳染病(包括馬傳染性貧血、馬鼻疽、布氏桿菌病、馬副傷寒性流產(chǎn)及其他傳染病)和無惡性腫瘤等疾病的馬匹制造馬抗蝰蛇毒血清，最好是4-12歲的馬匹，過幼者免疫器官發(fā)育不健全，過老者免疫機能忌退。
抗原及其制備抗原為園斑蝰蛇(Vipera russelli Siamensis Smith)蛇毒，選擇健康蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理15分鐘左右，按《除菌過濾崗位標準操作細則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進行除菌處理以除去雜質(zhì)，上清經(jīng)凍干成粉狀備用。使用前將蛇毒干粉用注射用水稀釋5~10倍，加入0.3～1.0％福爾馬林，處理3～10天減毒；得到的減毒蛇毒作為免疫抗原。
基礎(chǔ)免疫采用二針次免疫。
佐劑比例抗原∶羊毛脂∶液體石蠟3∶1∶2注射劑量及時間第1天1ml，第8天2ml超免疫采用五針次免疫抗原蝰蛇毒素。
注射劑量及時間第一程 第1針第1天 2-10ml第2針第8天 2-20ml第3針第15天 2-20ml第4針第22天 4-25ml第5針第29天 10-25ml7天后測定血液中抗體水平采血免疫成功馬匹可采血，按馬匹體重進行采血，通常采二次血，間隔一天。采血后休息一星期，然后繼續(xù)免疫，采血、再免疫。達到預(yù)定效價即免疫成功，達不到者繼續(xù)免疫。
采血量每千克體重16-20ml。
休息7天后進行下程免疫。
第二程第二程及以后各程采用二針次或三針次免疫二針次 第1針第1天10ml第2針第8天 20ml三針次 第1針第1天5ml第2針第8天 8ml第3針第15天10ml采血時間在末次注射后第8天起。
休息7天后進行下程免疫。
二、精制提純用于精制的血漿應(yīng)符合《中國生物制品規(guī)程》中附錄《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》的規(guī)定，不得有嚴重溶血或嚴重黃疸，投產(chǎn)前混合血漿的效力檢定應(yīng)合格。
對血漿的要求制造抗蝰蛇毒血清的血漿，應(yīng)符合《中國生物制品規(guī)程》(2000年版)《抗毒素生產(chǎn)用馬匹免疫方法》的規(guī)定。
投產(chǎn)精制用的血漿應(yīng)無染菌、無溶血、無黃疸、應(yīng)不混入血球。
裝盛血漿的立瓶，應(yīng)無裂縫、無破損、包扎嚴緊。
血漿效價抗蝰蛇毒免疫馬血漿每瓶血漿效價要求在100U/ml，低于100U/ml不能使用。
血漿的準備每批血漿投產(chǎn)量，按大罐容積，計算投入血漿量(按照規(guī)程2-4倍稀釋)。
在冷庫內(nèi)查對血漿種類、瓶號、馬號、分漿日期、裝量、效價，選好后，搬運至緩沖間。
收集血漿瓶簽，去除瓶口外包裝，清潔血漿瓶外壁，作好血漿混合記錄。
制造程序消化將注射用水注入大罐內(nèi)，查對大罐所盛注射用水量，測量水溫(要求不高于48℃)。揭開血漿瓶塞，按照2-4倍稀釋量將血漿倒入大罐中，啟動攪拌馬達，慢速攪拌均勻；取血漿稀釋液50ml，留樣送檢定，并測pH值，調(diào)溫至29-31℃，用2mol/L HCl調(diào)節(jié)pH至3.0-3.3之間，加入溶化胃酶，加入0.2％甲苯(ml/ml)，慢速攪拌，消化1-1.5小時。
第一次沉淀及加熱處理取上述消化液20ml，測pH值?？焖贁嚢?，加15％(W/V)硫酸銨。用2mol/L NaOH調(diào)至pH4.8-5.2，并測量消化液溫度，用流通蒸汽通過消化罐夾層加溫至58℃并保溫30分鐘；通過大罐夾層迅速降溫過濾分離，取清液，棄沉淀。
鹽析上述清液，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH7.2-7.4，慢速攪拌，每100ml加硫酸銨20g。過濾分離，取沉淀，棄清液。
明礬沉淀將適量注射用水貯于大罐內(nèi)，備用。測量水溫不得高于30℃，將搗碎的沉淀稱量，置大罐內(nèi)稀釋至蛋白含量約2％(g/ml)，慢速攪拌，使沉淀完全溶解，并測量溫度不得高于30℃，加10％(g/ml)明礬溶液，最終含量為0.8-1.2％(g/ml)。取樣，測pH值，用2mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.8，攪拌，吸附1小時，過濾分離，取清液，棄沉淀。
濃縮將上述清液混合通過超過濾裝置，用5萬分子量的濾膜，進行濃縮，至體積為十分之一時稀釋7倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下。
原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.9％(g/ml)；加入氯仿使最終含量為0.5％(ml/ml)；調(diào)pH至6.5。
澄清除菌過濾按《除菌過濾崗位標準操作細則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進行操作。制成的抗毒素原液，須在冷暗處保存至少1個月作為穩(wěn)定期。
原液檢定無菌試驗按《生物制品無菌試驗規(guī)程》A項進行。
熱原質(zhì)試驗按《生物制品熱原質(zhì)試驗規(guī)程》進行。
類A型物質(zhì)含量測定按《抗毒素制造及檢定規(guī)程》附錄6進行。
半成品配制與除菌配制將檢定合格的原液，按出品規(guī)格以注射用水準確稀釋，調(diào)整效價、蛋白質(zhì)濃度、pH值及氯化鈉含量。
除菌過濾按《除菌過濾崗位標準操作細則》(QB/WIBP JS 30003-2002)進行。
經(jīng)檢定，本發(fā)明方法制備的抗蝰蛇毒血清，符合《中國生物制品規(guī)程》(2000年版)對抗蛇毒血清的要求蛋白含量≤170g/L、pH 6.0-7.0、氯化鈉含量7.5-9.5g/L、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)2≥60％、中和效價≥500LD50/ml、類A型物質(zhì)≤4μg。
三、分包裝按《生物制品分裝規(guī)程》進行，規(guī)格為5000U/瓶。本品有液體及凍干兩種類型，凍干制品分裝后應(yīng)立即在-30℃以下進行冷凍，根據(jù)水含量調(diào)整干燥時間，干燥完畢后進行真空封口。
四、效價測定1.試驗動物體重為18-20g的小白鼠。
2.抗蝰蛇毒血清血清參考標準品由中國藥品生物制品檢定所制備及提供。
3.待檢定血清樣品的稀釋稀釋液硼酸鹽緩沖液，滅菌后pH應(yīng)為7.1；將待檢抗蛇毒血清稀釋成數(shù)個稀釋度，使每ml抗蝰蛇毒血清約含5U或其上下；各稀釋度間隔7.5％。
具體的稀釋方法

4.抗蝰蛇毒血清參考標準品的稀釋使每1ml含抗蝰蛇毒血清各5U，即與5個相應(yīng)蛇毒試驗量混合后每0.4ml注射量中含1U或2U。
5.蛇毒稀釋蛇毒試驗量指蛇毒稀釋后，與血清參考標準品混合，注射動物后表現(xiàn)出的結(jié)果，為50％受保護。
使其5個試驗量不超過0.8ml，在與抗蛇毒血清混合時補加稀釋液至2ml，即每0.4ml注射量中含1個試驗量。
6.混合待檢組量取不同稀釋度之抗蛇毒血清各1ml，分別裝于小試管中，每管加入5個試驗量與待檢抗蛇毒血清相應(yīng)的稀釋蛇毒液，補加稀釋液至2ml，混合均勻，封口。
對照組按下表量取已稀釋之標準抗蛇毒血清，分別裝入小試管中對照①②對照抗蝰蛇毒血清參考標準品(5U/ml) 1ml 1.2ml每管加入5個試驗量之相應(yīng)稀釋蛇毒液，補加稀釋液至2ml，混合均勻，封口。
將以上兩組，置水浴箱中于37℃結(jié)合45分鐘后立即注射小鼠。
7.注射每個稀釋度的待檢抗蛇毒血清，對照①及對照②各注射小鼠4只，每只腹腔注射0.4ml。
8.觀察試驗小鼠每日觀察一次，觀察48小時，并記錄發(fā)病及死亡情況。
9.結(jié)果判斷對照①小鼠死亡50％以上，對照②小鼠應(yīng)比對照①死亡晚或不死亡。
待檢血清之效價應(yīng)以與對照①小鼠同時死亡的最高稀釋度判定。
試驗小鼠死亡情況發(fā)生倒置或?qū)φ詹怀闪ⅲ瑧?yīng)重試。
經(jīng)檢驗，本產(chǎn)品效價為≥500U。
五、臨床試驗本產(chǎn)品在廣州醫(yī)學(xué)院協(xié)作進行了小量人體臨床療效考核，用于蝰蛇咬傷患者的治療。采用靜脈注射，也可做肌內(nèi)或皮下注射。
治療劑量注射量7500-U，1次注射，兒童與成人用量相同。以后視病情決定注射劑量與間隔時間。過敏試驗為陽性反應(yīng)者慎用。
使用中出現(xiàn)過敏反應(yīng)的處理
(1)過敏休克 可在注射中或注射后數(shù)分鐘至數(shù)十分鐘內(nèi)突然發(fā)生者突然表現(xiàn)沉郁或煩躁、臉色蒼白或潮紅、胸悶或氣喘、出冷汗、惡心或腹痛、脈搏細速、血壓下降，重者神志昏迷或虛脫，如不及時搶救可以迅速死亡。輕者注射腎上腺素后即可緩解；重者需輸液輸氧，使用升壓藥物維持血壓，并使用抗過敏藥物及腎上皮質(zhì)激素等進行搶救。
(2)血清病 主要癥狀為蕁麻疹、發(fā)熱淋巴結(jié)腫大、局部浮腫，偶有蛋白尿、嘔吐、關(guān)節(jié)痛，注射部位可出現(xiàn)紅斑、瘙癢及水腫。一般系在注射后7～14天發(fā)病，稱為延緩型。有在注射后2～4天發(fā)病，稱為加速型。對血清病應(yīng)進行對癥療法，可使用鈣劑或抗組織胺藥物，一般數(shù)日至十數(shù)日即可痊愈。
使用本發(fā)明藥物的注意事項本品有液體及凍干兩種類型。制品混濁，有搖不散的沉淀、異物或安瓿有裂紋，標簽不清，過期失效者均不可使用。安瓿打開后應(yīng)一次用完。凍干制品應(yīng)加標簽規(guī)定量滅菌注射用水，輕搖使完全溶解。每次注射須保存詳細記錄，包括姓名、性別、年齡、住址、注射次數(shù)、上次注射后的反應(yīng)情況、本次過敏試驗結(jié)果及注射后反應(yīng)情況、所用抗血清的生產(chǎn)單位名稱及批號等。使用抗血清須特別注意防止過敏反應(yīng)。注射前須詳細詢問既往過敏史，凡本人及其直系親屬曾有支氣管哮喘、枯草熱、濕疹或血管神經(jīng)性水腫等病史，或?qū)δ撤N物質(zhì)過敏，或本人過去曾注射過馬血清制劑者，均須特別提防過敏反應(yīng)的發(fā)生。注射前必須做過敏試驗。
過敏試驗 用氯化鈉注射液將抗血清稀釋20倍(0.1ml抗血清加1.9ml氯化鈉注射液)，在前臂掌側(cè)皮內(nèi)注射0.1ml，觀察30分鐘。注射部位無明顯反應(yīng)者，即為陰性，可在嚴密觀察下直接注射抗血清。如注射局部出現(xiàn)皮丘增大、紅腫、浸潤，特別是形似足或有癢感者，為陽性反應(yīng)，必須用脫敏法進行注射。如注射局部反應(yīng)特別嚴重或除局部反應(yīng)外并伴有全身癥狀，如蕁麻疹、鼻咽刺癢、噴嚏等，為強陽性反應(yīng)，則應(yīng)采用脫敏注射，并做好一切準備，一旦發(fā)生過敏休克，立即搶救。無過敏史或過敏反應(yīng)陰性者，也并非沒有發(fā)生過敏休克的可能。為慎重起見，可先注射小量于皮下進行試驗，觀察30分鐘，無異常反應(yīng)，再將全量注射于皮下或肌內(nèi)。
脫敏注射法 在一般情況下，可用氯化鈉注射液將抗血清稀釋10倍，分小量數(shù)次作皮下注射，每次注射后觀察20～30分鐘。第1次可注射1ml，觀察無紫紺、氣喘或顯著呼吸短促、脈搏加速時，即可注射第2次2ml，如注射量達到4ml仍無反應(yīng)，可緩慢地將全量注入。門診病人注射抗血清后，須觀察至少30分鐘方可離開。
結(jié)果共治療67例蝰蛇咬傷中毒患者，有效率為98.5％，治愈率達91％，在用血清治療過程中沒有出現(xiàn)不良反應(yīng)，證實抗蝰蛇毒血清用于治療蝰蛇咬傷是一種副作用小，而且安全的特效藥。
權(quán)利要求
1.一種抗蝰蛇毒血清，以園斑蝰蛇蛇毒為抗原，免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制備，其蛋白含量≤170g/l、pH 6.0-7.0、氯化鈉含量7.5-9.5g/l、三氯甲烷含量≤0.5％、F(ab)2≥60％、中和效價≥500LD50/ml、類A型物質(zhì)≤4μg。
2.一種抗蝰蛇毒血清的制備方法，包括如下步驟(1)制備免疫血漿以園斑蝰蛇毒作為免疫用抗原，選擇健康馬匹，進行基礎(chǔ)免疫、超免疫待血漿抗體效價超過100U/ml后采血，分離血漿；(2)精制提純消化將制得的免疫血漿2-4倍稀釋，調(diào)溫至29-31℃，調(diào)節(jié)pH至3.0-3.3之間，加入溶化胃酶，消化1-1.5小時；第一次沉淀及加熱處理上述消化液加濃度為18~22％(g/ml)硫酸銨，調(diào)pH至4.8-5.2，加溫至56~60℃，保溫20~40分鐘，降溫過濾分離，取清液，棄沉淀；鹽析上述清液調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4之間，每100ml加硫酸銨15~25g，取沉淀，棄清液；明礬沉淀上述沉淀稀釋至蛋白含量為1~3％(g/ml)，使沉淀溶解，在溫度為10~30℃下加入明礬溶液使最終含量為0.8-1.2％(g/ml)，調(diào)節(jié)pH至7.7-7.9，吸附05~1.5小時，過濾分離，取清液，棄沉淀；濃縮將上述清液用4.5~5.5萬分子量的濾膜超濾濃縮至原體積的5~15％時稀釋5-8倍使硫酸銨含量在0.1％(g/ml)以下；原液處理將上述濃縮液加入注射用水，調(diào)整固體總量不超過20％(g/ml)；加氯化鈉使最終含量為0.85-0.95％(g/ml)；加入氯仿使最終含量為1.4~0.6％(ml/ml)；調(diào)pH至6.0-7.0，得抗蝰蛇毒血清原液。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，以園斑蝰蛇取毒，新鮮毒液經(jīng)2000-2500轉(zhuǎn)離心處理10~20分鐘，取上清凍干，用福爾馬林處理減毒，獲得免疫用抗原。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于治療蝰蛇咬傷的生物藥品及其制備方法，它是由園斑蝰蛇蛇毒免疫馬匹獲得免疫血漿，經(jīng)胃酶消化后用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑，具有特異性中和蝰蛇毒素的作用；本發(fā)明的抗蝰蛇毒血清效價高，每毫升血清可中和蝰蛇毒500LD
文檔編號A61K39/395GK1947727SQ20051003039
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年10月11日
發(fā)明者蔣克賢, 范志和, 季沖, 李景玉, 張志平 申請人:上海賽倫生物技術(shù)有限公司