本發(fā)明屬于腫瘤學以及細胞培養(yǎng)領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種具有高成瘤能力的人肝內膽管癌細胞系及其應用。

背景技術：

肝內膽管癌(intrahepaticcholangiocarcinoma，icc)是指左右肝管匯合部以上的膽管上皮細胞起源的惡性腫瘤，其惡性程度高、癥狀隱匿，預后差。近年來icc的發(fā)病率和死亡率逐漸升高，其主要的危險因素包括肝內膽管結石、病毒性肝炎、膽管炎和寄生蟲感染等。外科手術切除目前仍是治療icc的最主要手段，但因早期診斷困難，僅10％患者可行根治性切除術，大多數(shù)患者確診時已達晚期而無法手術。icc的輔助化療主要分為靜脈全身化療和經動脈化學藥物栓塞術(tace)兩種方式，全身靜脈化療的藥物主要包括5-氟尿嘧啶(5-fu)和吉西他濱，而tace最常用的是吉西他濱與順鉑聯(lián)合治療。但icc患者化療的療效不佳，且尚無靶向治療藥物可用。因此，篩選和鑒定icc的有效治療靶點、研發(fā)新型靶向治療藥物并在體內外驗證其效果是提高icc療效的關鍵，具有重要的臨床價值和社會意義。

肝內膽管癌細胞系作為重要的研究工具，在icc的基礎研究和臨床轉化性應用中發(fā)揮著獨特的作用。采用細胞系進行體外實驗及體內動物模型的構建，不僅能從分子、基因水平深入研究腫瘤發(fā)生和發(fā)展機理，還能在體內水平對基因功能、藥物篩選和腫瘤治療等進行研究。尤其是體內荷瘤動物模型，在新藥研發(fā)和藥物療效驗證中是必不可少的。腫瘤細胞在生長過程中會出現(xiàn)不同的分子生物學或基因方面的改變，進而具有不同的生長速度、侵襲能力、對藥物的敏感性及預后，這就是腫瘤的異質性。腫瘤的異質性是惡性腫瘤的特征之一，也是出現(xiàn)化療藥物耐受的主要原因。如能在不同來源、具有不同基因背景的腫瘤細胞系中開展藥物研發(fā)，將大大縮短研究周期，加速肝抗腫瘤藥物的上市。

但是，獲得具有高成瘤能力且適用于作為腫瘤細胞模型的肝內膽管癌細胞系是較為困難的，大多分離自腫瘤組織的細胞不適合于體外培養(yǎng)，建系不理想，或者成瘤能力很差，難以作為腫瘤細胞模型。目前，美國atcc收錄的商用肝內膽管癌細胞系僅有數(shù)株，中國國內建立的肝內膽管癌細胞系更加寥寥無幾，且其成瘤率均較低，不利于開展體內實驗。

因此，為了更加深入地理解icc各種細胞的多樣性及其對治療藥物的反應性，從而指導臨床的系統(tǒng)治療，建立更多的icc細胞系、尤其是具有高成瘤率的細胞系是當務之急。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有高成瘤能力的人肝內膽管癌細胞系及其應用。

在本發(fā)明的第一方面，提供一種人肝內膽管癌細胞，所述細胞在中國典型培養(yǎng)物保藏中心的保藏號為cctccno:c2015148。

在一個優(yōu)選例中，所述的人肝內膽管癌細胞分離自肝內膽管癌患者的原位癌組織。

在另一優(yōu)選例中，所述的人肝內膽管癌細胞的用途，用于作為細胞模型或建立動物模型，研究人肝內膽管癌的發(fā)病機制。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人肝內膽管癌細胞的用途，用于作為細胞模型或建立動物模型，研究人肝內膽管癌的疾病進展機制。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人肝內膽管癌細胞的用途，用于作為細胞模型或建立動物模型，研究人肝內膽管癌耐藥機制。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人肝內膽管癌細胞的用途，用于作為細胞模型或建立動物模型，篩選預防、緩解或治療人肝內膽管癌的藥物。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人肝內膽管癌細胞的用途，用于篩選 人肝內膽管癌的生物標志物；較佳地，所述的篩選步驟不涉及疾病診斷或治療的方法。

在本發(fā)明的另一方面，提供所述的人肝內膽管癌細胞的用途，用于構建人肝內膽管癌動物模型；或用于制備構建人肝內膽管癌動物模型的細胞試劑。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于研究分析人肝內膽管癌或用于建立人肝內膽管癌動物模型的試劑盒，所述的試劑盒中包括容器，以及裝于容器中的所述的人肝內膽管癌細胞。

在一個優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還包括：細胞培養(yǎng)基。

本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。

附圖說明

圖1為ihc-st1的12代細胞于光學顯微鏡下觀察(100×)，細胞均呈貼壁生長，細胞形態(tài)不規(guī)則，失去接觸抑制，異質性明顯，部分細胞排列呈腺管樣結構。

圖2為ihc-st1細胞生長曲線。

圖3為ihc-st1細胞核型分析圖。

圖4為ihc-st1細胞裸鼠荷瘤圖片；

a為移植ihc-st1細胞30天后，荷瘤裸鼠的照片；

b為移植ihc-st1細胞30天后，裸鼠體內獲取的腫瘤。

圖5左圖為腫瘤患者原位腫瘤組織的he染色分析；

圖5右圖為ihc-st1細胞移植裸鼠后，裸鼠皮下荷瘤組織的he染色分析。

圖6左列圖為腫瘤患者原位腫瘤組織中一些腫瘤標志物的免疫組化分析；

圖6右列圖為ihc-st1細胞移植裸鼠后，裸鼠皮下荷瘤組織中一些腫瘤標志物的免疫組化分析。

具體實施方式

本發(fā)明人經過廣泛的研究篩選，首次揭示一種新的、高成瘤能力人肝內膽管癌細胞系ihc-st1，其保藏號為cctccc2015148。該細胞系通過應用原代腫瘤細胞分離、培養(yǎng)技術建立，能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代，具有生長穩(wěn)定，代數(shù)明確，成瘤率高的優(yōu)點。

如本文所用，“人肝內膽管癌細胞(系)ihc-st1”、“ihc-st1細胞(系)”可互換使用，均指保藏號為cctccc2015148的細胞(系)。

ihc-st1細胞的獲得

本發(fā)明的ihc-st1細胞來自于一位女性肝內膽管癌患者的肝原位腫瘤組織。通過如下方法獲得：將切除的腫瘤組織放入d-hanks液中沖洗(含青霉素，兩性霉素b)，剔除血污及壞死組織。隨后將組織放入無血清的dmem/f12培養(yǎng)基中，以眼科剪剪成小塊，并加入i型膠原酶，37℃消化30min。加入胎牛血清終止消化，將組織塊隨同浸泡液過200目細胞篩過濾，濾出液轉移至離心管中，1000轉/分，離心5min。棄上清，以含有10％胎牛血清的dmem/f12完全培養(yǎng)基懸浮細胞，并接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。觀察并及時更換培養(yǎng)液，待有單細胞克隆長出后，獲取純種的腫瘤細胞。

ihc-st1細胞的體外培養(yǎng)及傳代

本發(fā)明獲得的ihc-st1細胞，其可以實現(xiàn)體外長期生長和穩(wěn)定傳代。一般地，可以以dmem/f12完全培養(yǎng)基來進行培養(yǎng)。當然，本發(fā)明的ihc-st1細胞也可以以其它的類似培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，各種可以預期能用于培養(yǎng)該細胞的方法均應被包含在本發(fā)明中。

當ihc-st1細胞培養(yǎng)至具有80％以上或85％以上匯合度的時候，可以進行細胞傳代。各種可以預期能用于實現(xiàn)ihc-st1細胞的傳代的方法均應被包含在本發(fā)明中。

基本本發(fā)明人的新發(fā)現(xiàn)，當獲得了本發(fā)明的細胞之后，本領域技術人員可以根據本發(fā)明的揭示，結合現(xiàn)有技術中的腫瘤細胞培養(yǎng)或傳代方法來進行ihc-st1細胞的培養(yǎng)及傳代，這些均應被包含在本發(fā)明的范圍內。

ihc-st1細胞的特征

本發(fā)明提供的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1，能在體外長期生長和穩(wěn)定傳代，呈上皮樣，失去接觸抑制。

ihc-st1細胞的染色體為異倍體，染色體數(shù)目主要集中在55-70。

以5×10⁶的ihc-st1細胞接種于裸鼠皮下，成瘤率為100％。

免疫組化分析顯示，ihc-st1細胞移植動物皮下后獲得的荷瘤組織與腫瘤患者原位腫瘤組織中，腫瘤細胞均呈腺管樣排列，ck18、ck19染色呈陽性，afp、hep-1、ck7染色呈陰性，因此ihc-st1細胞系很好地保持了原代腫瘤細胞的特征。

ihc-st1細胞的應用

本發(fā)明的ihc-st1細胞可用于研究人肝內膽管癌的發(fā)生發(fā)展機制，包括早期效應、分子信號通路、疾病進展機制等。

本發(fā)明提供的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1，可用作細胞模型，或應用于構建動物模型。

在獲得本發(fā)明的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1后，本領域技術人員可以根據現(xiàn)有的技術，來構建動物模型。所述的動物一般是哺乳動物，例如可以是但不限于鼠、兔、猴等等。例如，一種較為常見的構建動物模型的方法是在動物的皮下移植腫瘤細胞系。

本發(fā)明的ihc-st1細胞可應用于分析腫瘤細胞的生長特性、侵襲轉移、耐藥等相關惡性生物學行為和分子機制。

本發(fā)明為肝內膽管癌的臨床預測、診斷及治療提供有效且穩(wěn)定的細胞模型。

與現(xiàn)有建系的肝內膽管癌細胞相比，本發(fā)明細胞系用作細胞模型，具有以下優(yōu)勢：

1)來自于人體，良好地保持了原代腫瘤細胞的特征；

2)成瘤率高，達到100％；

2)培養(yǎng)方便，能長期生長和傳代，適合大規(guī)模培養(yǎng)，可以滿足高通量檢測的需要。

本發(fā)明還提供了一種用于研究分析人肝內膽管癌或用于建立人肝內膽管癌動物模型的試劑盒，所述的試劑盒中包括容器，以及裝于容器中的本發(fā)明所述的ihc-st1細胞。

根據需要，所述的試劑盒中還可包括：培養(yǎng)所述的ihc-st1細胞的細胞培養(yǎng)基。

此外，所述的試劑盒中還可包括：使用說明書；其中記載有本發(fā)明的ihc-st1的培養(yǎng)方法或傳代方法；或者其中記載有使用本發(fā)明的ihc-st1細胞制備動物模型的方法。

下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1、人肝內膽管癌細胞系ihc-st1的獲得與觀察

1、原代培養(yǎng)

本發(fā)明的ihc-st1細胞來自于一位女性肝內膽管癌患者的肝原位腫瘤組織。無菌條件下，取行肝內膽管癌根治術女性患者的肝原位腫瘤組織，放入d-hanks液中沖洗(含1000單位/ml青霉素，3μg/ml兩性霉素b)，剔除血污及壞死組織。隨后將組織放入無血清的dmem/f12培養(yǎng)基中，以眼科剪剪成1-3mm³的小塊，并加入0.5mg/ml的i型膠原酶，37℃消化30min。加入胎牛血清終止消化，將組織塊隨同浸泡液過200目細胞篩過濾，濾出液轉移至 離心管中，1000轉/分，離心5min。棄上清，以含有10％(v/v)胎牛血清的dmem/f12完全培養(yǎng)基懸浮細胞，并接種到鋪有鼠尾膠原的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。觀察并及時更換培養(yǎng)液，待有單細胞克隆長出后，獲取純種的腫瘤細胞進行擴大培養(yǎng)。

2、傳代

當細胞有85％以上匯合度的時候，進行細胞傳代。在超凈工作臺內，于無菌條件下，吸除培養(yǎng)瓶內培養(yǎng)液。用少量d-hanks液清洗培養(yǎng)皿2次后，加入0.25％胰酶1ml，置37℃，5％co2，95％濕度的co2培養(yǎng)箱中4-5min。待鏡下觀察大部分細胞的細胞質回縮、細胞間隙增大時(甚至看到有個別細胞漂浮起來)，加入dmem/f12完全培養(yǎng)基4ml中和，反復吹打貼壁的細胞，形成單細胞懸液，收集至離心管中，室溫下1000rpm離心5min，收集培養(yǎng)細胞。棄上清，加入dmem/f12完全培養(yǎng)基重懸細胞，接種入培養(yǎng)皿。

3、凍存與復蘇

凍存：消化、離心細胞的方法如前述2中所述。離心后的細胞沉淀用1.5ml凍存液懸浮，計數(shù)，調整至5×10⁶/ml。移入凍存管，將凍存管口封嚴。凍存管置于-80℃12h以上，次日移入液氮。

復蘇：從液氮中取出凍存管、迅速置于37℃溫水中。待凍存管中的凍存物融化成液體后，將細胞懸液吸至離心管中，1000rpm離心5min，棄去上清液。沉淀加5mldmem/f12完全培養(yǎng)基，吹打均勻至單細胞懸液，轉移至培養(yǎng)皿中，置37℃，5％co2，95％濕度的co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4、細胞形態(tài)學觀察

倒置顯微鏡鏡下觀察第12代(100×)細胞，如圖1，可見ihc-st1細胞均呈貼壁生長，細胞形態(tài)不規(guī)則，失去接觸抑制，異質性明顯，部分細胞排列呈腺管樣結構。

實施例2、本發(fā)明的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1的生長曲線

取生長狀態(tài)良好的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1細胞，消化，制成單細 胞懸液，并計數(shù)。將細胞接種到96孔板中，每孔3000個細胞。分別在細胞接種后的第12h、24h、48h、72h進行cck-8檢測，計算細胞數(shù)量的平均數(shù)和標準差，繪制細胞生長曲線。

獲得的生長曲線如圖2。從圖中可見，細胞在第1-3天呈對數(shù)生長，到第3天后達到平臺期，倍增時間為24h。

實施例3、本發(fā)明的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1的核型分析

取處于指數(shù)生長期、80％-90％融合單層培養(yǎng)的細胞。加秋水仙素阻抑中期分裂，使其在培養(yǎng)基中最終濃度為0.04-0.1μg/ml培養(yǎng)基，co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4小時。

經過固定染色后，對30個處于分裂中期的細胞染色體進行計數(shù)，ihc-st1細胞系染色體數(shù)目主要集中在55-70，染色體眾數(shù)為62，提示存在超二倍體的情況，代表性圖片見圖3。

實施例4、本發(fā)明的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1的裸鼠荷瘤圖片

選取4-6周齡、雄性裸鼠10只，取生長狀態(tài)良好的ihc-st1細胞，皮下接種于裸鼠的右側腋下和臀側，每個位點接種5×10⁶個細胞。

接種小鼠的一月后觀察成瘤情況，發(fā)現(xiàn)20個被接種的裸鼠均有腫瘤長出，成瘤率為100％，代表性圖片如圖4a～b。

上述結果表明，本發(fā)明的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1具有很強的成瘤能力，適合于用作臨床腫瘤細胞模型。

實施例5、ihc-st1細胞對應的腫瘤組織he染色圖

按照第二軍醫(yī)大學倫理委員會的規(guī)定，經患者知情同意后，取ihc-st1細胞對應的腫瘤患者原位腫瘤組織和裸鼠荷瘤腫瘤標本，以福爾馬林液固定，石蠟包埋，制作常規(guī)4μm石蠟切片，并對切片進行h&e染色。

h&e染色方法如下：

1)臟器組織石蠟切片脫蠟至水；

2)蘇木精液染色5min，水洗；

3)1％鹽酸乙醇1-3s，水洗；

4)0.5％伊紅液染色1min，水洗；

5)脫水封片。

結果顯示，腫瘤患者原位腫瘤組織中細胞呈上皮樣并排列成腺管樣結構，如圖5左圖；ihc-st1細胞裸鼠皮下荷瘤組織中細胞與圖4a中極為相似，細胞核大而異質性明顯，排列成大量的腺管樣結構，如圖5右圖。

上述結果表明，ihc-st1細胞系很好地保持了原代腫瘤細胞的形態(tài)和組織結構。

實施例6、ihc-st1細胞對應的腫瘤組織免疫組化圖

取ihc-st1細胞對應的腫瘤患者原位腫瘤組織和裸鼠荷瘤腫瘤標本，以福爾馬林液固定，石蠟包埋，制作常規(guī)4μm石蠟切片，并進行ck7、ck18、ck19、afp和hep-1免疫組化染色，觀察這些腫瘤標志物的表達情況。

染色方法如下：

1)腫瘤組織石蠟切片脫蠟至水；

2)3％h2o2室溫10min，水洗；

3)抗原修復；

4)山羊血清封閉30min；

5)滴加ck7、ck18、ck19、afp或hep-1抗體(1:100，購自cellsignalingtechnology公司)，4℃過夜；

6)滴加辣根過氧化物酶標記的二抗(購自上海長島生物公司)，37℃下進行30min；

7)dab(購自dako公司)顯色；

8)蘇木素復染，鹽酸酒精分化；

9)脫水封片。

結果顯示，腫瘤患者原位腫瘤組織膽系標志物ck18、ck19呈陽性，肝系標志物ck7、hep-1及肝細胞癌標志afp均呈陰性，如圖6左列圖；ihc-st1 細胞裸鼠皮下荷瘤組織亦呈現(xiàn)ck18、ck19陽性，ck7、hep-1和afp陰性，如圖6右列圖。

上述結果表明，ihc-st1細胞系很好地保持了原代腫瘤細胞的細胞學特性。

生物材料保藏

本發(fā)明建立的具有高成瘤能力的人肝內膽管癌細胞系ihc-st1，已經保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(中國，武漢)，其保藏號為cctccc2015148，保藏日2015年9月22日。

在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。