本發(fā)明涉及人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，mscs)是指存在于新生兒臍帶組織中的一種多功能干細(xì)胞。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有自我復(fù)制能力和多向分化潛能，并有造血支持和促進干細(xì)胞植入、免疫調(diào)節(jié)能力；其多向分化潛能表現(xiàn)為，在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、神經(jīng)、肌肉、肝臟、內(nèi)皮等多種組織和細(xì)胞，它在骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、內(nèi)皮和心肌等組織工程方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞存在于臍帶華通膠(wharton’sjelly)和血管周圍組織中，其特點主要是來源廣泛，便于取材，在體外易于分離擴增。目前，分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞方法主要分為組織塊貼壁培養(yǎng)法和膠原酶消化法。其中，組織塊貼壁培養(yǎng)法通常是先去除血管后，一種是使用齒直鑷撕下華通膠，但該操作費時費力，同時操作時間長也易造成細(xì)菌污染；另一種是直接將臍帶剪碎后貼壁培養(yǎng)，但這會增加臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞混有其他種類細(xì)胞的風(fēng)險。因此，建立一種簡單實用、便于操作、可行的分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，是非常必要的。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于：包括3個部分：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存，所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離的步驟如下：
s1、將臍帶組織置于無菌采集瓶中,低溫保存；
s2、取出臍帶，放入培養(yǎng)皿中，剪成約2cm若干小段；
s3、去除臍帶中的血管(一根靜脈、二根動脈)；
s4、將剝離血管的臍帶用生理鹽水沖洗4-5次；
s5、將臍帶華通膠的一面小心地放置在瓶子底部；
s6、在培養(yǎng)瓶中緩慢滴加適量培養(yǎng)基；
s7、放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，水平靜置培養(yǎng)至第7-10天后，待細(xì)胞爬出，進行傳代培養(yǎng)。
優(yōu)選的，所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)的步驟如下：
s1、待細(xì)胞爬出，小心地棄去舊培養(yǎng)基和組織塊；
s2、加胰酶消化，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s3、根據(jù)細(xì)胞數(shù)鋪瓶，使細(xì)胞濃度為104cells/cm2，標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
優(yōu)選的，所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存的步驟如下：
s1、待細(xì)胞融合至80％-90％，用吸管棄去舊培養(yǎng)基；
s2、加胰酶消化，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s3、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適量的凍存液使細(xì)胞密度為(2～5)×106/ml；
s4、將細(xì)胞分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，凍存管置于程序降溫盒中，放置-80℃冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
作為優(yōu)選，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離的步驟s5所述的培養(yǎng)瓶采用一次性75cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)瓶過火后，以4-6塊/瓶的密度，將臍帶華通膠的一面小心地貼在瓶子底部。
作為優(yōu)選，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離的步驟s6所述的培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶3/4處，培養(yǎng)基太多不利于細(xì)胞的爬出。
本發(fā)明提供提供一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括3個部分：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存，具體采用的操作是：將臍帶去除血管后，直接剪至3-4cm2大?。蝗缓髮⑷A通膠的一面貼于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，靜止培養(yǎng)直至干細(xì)胞爬出；最后，將細(xì)胞進行傳代和凍存等操作。本發(fā)明提供的一種改良的組織塊貼壁法，相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：本方法省去了撕取華通膠以及剪碎等最為繁瑣的過程，明顯縮短了操作時間，同時也避免了混有其他種類細(xì)胞的風(fēng)險，操作上比傳統(tǒng)方法更簡便。
具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明，本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍不限于下述的實施例。
實施例1
一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其步驟如下：
(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離
s1、將臨床檢測合格的臍帶組織放置于含50ml培養(yǎng)基的無菌采集瓶中，使用保溫箱低溫保存，送至無菌實驗室；
s2、將放有臍帶的采集瓶置于超凈臺內(nèi)，取出臍帶，放入培養(yǎng)皿中，剪成約2cm若干小段；
s3、用手術(shù)剪將臍帶沿靜脈血管平行方向縱向剖開，去除靜脈血管后，再使用齒直鑷撕下兩條動脈；
s4、將剝離血管的臍帶用生理鹽水沖洗4-5次；
s5、一次性75cm2培養(yǎng)瓶過火后，以4-6塊/瓶的密度，將臍帶華通膠的一面小心地貼在瓶子底部；
s6、臍帶放置好后，在培養(yǎng)瓶中緩慢滴加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶1/2處；
s7、蓋上瓶蓋，做好標(biāo)記放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，水平放置；
s8、培養(yǎng)至第7-10天后，待細(xì)胞爬出，進行傳代培養(yǎng)。
(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
s1、待細(xì)胞爬出，棄去舊培養(yǎng)基和組織塊；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清，10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)；
s6、根據(jù)細(xì)胞數(shù)鋪瓶，使細(xì)胞濃度為104cells/cm2，標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
s1、待細(xì)胞融合至80％-90％，用吸管棄去舊培養(yǎng)基；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清；
s6、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適量的凍存液(90％fbs+10％dmso)，使細(xì)胞密度為(2～5)×106/ml；
s7、將細(xì)胞分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
實施例2
一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其步驟如下：
(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離
s1、將臨床檢測合格的臍帶組織放置于含50ml培養(yǎng)基的無菌采集瓶中，使用保溫箱低溫保存，送至無菌實驗室；
s2、將放有臍帶的采集瓶置于超凈臺內(nèi)，取出臍帶，放入培養(yǎng)皿中，剪成約2cm若干小段；
s3、用手術(shù)剪將臍帶沿靜脈血管平行方向縱向剖開，去除靜脈血管后，再使用齒直鑷撕下兩條動脈；
s4、將剝離血管的臍帶用生理鹽水沖洗4-5次；
s5、一次性75cm2培養(yǎng)瓶過火后，以4-6塊/瓶的密度，將臍帶華通膠的一面小心地貼在瓶子底部；
s6、臍帶放置好后，在培養(yǎng)瓶中緩慢滴加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶2/3處；
s7、蓋上瓶蓋，做好標(biāo)記放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，水平放置；
s8、培養(yǎng)至第7-10天后，待細(xì)胞爬出，進行傳代培養(yǎng)。
(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
s1、待細(xì)胞爬出，棄去舊培養(yǎng)基和組織塊；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清，10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)；
s6、根據(jù)細(xì)胞數(shù)鋪瓶，使細(xì)胞濃度為104cells/cm2，標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
s1、待細(xì)胞融合至80％-90％，用吸管棄去舊培養(yǎng)基；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清；
s6、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適量的凍存液(90％fbs+10％dmso)，使細(xì)胞密度為(2～5)×106/ml；
s7、將細(xì)胞分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
實施例3
一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其步驟如下：
(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離
s1、將臨床檢測合格的臍帶組織放置于含50ml培養(yǎng)基的無菌采集瓶中，使用保溫箱低溫保存，送至無菌實驗室；
s2、將放有臍帶的采集瓶置于超凈臺內(nèi)，取出臍帶，放入培養(yǎng)皿中，剪成約2cm若干小段；
s3、用手術(shù)剪將臍帶沿靜脈血管平行方向縱向剖開，去除靜脈血管后，再使用齒直鑷撕下兩條動脈；
s4、將剝離血管的臍帶用生理鹽水沖洗4-5次；
s5、一次性75cm2培養(yǎng)瓶過火后，以4-6塊/瓶的密度，將臍帶華通膠的一面小心地貼在瓶子底部；
s6、臍帶放置好后，在培養(yǎng)瓶中緩慢滴加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶3/4處；
s7、蓋上瓶蓋，做好標(biāo)記放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，水平放置；
s8、培養(yǎng)至第7-10天后，待細(xì)胞爬出，進行傳代培養(yǎng)。
(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
s1、待細(xì)胞爬出，棄去舊培養(yǎng)基和組織塊；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清，10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)；
s6、根據(jù)細(xì)胞數(shù)鋪瓶，使細(xì)胞濃度為104cells/cm2，標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
s1、待細(xì)胞融合至80％-90％，用吸管棄去舊培養(yǎng)基；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清；
s6、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適量的凍存液(90％fbs+10％dmso)，使細(xì)胞密度為(2～5)×106/ml；
s7、將細(xì)胞分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
實施例4
一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其步驟如下：
(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離
s1、將臨床檢測合格的臍帶組織放置于含50ml培養(yǎng)基的無菌采集瓶中，使用保溫箱低溫保存，送至無菌實驗室；
s2、將放有臍帶的采集瓶置于超凈臺內(nèi)，取出臍帶，放入培養(yǎng)皿中，剪成約2cm若干小段；
s3、用手術(shù)剪將臍帶沿靜脈血管平行方向縱向剖開，去除靜脈血管后，再使用齒直鑷撕下兩條動脈；
s4、將剝離血管的臍帶用生理鹽水沖洗4-5次；
s5、一次性75cm2培養(yǎng)瓶過火后，以4-6塊/瓶的密度，將臍帶華通膠的一面小心地貼在瓶子底部；
s6、臍帶放置好后，在培養(yǎng)瓶中緩慢滴加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶4/5處；
s7、蓋上瓶蓋，做好標(biāo)記放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，水平放置；
s8、培養(yǎng)至第7-10天后，待細(xì)胞爬出，進行傳代培養(yǎng)。
(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
s1、待細(xì)胞爬出，棄去舊培養(yǎng)基和組織塊；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清，10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)；
s6、根據(jù)細(xì)胞數(shù)鋪瓶，使細(xì)胞濃度為104cells/cm2，標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
s1、待細(xì)胞融合至80％-90％，用吸管棄去舊培養(yǎng)基；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清；
s6、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適量的凍存液(90％fbs+10％dmso)，使細(xì)胞密度為(2～5)×106/ml；
s7、將細(xì)胞分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
實施例5
一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其步驟如下：
(1)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離
s1、將臨床檢測合格的臍帶組織放置于含50ml培養(yǎng)基的無菌采集瓶中，使用保溫箱低溫保存，送至無菌實驗室；
s2、將放有臍帶的采集瓶置于超凈臺內(nèi)，取出臍帶，放入培養(yǎng)皿中，剪成約2cm若干小段；
s3、用手術(shù)剪將臍帶沿靜脈血管平行方向縱向剖開，去除靜脈血管后，再使用齒直鑷撕下兩條動脈；
s4、將剝離血管的臍帶用生理鹽水沖洗4-5次；
s5、一次性75cm2培養(yǎng)瓶過火后，以4-6塊/瓶的密度，將臍帶華通膠的一面小心地貼在瓶子底部；
s6、臍帶放置好后，在培養(yǎng)瓶中緩慢滴加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶5/6處；
s7、蓋上瓶蓋，做好標(biāo)記放入二氧化碳培養(yǎng)箱中，水平放置；
s8、培養(yǎng)至第7-10天后，待細(xì)胞爬出，進行傳代培養(yǎng)。
(2)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)
s1、待細(xì)胞爬出，棄去舊培養(yǎng)基和組織塊；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清，10ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，計數(shù)；
s6、根據(jù)細(xì)胞數(shù)鋪瓶，使細(xì)胞濃度為104cells/cm2，標(biāo)記，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
(3)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存
s1、待細(xì)胞融合至80％-90％，用吸管棄去舊培養(yǎng)基；
s2、在非細(xì)胞培養(yǎng)面加入10ml生理鹽水，輕輕搖晃洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
s3、每瓶加胰酶1-2ml，均勻浸潤貼壁面，約1min，待細(xì)胞變圓后加終止液；
s4、快速震蕩洗滌后倒入50ml離心管中，再用生理鹽水吹洗一次，收集于50ml離心管中；
s5、將50ml離心管1000rpm，5min，棄上清；
s6、根據(jù)計數(shù)結(jié)果，加入適量的凍存液(90％fbs+10％dmso)，使細(xì)胞密度為(2～5)×106/ml；
s7、將細(xì)胞分裝到凍存管中，做好標(biāo)記，置于程序降溫盒中，-80℃冰箱中過夜，再轉(zhuǎn)入液氮罐中。
綜上所述，本發(fā)明提供一種改良組織塊法從人臍帶分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，包括3個部分：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的原代分離、人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的傳代培養(yǎng)和人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存，具體采用的操作是：將臍帶去除血管后，直接剪至3-4cm2大??；然后將華通膠的一面貼于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部，靜止培養(yǎng)直至干細(xì)胞爬出；最后，將細(xì)胞進行傳代和凍存等操作，此外，培養(yǎng)基使用量以剛好沒過臍帶5/6處，培養(yǎng)基太多不利于細(xì)胞的爬出。本發(fā)明提供的一種改良的組織塊貼壁法，相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點：本方法省去了撕取華通膠以及剪碎等最為繁瑣的過程，明顯縮短了操作時間，同時也避免了混有其他種類細(xì)胞的風(fēng)險，操作上比傳統(tǒng)方法更簡便。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。